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1、專題能力訓練十六　基因工程 1.(2018天津理綜)甲型流感病毒為RNA病毒,易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法,主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主細胞內(nèi)增殖的能力。以病毒RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成對應(yīng)DNA后,利用　　　技術(shù)擴增,并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比,改造后的基因表達時不能合成完整長度的　　　　,因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒,并保存。? (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。設(shè)計合成一種特

2、殊tRNA的基因,其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結(jié)合,并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與　　　　連接后導(dǎo)入宿主細胞。提取宿主細胞的　　　　　　　進行分子雜交鑒定,篩選獲得成功表達上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。? (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細胞,并在補加　　　　　　　的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA,翻譯出改造病毒基因的完整蛋白,產(chǎn)生大量子代病毒,用于制備疫苗。? 特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時,識別其啟動子的酶是　　　(單選)。? A.病毒的DNA聚合酶 B.宿主的DNA聚合酶 C.病毒的RN

3、A聚合酶 D.宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖,沒有致病性,因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比,該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起　　　　免疫,增強免疫保護效果。? 答案:(1)PCR　多肽(或蛋白質(zhì))　(2)載體　總RNA　(3)非天然氨基酸(Uaa)　D　(4)細胞 解析:(1)利用逆轉(zhuǎn)錄得到病毒DNA后,可利用PCR技術(shù)對該DNA進行擴增。據(jù)題意,改造后的某些基因在表達時會提前終止,不能合成改造前完整長度的多肽或蛋白質(zhì)。(2)導(dǎo)入宿主細胞的是攜帶目的基因的載體,故需將該特殊基因與載體連接。該特殊基因的表達產(chǎn)物是攜帶Uaa的

4、tRNA,故檢測該基因是否表達時可提取宿主細胞的總RNA進行分子雜交。(3)(1)中改造基因表達時,因終止密碼子提前出現(xiàn),無法合成子代病毒的蛋白質(zhì)而不能產(chǎn)生子代病毒。經(jīng)過(2)改造的宿主細胞,在基因表達遇到終止密碼子時,因有特殊的攜帶Uaa的tRNA與之結(jié)合,故可繼續(xù)完成翻譯表達出完整蛋白,可產(chǎn)生子代病毒用于制備疫苗。與正常培養(yǎng)基相比,(3)中所用培養(yǎng)基需補加Uaa。特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄形成RNA,所需的酶是宿主細胞的RNA聚合酶。(4)因正常宿主細胞不含特殊tRNA基因,也無Uaa,故子代病毒侵入正常細胞后,無法合成病毒蛋白質(zhì),不能表現(xiàn)出致病性。該病毒與不具侵染性的流感疫苗相比,因其還可侵入

5、體細胞,故除引起體液免疫外,還可引起細胞免疫。 2.紫薯富含花青素,有清除體內(nèi)自由基、抗癌、預(yù)防衰老等保健功效。研究人員通過現(xiàn)代分子技術(shù)手段,克隆了控制紫薯的著色基因BL?；卮鹣铝袉栴}。 (1)獲取基因BL的方法之一是利用PCR技術(shù)擴增大量的DNA。此方法使用的DNA聚合酶與生物體內(nèi)的DNA聚合酶相比,最主要的特點是　　　　　　。PCR技術(shù)能把某一DNA片段進行擴增,依據(jù)的原理是　　　　　　　　　　　　。? (2)PCR過程中復(fù)性溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設(shè)定。下表為根據(jù)模板設(shè)計的兩對引物序列,右上圖為引物與模板結(jié)合的示意圖?？刹捎幂^高的復(fù)性溫度的是　　　　　　,理由是　　　　　

6、　　　　　　　。? 引物對A P1　AACTGAAATGTAGCTATC P2　TTAAGTCCATTACTCTAC 引物對B S1　GTCCGACTAGTGGCTGTG S2　AGCTGGCGTTTAGCCTCG (3)若想將著色基因?qū)肓硪恢参镏蝎@得紅色果實,可將獲取的BL基因插入Ti質(zhì)粒的　　　　　　　　上,通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用將目的基因?qū)胫参锏捏w細胞,獲得能穩(wěn)定遺傳和表達的轉(zhuǎn)基因植株。該過程的依據(jù)是　　　　　　　　　　　　　　。? (4)若要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,需從轉(zhuǎn)基因植株中提取mRNA,用　　　　　　　　　　　作探針與mRNA雜交。若　　

