《Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析（20頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析 8 t W5 _0 U6 |: U, ]$ b; d) O1. 在western實(shí)驗(yàn)中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解釋一下二者在使用中的區(qū)別？ ; e2 Q8 R, H& o! @1 A4 u: @　　選擇合適的緩沖液對(duì)于維持一定PH值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性是很重要的。PBS的緩沖能力強(qiáng)于TBS（因?yàn)榛旌暇彌_液在一定的離子強(qiáng)度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過(guò)PBS易污染）。但我們常常要根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽(yáng)離子緩沖液首選TBS；陽(yáng)

2、離子交換層析時(shí)，陰離子緩沖液則首選PBS。: Y0 g" l9 S) O' p8 u western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度。6 p) e4 c- U: n/ i/ E; | 2. 沒(méi)有注明可以用來(lái)做western blot的一抗，可以用來(lái)做western blot嗎？1 r' @. k n/ J 不一定,因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位的，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于western blotting，因?yàn)樵趙estern blotting中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞。# Y8

3、y5 S% t, g4 d6 ^+ w 3. 做western每次只加一種一抗，可以同時(shí)加兩種或者多種一抗的嗎？ ; u5 D* p- |: O0 ?9 D　　最好還是不要同時(shí)加兩種一抗。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號(hào)的話，就說(shuō)不清楚了。做Western在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對(duì)照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。 + B% W1 U3 c' C2 O; O4. western blot 使用的膜哪種最好啊，PVDF好還是NC膜，能介紹一下膜的選擇嗎？" m) ~/ c) t4 `! h4 ]* W5

4、H 　　PVDF膜價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。 NC膜價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 都可以用麗春紅染色。具體使用還要參考相關(guān)文獻(xiàn)。* x# r7 U( T/ u1 {5 m8 Y* X+ i1 O( b 5. 為什么出現(xiàn)了多條帶,每個(gè)加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶，而且好象都很有規(guī)律,為什么?是封閉時(shí)間不夠嗎？做WESTERN必須要內(nèi)參嗎？ 5 v I) i" _; H9 ~" r( C, l　　一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng)，抗體的特異性不強(qiáng)，目的

5、蛋白經(jīng)過(guò)處理后發(fā)生變化,而內(nèi)參的條帶基本均勻一致.這樣才有說(shuō)服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認(rèn)為的造成目的條帶濃度的變化.所以嚴(yán)格意義上說(shuō),內(nèi)參是必須做的。 9 z. z! g3 b, \0 \6. western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些？購(gòu)買(mǎi)一抗時(shí)發(fā)現(xiàn)單抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？ 9 ^4 S8 Q8 k; D& g　　作為western來(lái)講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類(lèi)較少一般價(jià)格偏高，所以一般來(lái)說(shuō)多抗足夠了。用于western

6、的抗體和用于ELISA的抗體，一般來(lái)說(shuō)用于western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類(lèi)，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)來(lái)確定。 * C7 ^# A( A% }" T4 M　　做免疫印跡時(shí)選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個(gè)問(wèn)題，一是所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。 0 V( ]: F" S- l4 z- v& a: A7. 半干轉(zhuǎn)是否要求膜，濾紙，膠同樣大小？因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn)，那樣會(huì)不會(huì)短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？% h3 @! S

7、* l9 L- J' _! ~ 　　可以相等，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過(guò)大而相互接觸，這樣同樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過(guò)膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。$ Z" ?8 [2 C* Y$ @) s 8. Western Blot哪種染色好？8 m4 ]$ |' Y+ \$ n7 ?4 v1 o6 M μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是

8、：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語(yǔ)正電賀的膜。靈敏度低。 - `$ a4 ~7 J# G" r, v7 v3 \. }; J（2） 膠體金，靈敏度高，檢測(cè)范圍可到pg級(jí)，但染色比穩(wěn)定。 1 b" n: o W X1 q/ ]& x$ [& J（3） 生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。2 n9 ~( P! f9 E* _' b2 M 9. 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？/ N" M9 ]% l1 p5 P" T 　　可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》)，因

9、為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。 5 U* v' P: G$ Q# m0 P2 ]& x10. DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理是什么？0 _$ Z+ a$ f2 g4 T DAB顯色在辣根過(guò)氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機(jī)溶劑，DAB的

10、氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強(qiáng)度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類(lèi)和磷酸。酚和無(wú)色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料。 0 r$ d( U0 U" p( e4 {11. 酶顯色與熒光顯色之間，各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？ / E$ ^% k7 H# l, |# h- H( l　　免疫酶技術(shù)就是用酶(如辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記已知抗體(或抗原)，然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)，如果組織中含有相應(yīng)抗原(或抗體)，抗原抗體相互結(jié)合形成的復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時(shí)，能催化底物水解、氧化或還原，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，這樣就可以識(shí)別出標(biāo)本抗

11、原(抗體)分布的位置和性質(zhì)，通過(guò)圖像分析并可達(dá)到定量的目的。 , Q8 c5 ~6 P" t$ E0 d6 V　　免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究與診斷，但是熒光抗體染色標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存，對(duì)組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，免疫酶技術(shù)則能克服上述不足，標(biāo)記免疫酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法，對(duì)石蠟切片標(biāo)本尤為適用，為免疫病理研究開(kāi)辟了一條新途徑，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理還可以進(jìn)行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術(shù)分為酶標(biāo)記法與非標(biāo)記抗體技術(shù)，前者是將酶通過(guò)交聯(lián)劑結(jié)合在抗體分子上，形成酶標(biāo)記抗體。后者是將酶作為抗原與相應(yīng)的特異性抗體連接進(jìn)行的免疫反應(yīng)，稱(chēng)為非標(biāo)記抗體酶技術(shù)。

