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1、1,細菌內毒素檢查法 2008年12月 鄭州,中國藥品生物制品檢定所 蔡 彤,2,一、背景介紹,熱原 細菌內毒素 細菌內毒素檢查法反應機理,3,熱原,熱原是指臨床上引起哺乳動物發(fā)熱反應的物質 細胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 內源性熱原 產生細胞分裂素的物質 內毒素熱原 外源性熱原 非內毒素熱原（病毒、細菌、真 菌、抗體-抗原復合物、細胞分裂素）,4,細菌內毒素,細菌內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組分之一 化學結構 含有3個不同的區(qū)域 O-特異側鏈 核心多糖 類脂A,5,細菌內毒素,致熱性 內毒素作用于人體細胞，使之釋放內原 性熱原，再刺激下丘腦體溫調節(jié)中樞， 引

2、起發(fā)熱反應 耐熱性 分子極性 多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性 在水中呈不均勻分布 酸堿性與 強酸強堿水解反應 鱟反應性,6,C因子,活化的C因子,內毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝膠）,凝固蛋白原,二價陽離子,(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM,活化的G因子,G因子,細菌內毒素檢查法反應機理,能與鱟的血液提取物可發(fā)生發(fā)生多級酶促反應，形成凝膠,7,細菌內毒素檢查法反應機理,在藥品生產質量管理規(guī)范（GMP）條件下進行藥品生產的質量控制，一般可以接受的觀點是，不存在內毒素就意味著不存在熱原 通過檢測內毒素控制藥品中的熱原,8,Boc-leu-Gly-Arg-PNA （

3、鱟三肽）,活化的C因子,C因子,內毒素,活化的B因子,B因子,顯色法,凝膠法，濁度法,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝膠）,凝固蛋白原,9,細菌內毒素檢查法定義： 本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。,二、細菌內毒素檢查法介紹,10,細菌內毒素檢查包括： 限量實驗 凝膠法 半定量實驗 可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。,濁度法 動態(tài)濁度法 光度測定法 終點濁度法 顯色基質法 動態(tài)顯色法 終點顯色法,二、細菌內毒素檢查法介紹,11,細菌內毒素檢查 凝 膠 法,12,細菌內毒

4、素檢查-凝膠法,1、綜述部分 實驗原理 實驗準備 限值（L）的確定 確定最大有效稀釋倍數（MVD）,2、實驗部分 鱟試劑靈敏度復核 干擾實驗：預實驗 正式干擾實驗 檢 查 法：限量試驗 半定量試驗,13,C因子,活化的C因子,內毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白原,凝固蛋白（凝膠）,二價陽離子,1、凝膠法實驗原理,14,37 1下保溫反應602分鐘 當樣品中細菌內毒素的濃度達到或超過鱟試劑的靈敏度時，凝集為堅實凝膠，為陽性，記為“+”。 當樣品中細菌內毒素的濃度未達到鱟試劑的靈敏度時，不能凝集為堅實凝膠，為陰性，記為“”。,1、凝膠法實驗原理,15,2、凝膠法實驗的準備,實

5、驗所需物品 細菌內毒素標準物質 細菌內毒素檢查用水 凝膠法鱟試劑 漩渦混合器 適宜的恒溫器 37 1 電熱干燥箱 250 實驗器械等,16,細菌內毒素標準物質 國家標準品 以內毒素國際標準品為基準標定效價 150600-200707 10000EU/支 工作標準品 以內毒素國家標準品為基準標定效價 150601-200862 120EU/支,2、凝膠法實驗的準備,17,細菌內毒素檢查用水 用于復溶內毒素標準品、稀釋內毒素及樣品、溶解鱟試劑等 凝膠法細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。,2、凝膠法實驗的準備,18,凝膠法鱟試劑 8個鱟試劑廠家 靈敏度0.50.