7、　　　　　　　,則表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。? 答案:(1)耐高溫　DNA雙鏈復(fù)制　(2)引物對B　引物對B中G/C含量較高　(3)T-DNA　T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上　(4)標記的目的基因　出現(xiàn)雜交帶 解析:(1)PCR技術(shù)使用的是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)。PCR技術(shù)能把某一DNA片段進行擴增,依據(jù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制。(2)引物對B中G/C含量較高,可采用較高的復(fù)性溫度。(3)將獲取的目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上,T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上。(4)若要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,需從轉(zhuǎn)基因植株中

8、提取mRNA,用標記的目的基因作探針與mRNA雜交。若出現(xiàn)雜交帶,則表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。 3.下圖為利用生物技術(shù)獲得生物新品種的過程,據(jù)圖回答下列問題。 (1)在基因工程中,A表示目的基因的獲取,通過PCR技術(shù)可大量產(chǎn)生目的基因,PCR技術(shù)的原理是　　　　　　　　　　　　　　;B表示構(gòu)建的基因表達載體,其組成除了目的基因外,還必須有啟動子、終止子以及　　　　　　　　　　　　　　　等,其中啟動子是　　　　　　　　　　　　酶識別和結(jié)合的部位。? (2)B→C為轉(zhuǎn)基因綿羊的培育過程,其中②過程常用的方法是　　　　　　　　　　　,使用的綿羊受體細胞為　　　　　　　　,④用到的生物技

9、術(shù)主要有動物細胞培養(yǎng)和　　　　　　　　　　　。 (3)B→D為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程,其中③過程常用的方法是　　　　　　　　　　　　　,⑤過程的原理是　　　　　　　　　　　　　　　。要確定目的基因(抗蟲基因)導(dǎo)入受體細胞后,在棉花細胞中是否成功表達,從分子水平上鑒定可以采用的方法是　　　　　　　　　　　　　　。? 答案:(1)DNA(雙鏈)復(fù)制　標記基因　RNA聚合 (2)顯微注射法　受精卵　早期胚胎培養(yǎng)(或胚胎移植) (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　植物細胞的全能性　抗原—抗體雜交 4.某些微生物能表達黃曲霉毒素B1(AFB1)解毒酶。將該酶添加在飼料中可以降解AFB1,清除其毒性。下圖為采用

10、基因工程技術(shù)生產(chǎn)AFB1解毒酶的流程圖。 據(jù)圖回答問題。 (1)過程Ⅱ中,需要用引物的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。? (2)構(gòu)建酵母工程菌最常用的運載工具是　　　　,操作程序中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是　　　　　　　　　　。檢測酵母工程菌中AFB1解毒酶基因是否轉(zhuǎn)錄,應(yīng)采用　　　　　　　　的方法。? (3)采用蛋白質(zhì)工程進一步改造該酶的基本途徑是,從提高酶的活性出發(fā),設(shè)計預(yù)期的　　　　　　　,推測應(yīng)有的氨基酸序列,找到相對應(yīng)的　　　　　　　　　　　　　　　　。? 答案:(1)DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3'端延伸DNA鏈 (2)質(zhì)?！?gòu)建基因表達載

11、體　分子雜交 (3)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)　脫氧核苷酸序列 解析:(1)由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3'端延伸DNA鏈,因此過程Ⅱ中需要用引物。(2)構(gòu)建酵母工程菌時,常用的運載體是質(zhì)粒,關(guān)鍵步驟是構(gòu)建基因表達載體;轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是mRNA,可以利用分子雜交法進行檢測。(3)蛋白質(zhì)工程的本質(zhì)是通過基因改造或基因合成,對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)。所以其基本途徑是設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),推測應(yīng)有的氨基酸序列,找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列,從而獲得活性較高的酶。 5.大豆花葉病是世界性大豆病害,是造成大豆減產(chǎn)的重要原因。某科研小組制備了大豆花葉病毒(RNA病毒)的空衣殼蛋白(CP