12、關(guān)于western blot原理和常見(jiàn)故障分析(我覺(jué)的比較全) 關(guān)于western blot 原理： 通過(guò)電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過(guò)特異性試劑（抗體）作為探針，對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測(cè)到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的選擇和制備 A：樣品的制備 1 組織： 組織的處理方法：組織洗滌后加入3倍體積預(yù)冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清

13、。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。 2 細(xì)胞： 細(xì)胞的處理方法： 離心收集細(xì)胞或者直接往細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。 3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚藍(lán)制樣。 B：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因 1.雙縮脲法

14、： 雙縮脲法是第一個(gè)用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。在需要快速，但不很準(zhǔn)確的測(cè)定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對(duì)蛋白質(zhì)提純的早期階段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，此物在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測(cè)定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris、Good緩沖液等?？捎贸恋矸ǔジ蓴_物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。 2.Lowry法： 此法是雙縮脲法的進(jìn)一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng)

15、，即Cu++與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物，然后這個(gè)絡(luò)合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），結(jié)果得到深藍(lán)色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測(cè)定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液。其干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質(zhì)的存在會(huì)使結(jié)果嚴(yán)重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時(shí)要特別小心，試劑只在酸性pH環(huán)境中才穩(wěn)定，上述提到的還原反應(yīng)只有在pH10時(shí)才發(fā)生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu2+-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+-蛋白質(zhì)絡(luò)合物所還原。 3.紫外吸收法： 大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有特

16、征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，因此，利用這個(gè)特異性吸收，可以計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。如果沒(méi)有干擾物質(zhì)的存在，在280nm處的吸收可用于測(cè)定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質(zhì)溶液。部分純化的蛋白質(zhì)常含有核酸，核酸在260nm波長(zhǎng)處有最大吸收。 4. Bradford比色法： Bradford比色法比Lowry法測(cè)定蛋白濃度更簡(jiǎn)單迅速。用脫氧膽酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污劑、2-巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、Tris和一些堿性緩沖系統(tǒng)的干擾。 分別在兩組微量離心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20μμl，同時(shí)以?xún)晒?00μl的0.1

17、5mmol/l NaCl作空白對(duì)照。每管各加入1ml考馬斯亮藍(lán)染料溶液，振蕩混勻，室溫放置2分鐘。用1cm光徑的微量比色杯測(cè)A595，取A595吸光值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度作圖，畫(huà)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)量待測(cè)樣品的A595。從BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定待測(cè)樣品的濃度。測(cè)定10-100μg的蛋白質(zhì)，要在較大試管中將染料溶液體積增大5倍進(jìn)行。樣品濃度過(guò)高，可稀釋后進(jìn)行，或在10-100μg另作一標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。 5．電泳估算法（我們選擇此法）： 樣品倍比稀釋?zhuān)琒DS-PAGE電泳，同時(shí)做定量marker對(duì)照，可以估算樣品大概濃度。 以提取癌組織總蛋白為例： ① 取等量胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織，用dH

18、2O漂洗5～10次，再用預(yù)冷的1×PBS洗滌3次，目的是去除樣本中的血液。 ② 每2克組織加入3ml 1×PBS勻漿，保持在4℃條件進(jìn)行。 ③ 加入5×STOP Buffer緩沖液1ml，混勻，4℃下超聲碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚藍(lán)，煮沸10mins，至此，制樣過(guò)程完成； ④ SDS-PAGE電泳，以BAS作為對(duì)照估計(jì)樣品蛋白濃度。 二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE） A：實(shí)際操作 1. 做膠前的準(zhǔn)備 1)檢查是否有足夠的、干凈的 spacer、comb 和架子。 2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒(méi)有立刻重配。 3)按將要檢測(cè)的抗

19、體對(duì)應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計(jì)算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。 2. 制膠，電泳 1）裝好架子。 2)按照下面配方配制分離膠。(單位：ml，Total： 8ml) 7.5％ 10％ 15% 2×Sep. buffer 4 4 4 30％ Gel.sol 2.0 2.7 4 ddH2O 1.9 1.2 0 TEMED 8ul 8ul 8ul 10%APS 80ul 0ul 80ul 在膠上面加入一層蒸餾水，促進(jìn)膠更好的凝集。 3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。(單位：ml，Tota

20、l： 3.5ml) 3％ TEMED 5ul 10%APS 50ul 倒好后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。 4)待膠凝集好后，上樣，電泳。 上層膠用60-80V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時(shí)，用100-120V電壓。一般電泳時(shí)間在1.5小時(shí)左右。 B ：注意事項(xiàng)及常遇到的問(wèn)題 1）分離膠不要倒的太滿(mǎn)，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。 2）上樣蛋白量不應(yīng)超過(guò)30ug/mm2 (載荷面即：如果你的膠槽是5mm×1mm，則載荷面為：1mm×5mm=5mm2) 。 3）gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好，過(guò)快表示TEMED、APS用量過(guò)多，此時(shí)膠太硬易龜裂，而且電泳時(shí)容易燒膠

21、。太慢則說(shuō)明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實(shí)際不純或?qū)嵭А? 4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。 5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象： ︶ 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。 ︵ 條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。 拖尾：樣品溶解不好。 紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。 條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。 條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過(guò)多。 三、轉(zhuǎn)移 在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。 膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、

22、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。 A 半干法 即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過(guò)濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀つz上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時(shí)間短，效率高。 1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇 電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間，具體可以根據(jù)實(shí)際適當(dāng)調(diào)整。 目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度 轉(zhuǎn)