6、03EU/ml 規(guī)格0.5ml、0.1ml等,2、凝膠法實驗的準備,19,漩渦混合器,2、凝膠法實驗的準備,20,適宜的恒溫器 恒溫水浴 恒溫培養(yǎng)箱 干熱恒溫器,2、凝膠法實驗的準備,21,試驗器械的要求 移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無熱原吸頭）、凝集管（1075mm）、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、封口膜、計時器、75%酒精棉、剪刀、砂輪。 試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。常用的方法是在250干烤至少60分鐘，也可采用其他確證不干擾細菌內毒素檢查的適宜方法。,2、凝膠法實驗的準備,22,試驗器械的要求 若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無

7、內毒素并且對試驗無干擾的器械。 試驗操作過程應防止微生物的污染。,2、凝膠法實驗的準備,23,供試品溶液的制備 某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。 一般要求供試品溶液的pH值在6.08.0的范圍內。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調節(jié)pH值。 緩沖液必須經過驗證不含內毒素和干擾因子。,2、凝膠法實驗的準備,24,3、限值（L）的確定,中國藥典標準、國家藥品標準 藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定： L=K/M,25,3、限值（L）的確定,L=K/M L為供試品的細菌內毒素限

8、值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/kg/h表示。其中注射劑，K5EU/kg/h；放射性藥品注射劑，K2.5EU/kg/h；鞘內用藥品，K=0.2EU/kg/h。 M為人用每公斤體重每小時最大劑量，以ml/kg/h、mg/kg/h、U/kg/h表示。藥品人用最大劑量可參閱臨床用藥須知或藥品使用說明書。 中國人均體重按60kg計算，注射時間小于1小時的按1小時計。,26,3、限值（L）的確定,計算舉例： 注射用阿莫西林鈉 根據國家藥典委員會編纂的臨床用藥須知: “肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一次0.51g，一日34

9、次；小兒按體重每日50100mg/kg，分34次靜脈滴注?！?M成人=1000mg/h60kg=16.67mg /(kgh) M兒童=100mg/(kgh)3=33.3mg /(kgh) L=K/M=5EU/(kgh) 33.3mg/(kgh) =0.150EU/mg,27,3、限值（L）的確定,限值計算時做必要調整的幾種情況 從嚴原則 聯合用藥 特殊情況等,28,4、確定最大有效稀釋倍數（MVD）,最大有效稀釋倍數是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數，在不超過此稀釋倍數的濃度下進行內毒素限值的檢測。 MVD=cL/,29,4、確定最大有效稀釋倍數（MVD）,MVD=cL/ L：供試品的細菌內毒

10、素限值 c：供試品溶液的濃度 ：在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（ EU/ml）,30,4、確定最大有效稀釋倍數（MVD）,計算舉例： a、當L以EU/ml表示時，則C等于1.0ml/ml 適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應小于xx EU/ml。 例：替硝唑注射液 ，計算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行檢驗，則 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,31,4、確定最大有效稀釋倍數（MVD）,計算舉例： b、當L以EU/mg或EU/U表示時，濃度c的單位需為mg/ml或U/ml 。 適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液

11、體但是規(guī)定限值為應小于xx EU/mg或EU/U 。,32,4、確定最大有效稀釋倍數（MVD）,例：注射用阿莫西林鈉 計算限值為0.15 EU/mg，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行檢驗。 需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉 ,在已除去外源性內毒素的容器中,用細菌內毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。 如稱取100mg注射用阿莫西林鈉 ，用5ml內毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。 MVD=20mg/ml0.15 EU/mg0.125 EU/ml=24倍,33,4、確定最大有效稀釋倍數（MVD）,如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，計算供試品