12、蛋白),生產(chǎn)過程大致如下。請回答問題。 (1)圖中的①是指　　　　　　　。? (2)過程Ⅱ中應(yīng)用的酶是　　　　　　　　　　　　。在此過程前,先要在大豆花葉病毒的基因文庫中查找　　　　　　　　　　　　　　的核苷酸序列,以便合成特異性引物。? (3)在上述生產(chǎn)流程中,　　　　　　(填序號)是基因工程生產(chǎn)CP衣殼蛋白的核心步驟。為檢測樣液中是否含有有效成分,在Ⅶ處可使用　　　　　　　　　　　　　　　　　進行檢測。? 答案:(1)RNA (2)Taq DNA聚合酶　CP蛋白基因(控制CP蛋白合成的RNA片段) (3)Ⅲ　CP蛋白的抗體 6.下面為DNA的粗提取和鑒定實驗的相關(guān)操作。請

13、回答下列問題。 實驗材料A洗凈→切成小塊→加入二氧化硅和B→研磨→研磨液→過濾后得濾液C (1) 圖中實驗材料A可以是　　　　　等,研磨前加入的B應(yīng)該是　　　　　　　　　。? (2) 通過上圖所示步驟得到濾液C后,再向濾液中加入物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液,目的是　　　　　　　　;然后過濾得到濾液D,向濾液D中加入蒸餾水的目的是　　　　　　　　　　。 (3)在該實驗中,將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為2 mL的4種溶液中,經(jīng)攪拌后過濾,獲得如下表所示的4種濾液。含DNA最少的是濾液　　　。? 1 B液 攪拌研磨后過濾 濾液E 2 物質(zhì)的量濃度為2 m

14、ol/L的NaCl溶液中 攪拌后過濾 濾液F 3 物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液中 攪拌后過濾 濾液G 4 冷卻的體積分數(shù)為95%的酒精溶液中 攪拌后過濾 濾液H (4)DNA鑒定的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。? 答案:(1)洋蔥(菜花等)　洗滌劑和食鹽 (2)使DNA溶解　使DNA(溶解度下降而沉淀)析出 (3)H (4)在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺會被染成藍色 解析:(1)選用洋蔥、菜花等植物材料提取DNA時,要在切碎的材料中加入一定的洗滌劑和食鹽,并進行充分攪拌和研磨。(2)DNA在物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaC

15、l溶液中的溶解度較高,而在物質(zhì)的量濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向濾液中加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解,過濾除去不溶的雜質(zhì)。向濾液中加入蒸餾水可降低NaCl溶液的濃度,使DNA析出,除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。(3)DNA不溶于冷酒精,可利用這一原理進一步提純DNA。(4)鑒定DNA的原理是在沸水浴的條件下,DNA遇二苯胺會被染成藍色。 7.苜蓿是目前我國種植最廣的豆科牧草,但是病菌往往威脅著苜蓿的生長。為了提高產(chǎn)量,研究人員將溶菌酶基因(LYZ基因)和綠色熒光蛋白基因(GFP基因)連接為LYZGFP基因,利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入苜蓿細胞

16、中,并通過組織培養(yǎng)成功獲得了抗病植株。圖1表示Ti質(zhì)粒,其中Vir區(qū)的基因產(chǎn)物是T-DNA轉(zhuǎn)移的必備條件;圖2表示含有LYZGFP基因的DNA片段,圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。回答下列問題。 圖1 圖2 (1)構(gòu)建含有LYZGFP基因的重組質(zhì)粒時,應(yīng)選用限制酶　　　　　進行切割,原因是　???　。? (2)據(jù)圖分析,在培育轉(zhuǎn)基因苜蓿植株過程中,應(yīng)選擇LYZGFP基因中的GFP基因作為標記基因,而不選擇質(zhì)粒中原有的卡那霉素抗性基因為標記基因,這種做法的優(yōu)點是　　　　　　　　　　　。? (3)在組織培養(yǎng)過程中,對愈傷組織進行顯微檢測,若　　　　　　　　　　　,則表明細胞中GFP基因存在并表達。? (4)對該苜蓿植株進行病菌接種實驗,通過觀察其抗病程度可以進行個體生物學水平的鑒定,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。? 答案:(1)Ⅰ和Ⅲ　用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅲ切割能獲取LYZGFP基因,不會破壞質(zhì)粒中的Vir區(qū)的基因,使目的基因的插入位點位于T-DNA片段上 (2)LYZGFP基因在T-DNA片段上,能整合到苜蓿細胞染色體的DNA上,便于追蹤檢測LYZ基因的表達情況 (3)觀察到綠色熒光 (4)LYZ基因能夠表達出溶菌酶,溶菌酶能夠殺滅病菌,表現(xiàn)出抗病特性 - 5 -