23、移時(shí)間 25---80 2 實(shí)驗(yàn)操作 （1）濾紙和膜的準(zhǔn)備 (在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開(kāi)始準(zhǔn)備工作)。 A. 檢查是否有足夠的transfer buffer，沒(méi)有立即配制。 B. 檢查是否有合適大小的濾紙和膜。 C. 將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transfer buffer中。 D. 將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。 PDVF膜在進(jìn)轉(zhuǎn)移緩沖液時(shí)，要在甲醇里面泡多長(zhǎng)時(shí)間? PVDF是疏水性的，在轉(zhuǎn)膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤(rùn)。 PVDF的預(yù)處理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后轉(zhuǎn)入蒸餾水洗

24、兩次。用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。 一般5-20分鐘都有人在用?？稍谌∧z的同時(shí)泡，估計(jì)前后5分鐘左右。效果還不錯(cuò)。以前有站友發(fā)貼，說(shuō)處理時(shí)間沒(méi)多大關(guān)系，關(guān)鍵看膜的質(zhì)量．確實(shí)是這樣的。只要讓膜完全浸透應(yīng)該就沒(méi)問(wèn)題了。 Hybond的PVDF說(shuō)明書(shū)這樣的寫(xiě)的：“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是，至少10秒鐘，多泡下也沒(méi)關(guān)系的，事實(shí)上，泡10秒的做過(guò)，10分鐘的也做過(guò)，都沒(méi)有問(wèn)題的。 （2）轉(zhuǎn)移 A. 在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。 B.

25、 將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤(rùn)。 C. 將膠剝出，去掉stack gel，小心的移到膜上。 D. 剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。 E. 將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。 F. 裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時(shí)間。 G. 轉(zhuǎn)移過(guò)程中要隨時(shí)觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時(shí)調(diào)整。 3 注意事項(xiàng)及常遇到的問(wèn)題 1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。 2）濾紙、膠、膜之間千萬(wàn)不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。 3）因?yàn)槟さ氖杷裕?/p>

26、膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時(shí)保持濕潤(rùn)（干膜法除外）。 4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過(guò)的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。 5）轉(zhuǎn)移時(shí)間一般為1.5 小時(shí)，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流大小。 1)在疊膜、膠、紙三明治時(shí)候，操作于盛有轉(zhuǎn)膜Buffer的大平皿中進(jìn)行，疊好后，再將三者平行轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜裝置，切勿再移動(dòng)，因?yàn)樵赽uffer中操作，已經(jīng)完全排除了氣泡存在的可能，無(wú)需再趕氣泡 2)關(guān)于轉(zhuǎn)膜時(shí)間：半干轉(zhuǎn)的話，20 V×30min即可

27、 B 濕法 我們基本上不用此方法，這里暫不做介紹。 C 轉(zhuǎn)移后效果的鑒定 1．染膠 用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來(lái)反映轉(zhuǎn)移的效果。 2．染膜 有兩類(lèi)染液選擇，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這類(lèi)染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于進(jìn)一步的分析。 四、封閉（block） 封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。 常用的封閉液有bovine s

28、erum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我們一般用non-fat milk。 在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的Milk(TBST溶解)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入milk中block(一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜)，并清洗整理好用過(guò)的濾紙，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小時(shí)。 封閉后可以不洗膜，讓膜的一角在吸水紙上接觸，把封閉液控一下即可 五、孵育一抗 A. 先將需要檢測(cè)的抗體準(zhǔn)備好，并決定好它們的稀釋度。 B. 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀

29、釋?zhuān)? 最好采用梯度稀釋。 C. 將稀釋好的抗體和膜一起孵育。 一般采用RT 1小時(shí)，可根據(jù)抗體量和膜上 抗原量適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短時(shí)間。 注意：為了便于后面分析結(jié)果，我們一般會(huì)選用已確定分子量大小而且純度高的抗體作為marker與一抗同時(shí)孵育。 六、洗滌 用 TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。然后5mins *5。 洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺。 七、孵育二抗 孵育 RT1 小時(shí)。 一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1:5000。 二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。 注意二抗的選擇有多種，

30、要根據(jù)一抗來(lái)選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根據(jù)后面的顯色條件來(lái)選擇HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶鏈的二抗或者標(biāo)志其他探針（如核素等）的。 八、洗滌 用 TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。 然后5mins *5。 洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。 九、顯色（HRP酶） 1．增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL) Ecl 顯色原理：氨基苯二酰肼類(lèi)主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類(lèi)化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾（luminol，5＇-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)反應(yīng)式如下： 　　

31、魯米諾在免疫測(cè)定中既可用作標(biāo)記物，也可用作過(guò)氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過(guò)氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來(lái)。 試驗(yàn)步驟： 1）將兩種顯色底物1：1等體積混合（一般各1ml/membrane）。 2）將混合物覆蓋在膜表面，1-2分鐘，搖晃使均勻。 3）用保鮮膜把膜包起來(lái)，放入夾板中。 4）在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1min。 5）顯影、定影。 6）根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間和曝光區(qū)域，得到最佳結(jié)果。 注意：熒光在一段時(shí)間后會(huì)越來(lái)越弱。 DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）和HRP反應(yīng)產(chǎn)生棕色的不溶終產(chǎn)物。這種棕色沉淀不溶于酒精和

32、其它有機(jī)溶劑，對(duì)于必需使用傳統(tǒng)復(fù)染和封固介質(zhì)的免疫組化染色應(yīng)用特別理想。 對(duì)于AP標(biāo)記的二抗我們選用BCIP and NBT 顯色，它們?cè)趬A性磷酸酶（AP）作用下反應(yīng)可生成一種不溶性黑紫色沉淀的強(qiáng)信號(hào)。 Western顯色 ECL靈敏度比DAB高不少 雜帶多的原因無(wú)非是幾點(diǎn)： 1、你的一抗如是多克隆抗體，可以試著降低一抗的濃度，如一抗是單抗，可適當(dāng)降低二抗的濃度 2、還有最重要的是確保封閉的充分，封閉最好時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)，至少2小時(shí)室溫封閉，時(shí)間允許可4度過(guò)夜封閉 3、就是洗膜一定要充分我們一般PBST 10分鐘三次，還有看你是DAB 顯色吧，背景過(guò)深，DAB顯色時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)，一般2分鐘