12、的最小有效稀釋濃度c=/L； 適用于供試品為固體的情況。計算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。 例：注射用阿莫西林鈉 計算限值為0.15 EU/mg，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行檢驗。 最小有效稀釋濃度c= 0.125EU/ml0.15EU/mg=0.833mg/ml,34,細菌內毒素檢查-凝膠法,2、實驗部分 鱟試劑靈敏度復核 干擾實驗：預實驗 正式干擾實驗 檢 查 法：限量試驗 半定量試驗,35,鱟試劑靈敏度復核試驗,目的：不僅是考察鱟試劑靈敏度是否準確，也是考查檢驗人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規(guī)定。 要求每個實驗室在使用一批新的鱟試劑前必須進

13、行鱟試劑靈敏度復核實驗。,36,鱟試劑靈敏度復核試驗,實驗操作: 取細菌內毒素國家標準品或工作標準品一支，加入規(guī)定量的細菌內毒素檢查用水溶解其內容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘。 然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內毒素標準溶液,即2.0、1.0、0.5、0.25（為所復核的鱟試劑的標示靈敏度），每稀釋一步均應在旋渦混合器上混合30秒鐘。,37,鱟試劑靈敏度復核試驗,38,鱟試劑靈敏度復核試驗,放入371的恒溫器中，保溫60分鐘2分鐘。 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形或從管壁

14、滑脫者為陰性。 保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。,39,堅實凝膠 陽性“+”,40,未形成凝膠 凝膠不堅實 陰性“”,41,鱟試劑靈敏度復核試驗,結果判斷： 若最大濃度2管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。 結果計算： 反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（c）。 c=lg-1（X/4） 式中X為反應終點濃度的對數值（lg）。 反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。,42,鱟試劑靈敏度復核試驗,+,0.5 ,0.5 ,c= lg-1（(lg +lg +lg0.5 +lg0.5 )/4)=0.707 ,+

15、,+,+,+,+,+,+,+,+,43,鱟試劑靈敏度復核試驗,當c在0.52（包括0.5和2）時，方可用于細菌內毒素檢查。 以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。,44,凝膠法干擾試驗,目的：是確定供試品在多大的稀釋倍數或濃度下對內毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，為能否使用細菌內毒素檢查法提供依據。 未進行過內毒素檢查法驗證的樣品 當供試品的配方和工藝有變化，或供試品陽性對照結果呈陰性時驗證供試品是否存在干擾作用。,45,凝膠法干擾試驗,試驗操作： 在干擾試驗中，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（MVD）的溶液。 解釋：即與所使用的鱟試劑反應，不出現陽性的供試品溶液。,

16、46,凝膠法干擾試驗,試驗操作： 預試驗 正式干擾實驗,47,凝膠法干擾試驗,預試驗 目的：初步確定供試品的最大不干擾濃度（當限值以EU/mg或EU/u活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數（當限值以EU/ml表示），為正式干擾實驗提供依據。 優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省成本,48,凝膠法干擾試驗,預試驗 將供試品溶液進行一系列倍數的稀釋。 使用鱟試劑對每一稀釋倍數進行檢驗。 每一稀釋倍數下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即含2.0濃度標準內毒素的該濃度的供試品稀釋液）。 另做2支陰性對照，和2支陽性對照。,49,凝膠法干擾試驗,預試驗結果判斷 當陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效。 當

17、系列濃度中出現供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數即為最小不干擾稀釋倍數。 即可選擇該稀釋倍數進行正式干擾實驗。,50,凝膠法干擾試驗,預試驗舉例 供試品限值 硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml； 藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U,51,凝膠法干擾試驗,預試驗舉例 系列稀釋倍數的確定 稀釋倍數一般為MVD0.5MVD0.03，不大于MVD0.03。 MVD0.5 =cL/= 由此可計算出使用不同時所對應的MVD：,52,凝膠法干擾試驗,如上結果可初步確定該批硫酸慶大霉素的最小不干 擾稀釋倍數為80倍，可在