33、足夠。 做一個(gè)好的陰性和陽(yáng)性對(duì)照。這樣出來(lái)的帶該在哪個(gè)位置，不該在哪個(gè)位置一目了然 十、分析結(jié)果及其判斷 常見(jiàn)問(wèn)題原因分析及處理方法： 見(jiàn)附錄一、二。 附錄一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48） 附錄二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394） 附錄三：試驗(yàn)中所用到的試劑和緩沖溶液 1) 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7: Stock: to use: 20% Glycerol 100ml take

34、9.5ml stock 10% SDS 50g 250mM Tris bromphenol blue or total 475.00ml pyronine 4 to taste 2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix): 0.8 bis-acrylamide 29.2% acrylamide total 100ml 3) 2x Laemmli Separation Buffer: Tris-HCl 0.2% SDS 10ml 20% SDS total 1000ml 4) 2x Laemmli Stacking

35、 Buffer: Tris 0.2% SDS 1g total 500ml 5) 10x Laemmli Running Buffer: 250mM Tris Glycine 1% SDS 20g total 2 liters 6) Transfer Buffer: 48mM Tris base 39mM Glycine 0.037% SDS g 20% MeOH 200ml total 1000ml 7) TBST: 10mM Tris-HCl， 100mM NaCl 0.2% Tween-20 Total 1000ml

36、 8) Coomassie Stain : 40%MeOH 400ml 10%HAc 100ml 0.1%BBR 1g Brilliant Blue R total 1000ml 9) Destain: 30%MeOH 300ml 7.5%HAc 75ml total 1000ml 10) 10×麗春紅染液配方： 麗春紅 2g 磺基水楊酸 30g 三氯醋酸 30g total 100ml 11）DAB DAB 50mg 0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml 30%H2O2 30-40ul 先配成2-5倍的儲(chǔ)存液，過(guò)濾后分裝，-20℃避光

37、保存，H2O2在工作液中終濃度0.01％ 不顯影不一定是抗原性喪失，Western blot 環(huán)節(jié)多，一抗和二抗原因是wb中比較難掌握準(zhǔn)的環(huán)節(jié)。 western blot的個(gè)人總結(jié)zz 1. WESTERN BLOT電轉(zhuǎn)膜時(shí)間與分子量大小有關(guān)，即大分子量的需要轉(zhuǎn)印時(shí)間長(zhǎng)些，才能轉(zhuǎn)到NC膜上去。小分子量的需要轉(zhuǎn)印時(shí)間短些。 我們用BIO-RAD電轉(zhuǎn)膜儀，30-80KD蛋白需要恒電流350毫安，70分鐘。15-30KD蛋白需要恒電流200毫安60分鐘。大于80KD蛋白需要恒電流350毫安120分鐘。同時(shí)電泳緩沖液要經(jīng)常更換。條件你要摸素，好運(yùn)?。?！ 2. 每次做we

38、stern blot 都遇到這個(gè)現(xiàn)象 膠上的蛋白條帶 很好 但轉(zhuǎn)膜后總是出現(xiàn)這種情況，麗春紅染色后發(fā)現(xiàn)蛋白條帶總是出現(xiàn)流水樣飄走了.我用濕式轉(zhuǎn)移 bio-rad 冰水 100伏 100分鐘 nc 膜 應(yīng)該不是氣泡,轉(zhuǎn)膜液沒(méi)問(wèn)題 請(qǐng)高手分析 首先多謝各位高手相助，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，原來(lái)并不是轉(zhuǎn)膜時(shí)間和電壓的問(wèn)題，也不是nc膜像各位說(shuō)的那樣比較差。原因真的是非常簡(jiǎn)單，只是因?yàn)槲覀兊霓D(zhuǎn)膜儀使用時(shí)間太長(zhǎng)，兩塊板之間的海綿由于長(zhǎng)期使用變得很薄。當(dāng)按照陰極-海棉-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿依次放好后兩塊板不能壓緊，因而在膠和膜之間可能存在潛在的間隙，電轉(zhuǎn)移時(shí)蛋白從膠和膜之間的空隙中流走，形成如圖所示的

39、形狀。我僅使用十幾張普通的草紙墊在兩塊海棉之間，條帶就變得非常的漂亮。這也是在大家的幫助下共同發(fā)現(xiàn)的。想到我求助時(shí)各位熱心的幫助，因此在原文下加上了本人最終解決問(wèn)題的方法，這是對(duì)大家的感激，也希望更多實(shí)驗(yàn)中遇到困惑的同事們能從中得到啟迪。一個(gè)小小的失誤的確是很讓人頭疼得哦，讓我們都變得細(xì)心起來(lái)。而且便宜的東西不一定不好，nc雖比不上pvdf轉(zhuǎn)染效率高，用的好一樣能達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康摹＿@對(duì)像我一樣的窮學(xué)生，比較有鼓勵(lì)性吧，呵呵。再次感謝各位 3. 看樣子是濕轉(zhuǎn)，注意幾點(diǎn)：1.換為PVDF膜 2.記住, 電轉(zhuǎn)液必須有甲醇.3. 用PVDF電轉(zhuǎn)前要在甲醇中泡3-5分鐘.NC膜則不能在純甲醇中泡

40、,否則會(huì)溶解.4.4度冷卻很重要.5 轉(zhuǎn)膜后一般膠上都會(huì)有剩,關(guān)鍵是膜上的蛋白是否理想,對(duì)初學(xué)者一定要用麗春紅染色,如不理想就不用往下做了.5. 注意濾紙一定要剪的和膠一樣大小,兩快濾紙不能接觸,否則會(huì)短路.6. 建議貴實(shí)驗(yàn)室用Biorad 的半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng),都什么年代了,還用...呵呵 4. 一抗的稀釋比例是都不相同的，一般根據(jù)說(shuō)明書(shū)的推薦來(lái)做，有條件的可以做梯度稀釋?zhuān)鞒鲎约旱臈l件來(lái)。 一般稀釋范圍在1:100-1:5000, WB. 我做過(guò)的極限是1：500000 wb 就我的經(jīng)驗(yàn)看，就整個(gè)Western Blot來(lái)說(shuō)， 我覺(jué)得最關(guān)鍵的步驟在前面，1.制樣 2.電泳 3

41、.轉(zhuǎn)移 4. Block，其中1和3更為重要， 后面的步驟按照標(biāo)準(zhǔn)來(lái)就行了， 最多有一些小調(diào)整。 你們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中有問(wèn)題可問(wèn)， 越具體越好。我盡量解答 請(qǐng)教一下，半干轉(zhuǎn)是否要求膜，3m濾紙，膠同樣大?。? 因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn)，那樣會(huì)不會(huì)短路？ 什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？謝謝指點(diǎn) 答: 一般參照 膜>= 濾紙> 膠, 就行, 你轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路. 想請(qǐng)教Western的結(jié)果如何分析，一定要有內(nèi)參照嗎？ 答: 不一定,但是最好

42、能有Marker,我做的Western 都用了Marker 如果你做定量或辦定量，至少要用到一個(gè)光密度掃描分析軟件， 如果不是，直接分析就可以了 我的Western轉(zhuǎn)膜已經(jīng)成功了，但是Marker泳道未見(jiàn)蛋白條帶（正常應(yīng)該有6條） ，其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染膠，結(jié)果相同。經(jīng)5％的脫脂牛奶封閉1小時(shí)45分鐘后，進(jìn)行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過(guò)夜，二抗孵育5個(gè)半小時(shí)（1：2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出現(xiàn)非特異性條帶。請(qǐng)ptglab幫忙分析一下： 1、Marker是否有問(wèn)題？是MBI公司的，可分離14-11

43、6KD的蛋白，買(mǎi)了大概有一年的時(shí)間啦。 2、一抗（為多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時(shí)間是否合適？ 3、封閉的時(shí)間是否太短？ 答: 恭喜呀！ 1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它標(biāo)稱(chēng)的上樣量太少， 不夠， 我做過(guò)一個(gè)標(biāo)稱(chēng)每次5ul可我上了20ul才行的。 2.建議，一抗4度過(guò)夜也很好， 建議1:100,室溫2hrs就夠了， 3. 2抗室溫1小時(shí)，1:2000, 我喜歡4度封閉過(guò)夜（室溫2hr就夠了），1抗室溫1hr，2抗室溫1hr， 最好是一抗4度過(guò)夜（或室溫2小時(shí)）1:200，2抗室溫1小時(shí)1:2000， 換Ecl法. tracyzang wrote:

44、 如果不是顯色的問(wèn)題，那我如何分析呢？ 國(guó)外做的蛋白條帶很強(qiáng)。我買(mǎi)的是Santa Cruz的抗體，也實(shí)驗(yàn)過(guò)一抗和二抗肯定能結(jié)合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍(lán)染色沒(méi)問(wèn)題，但是不知道與Marker對(duì)應(yīng)的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時(shí)轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的較少。 難道是裂解液出了問(wèn)題？我用的是三去污劑，但沒(méi)加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細(xì)胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克?。ǖ诙妫┥系募訕觔uffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。 我真的不知道是哪里出了

45、問(wèn)題，幫幫忙吧！ 答: 我的建議： 1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測(cè)蛋白的濃度，一般來(lái)講，其濃度應(yīng)該在幾-20微克/微升。 2、若是蛋白沒(méi)問(wèn)題，哪就看是不是電泳的問(wèn)題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時(shí)左右。跑過(guò)積層膠與分離膠的線時(shí)，換用100V，3-4小時(shí)。 3、轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時(shí)，45分鐘足以。您所說(shuō)的大蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的，并不是真正的少，而是因?yàn)樵谔岬牡鞍字写蟮鞍妆旧砭秃苌佟Ｎ以?jīng)也轉(zhuǎn)過(guò)2小時(shí)，但和45分鐘的區(qū)別并不大。 4、根據(jù)MARKER的條帶（我

46、的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。 5、延長(zhǎng)1抗、2抗孵育時(shí)間（我曾室溫1小時(shí)，4度過(guò)夜），適當(dāng)加大1抗?jié)舛取? 6、我買(mǎi)的也是Santa Cruz的抗體，我覺(jué)得質(zhì)量還可以，我想您應(yīng)該先找其他方面的原因。 pVDF膜和NC膜都可以，一般質(zhì)量都行 6*8的膜我一般用到了2.5ml，膜可以用封口膜塑料袋封起來(lái)，這樣比較節(jié)約抗體，如果抗體非常珍貴，可以使用后回收（－70保存)， 如果你一張膜只加一種抗體，可以

47、在轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染一下，根據(jù)mark的位置對(duì)應(yīng)找到需要的蛋白所在的位置，這樣在以后的轉(zhuǎn)膜中可以將膠剪小，這樣比較省膜。 在電泳時(shí)，緩沖液最好和玻璃板上緣平齊，這樣條帶壓得要好一些的 to tracyzang： 1.電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。 電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時(shí)溴酚藍(lán)和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時(shí)間。建議你用恒壓80－100伏。 2.轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來(lái)了，當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問(wèn)題