18、此濃度下進行正式干擾實驗。,53,凝膠法干擾試驗,正式干擾試驗 目的：檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內毒素的反應有無干擾作用。,54,凝膠法干擾試驗,正式干擾試驗 目的：檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內毒素的反應有無干擾作用。 通過比較鱟試劑與在水溶液中的內毒素和供試品溶液中的內毒素反應的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對內毒素檢查有干擾。,55,凝膠法干擾試驗,正式干擾試驗 操作： 內毒素檢查用水 同一支內毒素 標準品 供試品溶液 同時制備2支供試品陰性對照和2支陰性對照。,含2.0、0.5、0.25的內毒素標準溶液 含2.0、0.5、0.25的內毒素的供試品溶液,56,凝膠

19、法干擾試驗 正式干擾試驗,結果判斷： 當供試品陰性對照和陰性對照都為陰性 用檢查用水稀釋的標準內毒素系列的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時 試驗方為有效,57,凝膠法干擾試驗 正式干擾試驗,分別計算用檢查用水制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液或稀釋液制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Et）。 Es=lg-1( Xs/4) Et=lg-1( Xt/4) 當Es在0.52（包括0.5和2）及Et在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。,58,凝膠法干擾試驗 正式干擾試驗,試驗舉例 硫酸慶大霉素 根據干擾初篩試驗的結果

20、，供試品在80倍稀釋時無干擾（對應鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml） 選擇將供試品稀釋80倍進行干擾驗證試驗。 選用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑,59,凝膠法干擾試驗 正式干擾試驗,試驗舉例 制備含內毒素的供試品80倍稀釋溶液 方法1： 標準品+1ml檢查用水溶解 用硫酸慶大霉素80倍稀釋溶液將內毒素稀釋至2.0、0.5、0.25的濃度,60,凝膠法干擾試驗 正式干擾試驗,試驗舉例 制備含內毒素的供試品80倍稀釋溶液 方法2：標準品+1ml檢查用水溶解 用檢查用水將內毒素稀釋至4.0、2.0、0.5 0.5ml 4.0內毒素溶液 1ml含2.0內毒素的80倍 稀釋溶液 0.5ml 4

21、0倍稀釋溶液,61,62,Es=lg-1( Xs/4) = 0.125 Et=lg-1( Xt/4)=0.177,0.125 0.125 0.25 0.25,0.125 0.125 0.125 0.125,63,凝膠法干擾試驗,導致干擾的因素： pH值 抗凝因子 螯合劑 葡聚糖 .,64,凝膠法干擾試驗,排除干擾的方法： 稀釋 中和 過濾 加熱 ,65,凝膠法干擾試驗,為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。 即，先在供試品溶液中添加2濃度的標準內毒素，然后用所選擇的方法處理溶液，而后再進行稀釋、檢測。,66,

22、凝膠法干擾試驗,由于干擾實驗檢驗的是在供試品存在的情況下內毒素與鱟試劑的反應是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關，因此在干擾實驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。 建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內毒素對干擾實驗造成的陽性影響。,67,凝膠法干擾試驗,當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。 須：三個批號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑。 當鱟試劑、供試品的配方、生產工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。 如：內毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時,68

23、,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗,檢驗供試品中的內毒素含量是否小于限值的定性方法。 每批供試品必須做 2支供試品管 2支供試品陽性對照 同時 每次實驗須做2支陽性對照和2支陰性對照。,69,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗,例：替硝唑注射液 ，計算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,供試品溶液： 4倍替硝唑稀釋液 供試品陽性對照為：含0.25EU/ml標準內毒素的4倍替硝唑稀釋液 陽性對照為：濃度為0.25EU/ml的標準內毒素溶液,70,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗,例：

24、替硝唑注射液 ，計算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,+,+,-,-,+,+,試驗有效,71,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗,例：替硝唑注射液 ，計算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,+,+,-,-,+,+,-,-,此批替硝唑注射液的內毒素含量小于0.5 EU/ml， 符合規(guī)定。,72,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗,例：替硝唑注射液 ，計算限值為0