48、應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。一抗我買(mǎi)的是單抗，推薦的稀釋度是1：100——1：1000。我用的是1：100。難道非要用多抗嗎？按道理單抗也應(yīng)該出條帶呀！ 做wb時(shí)理論上單抗也應(yīng)該有帶，但由于單抗識(shí)別抗原結(jié)構(gòu)的單一性，有時(shí)候?qū)τ诳乖哪承┙Y(jié)構(gòu)不識(shí)別，因而wb的結(jié)果有時(shí)候不好。 3.細(xì)胞用三去污劑裂解的，沒(méi)有做定量，加巰基乙醇變性后，每孔上樣20微升。提出的蛋白我保存在4度了，這樣行嗎？ 這個(gè)制樣步驟沒(méi)什么問(wèn)題。 請(qǐng)教1：是否WB實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參； 對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)最好加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。 2：發(fā)中華級(jí)文章要求結(jié)果用膠片還是膜照相相片，用掃描儀掃描

49、膜后沖印相片行不？； 國(guó)內(nèi)的文章要求不是很高，最好用的照片。當(dāng)然了這取決于你的照片的結(jié)果。 3：用BANDSCAN分析結(jié)果行嗎？ 分析一般的結(jié)果沒(méi)問(wèn)題。 4:蛋白定量后加多少u(mài)g總蛋白（全細(xì)胞總蛋白）合適？ 總蛋白量有個(gè)上限的， （具體的我忘了， ）但是最好不要超過(guò)150ug/well 我回公司后給你個(gè)具體的答復(fù)。 轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。 tris－h(huán)cl就是tris鹽用hcl調(diào)ph值，配置而成。 to:iamsunkai 對(duì)于第一個(gè)問(wèn)題：影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個(gè)因素： 1. 電壓，小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充

50、分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。 2. 膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。 第二，可以用， 2.0-3.0mA/cm2, 2hrs 第三，小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，會(huì)透過(guò)膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過(guò)去了。 對(duì)于第四個(gè)問(wèn)題，我想你是不是要問(wèn)：“我要檢測(cè)的抗原（蛋白）是160kd的，但是結(jié)果只有50kd的那條帶，同時(shí)，背景又相對(duì)來(lái)說(shuō)比較干凈，條帶比較清楚，想請(qǐng)你給我提點(diǎn)建議”，是嗎？ 首先分析你的

51、整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。我發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)比較大的毛病： 1. 一抗用TBST稀釋。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脫脂牛奶稀釋?zhuān)湍愕姆忾]液相一致，這樣可以降低背景。你大概也意識(shí)到了，？ 2. “biorad半干轉(zhuǎn)PDVF膜,15v轉(zhuǎn)30分鐘”，你是這么做的嗎？因?yàn)槲掖蟛糠謺r(shí)間是做的恒流轉(zhuǎn)移，用的是0.1mA/膜，100kd--200kd轉(zhuǎn)2小時(shí)。到最后電壓會(huì)升到20v左右。你用恒壓法，我不是很肯定你轉(zhuǎn)30分鐘能將大分子（160kd）的抗原轉(zhuǎn)上去。我建議你最好能將時(shí)間延長(zhǎng)，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒壓，可摸索一下，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。有時(shí)候你的marker也有可能欺騙你，因?yàn)閙arker的量比較

52、大，是很容易轉(zhuǎn)上去的，實(shí)際上目標(biāo)蛋白的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于marker量。 我對(duì)你的結(jié)果分析如下： 1. 你的結(jié)果很好，估計(jì)離目標(biāo)不遠(yuǎn)了，很快就可以成功。 2. 沒(méi)有160kd的帶是因?yàn)槟愕霓D(zhuǎn)移時(shí)間過(guò)短，適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間（我懷疑這是主要的問(wèn)題）。 3. 你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000， 背景會(huì)低一點(diǎn)。 shybird6011 wrote: ptglab:您好！ 最近我在做Western，但結(jié)果一直不理想，出來(lái)的只是淺淺的帶，甚至現(xiàn)在什么條帶也沒(méi)有了！我每次轉(zhuǎn)膜后都用了立春紅染色，出現(xiàn)的蛋白條帶還是很清晰，唯一的一點(diǎn)是在我需要的分子量附近并沒(méi)有很清晰的條帶出現(xiàn)，只是很

53、模糊的多條帶，是不是從這里就可以推斷出我的結(jié)果就會(huì)不理想！郁悶中，請(qǐng)您指教！?。。?！謝謝您 答: 不是的，因該沒(méi)有問(wèn)題，要知道大部分目的蛋白含量少因該是看不到的，只要你目的蛋白前后的蛋白轉(zhuǎn)移地都很好就可以了。 緊急求助?。?！我最近做了一次WB，結(jié)果很奇怪，背景是中棕色的，而轉(zhuǎn)上的蛋白帶是白色的，與正常顯色恰恰相反，我簡(jiǎn)直是哭笑不得。我買(mǎi)的一抗是單抗，ELISA要求1：4000-1：10000，我用的是1：4000，二抗ELISA要求1：4000-1：8000，我用的1：4000。第一次做時(shí)有目的帶，但是由于有雜帶，懷疑抗體加多了就將了一下濃度，結(jié)果出現(xiàn)了這么怪的問(wèn)題。請(qǐng)pt

54、glab 高手及其他同志幫幫在下。 答: WB所需抗體濃度應(yīng)按說(shuō)明書(shū)，一般為1：1000左右，有些適于做ELISA的抗體不一定適于做WB，一抗與二抗需配套使用，背景高可能是封閉不夠。 rainycloud wrote: 我目前研三在讀，但課題才剛剛完成模型和整體實(shí)驗(yàn)部分，接下來(lái)老板又要求采用Western－blot的方法對(duì)我所檢測(cè)的蛋白進(jìn)行半定量，真是一頭霧水,還請(qǐng)前輩千萬(wàn)多幫幫我，本人將不勝感激！ 1.我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？ 2.但我還是照著做了，結(jié)果是有的，但非常

55、不穩(wěn)定。有時(shí)條帶清晰，有時(shí)很散,不知為何？ 3.我原先采用的顯色方法是Ecl，但洗出來(lái)的片子有時(shí)很清晰，有時(shí)又非常糊，或者亂七八糟，不知這和轉(zhuǎn)膜時(shí)濾紙的厚度是否有關(guān)，或者是因?yàn)槲业臑V紙反復(fù)使用，影響了轉(zhuǎn)膜效果？至于洗膜我是非常注意的，一般采用10分鐘一次，洗三次，TBS。 4.接下來(lái)我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù)，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，不能再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？不知前輩是否有比較成熟的方案以供參考？ 答: １，上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)椋保埃担耍牡牡鞍自谏鲜鰞煞N

56、膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置． ２，可能:原因：樣品可能存在降解；轉(zhuǎn)膜不及時(shí)造成擴(kuò)散；轉(zhuǎn)移緩沖液甲醇濃度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％） ３，您指的模糊是說(shuō)背景高還是條帶模糊？ ４，不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼兀茫拢樱链鎽?yīng)該好一點(diǎn)． ptglab真不錯(cuò)，又有事求你老人家了。最近又試了兩次WESTERN ，結(jié)果在轉(zhuǎn)膜這步就卡住了。 我們用的濕式電轉(zhuǎn)移，一次是50V、12小時(shí)（轉(zhuǎn)移緩沖液中無(wú)甲醇）；麗春紅染色無(wú) 另一次120V、2小時(shí)（加了甲醇）。麗春紅染色MARKER有一條帶 兩次麗春紅染色幾乎沒(méi)有蛋白條帶（蛋白質(zhì)上樣應(yīng)沒(méi)問(wèn)題，膠用卡馬斯亮

57、藍(lán)染色有），轉(zhuǎn)移后的凝膠用卡馬斯亮藍(lán)染色也無(wú)條帶。蛋白質(zhì)跑哪里去了？ 難道轉(zhuǎn)過(guò)頭了嗎？ 我曾經(jīng)用第一種條件轉(zhuǎn)出來(lái)過(guò)，難道緩沖液有問(wèn)題？ 我的問(wèn)題是：1，是否必須有麗春紅染出較為明顯條帶才能進(jìn)行下一步？ 2，我的分子量是30KD，用濕式電轉(zhuǎn)移槽（北京六一）轉(zhuǎn)移條件以那種方式最好？ 先謝謝各位的帖子，摸索條件太費(fèi)勁，如能借各位經(jīng)驗(yàn)少走彎路就好了。 答: to caimingc， 你可以用在第一種緩沖液里加20％甲醇，然后36V 5-15hrs。30KD就可以上去了。 另外，你用的PVDF膜用甲醇活化的吧？你的電極方向沒(méi)有反吧 western blot的個(gè)人總結(jié)zz 1.

58、 WESTERN BLOT電轉(zhuǎn)膜時(shí)間與分子量大小有關(guān)，即大分子量的需要轉(zhuǎn)印時(shí)間長(zhǎng)些，才能轉(zhuǎn)到NC膜上去。小分子量的需要轉(zhuǎn)印時(shí)間短些。 我們用BIO-RAD電轉(zhuǎn)膜儀，30-80KD蛋白需要恒電流350毫安，70分鐘。15-30KD蛋白需要恒電流200毫安60分鐘。大于80KD蛋白需要恒電流350毫安120分鐘。同時(shí)電泳緩沖液要經(jīng)常更換。條件你要摸素，好運(yùn)?。。? 2. 每次做western blot 都遇到這個(gè)現(xiàn)象 膠上的蛋白條帶 很好 但轉(zhuǎn)膜后總是出現(xiàn)這種情況，麗春紅染色后發(fā)現(xiàn)蛋白條帶總是出現(xiàn)流水樣飄走了.我用濕式轉(zhuǎn)移 bio-rad 冰水 100伏 100分鐘 nc 膜 應(yīng)該不是

59、氣泡,轉(zhuǎn)膜液沒(méi)問(wèn)題 請(qǐng)高手分析 首先多謝各位高手相助，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，原來(lái)并不是轉(zhuǎn)膜時(shí)間和電壓的問(wèn)題，也不是nc膜像各位說(shuō)的那樣比較差。原因真的是非常簡(jiǎn)單，只是因?yàn)槲覀兊霓D(zhuǎn)膜儀使用時(shí)間太長(zhǎng)，兩塊板之間的海綿由于長(zhǎng)期使用變得很薄。當(dāng)按照陰極-海棉-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿依次放好后兩塊板不能壓緊，因而在膠和膜之間可能存在潛在的間隙，電轉(zhuǎn)移時(shí)蛋白從膠和膜之間的空隙中流走，形成如圖所示的形狀。我僅使用十幾張普通的草紙墊在兩塊海棉之間，條帶就變得非常的漂亮。這也是在大家的幫助下共同發(fā)現(xiàn)的。想到我求助時(shí)各位熱心的幫助，因此在原文下加上了本人最終解決問(wèn)題的方法，這是對(duì)大家的感激，也希望更多實(shí)驗(yàn)中遇

60、到困惑的同事們能從中得到啟迪。一個(gè)小小的失誤的確是很讓人頭疼得哦，讓我們都變得細(xì)心起來(lái)。而且便宜的東西不一定不好，nc雖比不上pvdf轉(zhuǎn)染效率高，用的好一樣能達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?。這對(duì)像我一樣的窮學(xué)生，比較有鼓勵(lì)性吧，呵呵。再次感謝各位 3. 看樣子是濕轉(zhuǎn)，注意幾點(diǎn)：1.換為PVDF膜 2.記住, 電轉(zhuǎn)液必須有甲醇.3. 用PVDF電轉(zhuǎn)前要在甲醇中泡3-5分鐘.NC膜則不能在純甲醇中泡,否則會(huì)溶解.4.4度冷卻很重要.5 轉(zhuǎn)膜后一般膠上都會(huì)有剩,關(guān)鍵是膜上的蛋白是否理想,對(duì)初學(xué)者一定要用麗春紅染色,如不理想就不用往下做了.5. 注意濾紙一定要剪的和膠一樣大小,兩快濾紙不能接觸,否則會(huì)短路.