25、.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,此批替硝唑注射液的內毒素含量不小于0.5 EU/ml， 不符合規(guī)定。,+,+,+,+,+,+,-,-,73,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗,例：替硝唑注射液 ，計算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算 MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,須復試。,-,-,-,+,+,+,+,+,74,凝膠法 -檢查法 凝膠限量試驗,復試時，供試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均

26、為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。,-,-,+,+,+,+,75,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,半定量試驗是使用凝膠法估測供試品中內毒素含量的方法。 系通過確定反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。,76,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反應，其反應終點濃度的稀釋倍數與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內毒素含量 。 操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度或稀釋倍數下開始進行對倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數不得超過所使用鱟試劑的MVD。,77,A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗的供試品系列稀釋液。 B：供試品陽

27、性對照。（為確證不存在干擾作用） C：標準內毒素系列。（為確證本次試驗的操作和環(huán)境都符合要求。） D：陰性對照。,78,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,結果判斷： 當陰性對照溶液D的平行管均為陰 供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性 系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在0.52之間 試驗有效,79,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,結果計算：,80,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,結果計算：,c=lg-1（X/2）= 0.707，在0.52之間 仍以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度 。,81,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,結果計算：,CE=lg-1（X/2）= lg-1（lg4 +lg

28、2 ） /2） = 2.83 ,82,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,結果計算： 如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘上稀釋倍數。,83,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,結果計算： 例：右旋糖酐20葡萄糖注射液 ，限值為0.5EU/ml 。 通過使用3個鱟試劑廠家的鱟試劑對3個不同廠家的7批樣品進行干擾試驗證實：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內毒素檢查。 使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑對一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進行凝膠半定量試驗。,84,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,例： 計算MVD MVD=0.5EU/ml/0.03EU/ml

29、 =16.67倍 從已確定不干擾的稀釋倍數2倍起，再進行1、2、4、8倍的稀釋。（相當于又將供試品原液進行了4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數沒有超過MVD。）,85,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,例：,CE=lg-1（X/2）= lg-1（lg4 0.03 +lg2 0.03 ） /2） = 2.83 0.03 =0.0849 EU/ml,86,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,例： 由于檢驗時采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數2倍稀釋液，因此計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘上稀釋倍數2。 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內毒素含量為： 2 0.0849=0.170 EU

30、/ml,87,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,結果計算： 如試驗中供試品溶液的結果都為陰性，應記為內毒素濃度小于（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記錄為小于乘以該供試品的最低稀釋倍數）。,88,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,例：,CE lg-1（X/2）= =0.03 EU/ml 2 0.03= 0.06EU/ml 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內毒素含量為：小于0.06EU/ml,89,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,結果計算： 如果結果都為陽性，應記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以。,90,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,例：,CE lg-1（X/2）= 8 =0.24 E

31、U/ml 2 0.24= 0.48EU/ml 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內毒素含量為：大于0.48EU/ml,91,凝膠法 -檢查法 凝膠半定量試驗,若內毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。 若內毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。,92,注意事項,實驗前，須用肥皂洗手，用75酒精棉球消毒。 在使用洗耳球、移液管取樣時，應注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內毒素進入供試液。 溶解鱟試劑及混勻供試品和鱟試劑時，不要劇烈振蕩避免產生氣泡。 由于凝集反應是不可逆的，所以在反應過程中及觀察結果時應注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產生假陰性結果。,93,注意事項,進行干擾實驗時，標準對照系列和含內毒素的供試品溶液系列應同時進行。 在進行鱟試劑靈敏度復核、干擾實驗和供試品細菌內毒素檢查時，各個實驗中要求的對照應同時進行，并在實驗有效的情況才能進行計算和判斷。 實驗操作應在清潔環(huán)境中進行，過程中應防止微生物的污染。,94,謝謝！ 2008年12月,