61、6. 建議貴實(shí)驗(yàn)室用Biorad 的半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng),都什么年代了,還用...呵呵 4. 一抗的稀釋比例是都不相同的，一般根據(jù)說(shuō)明書(shū)的推薦來(lái)做，有條件的可以做梯度稀釋?zhuān)鞒鲎约旱臈l件來(lái)。 一般稀釋范圍在1:100-1:5000, WB. 我做過(guò)的極限是1：500000 wb 就我的經(jīng)驗(yàn)看，就整個(gè)Western Blot來(lái)說(shuō)， 我覺(jué)得最關(guān)鍵的步驟在前面，1.制樣 2.電泳 3.轉(zhuǎn)移 4. Block，其中1和3更為重要， 后面的步驟按照標(biāo)準(zhǔn)來(lái)就行了， 最多有一些小調(diào)整。 你們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中有問(wèn)題可問(wèn)， 越具體越好。我盡量解答 請(qǐng)教一下，半干轉(zhuǎn)是否要求膜，3m濾紙，膠同樣大小？

62、 因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn)，那樣會(huì)不會(huì)短路？ 什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？謝謝指點(diǎn) 答: 一般參照 膜>= 濾紙> 膠, 就行, 你轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路. 想請(qǐng)教Western的結(jié)果如何分析，一定要有內(nèi)參照嗎？ 答: 不一定,但是最好能有Marker,我做的Western 都用了Marker 如果你做定量或辦定量，至少要用到一個(gè)光密度掃描分析軟件， 如果不是，直接分析就可以了 我的Western轉(zhuǎn)膜已經(jīng)成功了，但

63、是Marker泳道未見(jiàn)蛋白條帶（正常應(yīng)該有6條） ，其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染膠，結(jié)果相同。經(jīng)5％的脫脂牛奶封閉1小時(shí)45分鐘后，進(jìn)行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過(guò)夜，二抗孵育5個(gè)半小時(shí)（1：2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出現(xiàn)非特異性條帶。請(qǐng)ptglab幫忙分析一下： 1、Marker是否有問(wèn)題？是MBI公司的，可分離14-116KD的蛋白，買(mǎi)了大概有一年的時(shí)間啦。 2、一抗（為多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時(shí)間是否合適？ 3、封閉的時(shí)間是否太短？ 答: 恭喜呀！ 1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它標(biāo)稱(chēng)的上

64、樣量太少， 不夠， 我做過(guò)一個(gè)標(biāo)稱(chēng)每次5ul可我上了20ul才行的。 2.建議，一抗4度過(guò)夜也很好， 建議1:100,室溫2hrs就夠了， 3. 2抗室溫1小時(shí)，1:2000, 我喜歡4度封閉過(guò)夜（室溫2hr就夠了），1抗室溫1hr，2抗室溫1hr， 最好是一抗4度過(guò)夜（或室溫2小時(shí)）1:200，2抗室溫1小時(shí)1:2000， 換Ecl法. tracyzang wrote: 如果不是顯色的問(wèn)題，那我如何分析呢？ 國(guó)外做的蛋白條帶很強(qiáng)。我買(mǎi)的是Santa Cruz的抗體，也實(shí)驗(yàn)過(guò)一抗和二抗肯定能結(jié)合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍(lán)染色沒(méi)問(wèn)題，但是不知道與Mark

65、er對(duì)應(yīng)的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時(shí)轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的較少。 難道是裂解液出了問(wèn)題？我用的是三去污劑，但沒(méi)加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細(xì)胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克隆（第二版）上的加樣buffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。 我真的不知道是哪里出了問(wèn)題，幫幫忙吧！ 答: 我的建議： 1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測(cè)蛋白的濃度，一般來(lái)講，其濃度應(yīng)該在幾-20微克/微升。 2、若是蛋白沒(méi)問(wèn)題，哪就看是不是電泳的問(wèn)

66、題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時(shí)左右。跑過(guò)積層膠與分離膠的線時(shí)，換用100V，3-4小時(shí)。 3、轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時(shí)，45分鐘足以。您所說(shuō)的大蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的，并不是真正的少，而是因?yàn)樵谔岬牡鞍字写蟮鞍妆旧砭秃苌佟Ｎ以?jīng)也轉(zhuǎn)過(guò)2小時(shí)，但和45分鐘的區(qū)別并不大。 4、根據(jù)MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。 5、延長(zhǎng)1抗、2抗孵育時(shí)間（我曾室溫1小時(shí)，4度過(guò)夜），適當(dāng)加大1抗?jié)舛取? 6、我買(mǎi)的也是Santa Cruz的抗體，我覺(jué)得質(zhì)量還可以，我想您應(yīng)該先找其他方面的原因。 pVDF膜和NC膜都可以，一般質(zhì)量都行 6*8的膜我一般用到了2.5ml，膜可以用封口膜塑料袋封起來(lái)，這樣比較節(jié)約抗體，如果抗體非常珍貴，可以使用后回收（－70保存)， 如果你一張膜只加一種抗體，可以在轉(zhuǎn)膜后