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1、Ⅰ型糖尿病自身抗體檢測(cè),,糖尿病的分型診斷的進(jìn)展,1979年WHO提出了原發(fā)性臨床糖尿病分為胰島素依賴型和非胰島素依賴型，依賴型與非依賴型的區(qū)別主要依據(jù)胰島素β細(xì)胞功能受損的程度，臨床上是否依賴胰島素而言，并不反映其發(fā)病本質(zhì) 1997年WHO建議取消依賴型與非依賴型，改為1、2型。 1、2型的區(qū)別要看病因是否由胰島β細(xì)胞自身免疫破壞造成，1型與2型是完全不同的兩類疾病，但2型非依賴型可發(fā)展成1型胰島素依賴型，成人緩慢進(jìn)展型就經(jīng)歷了這個(gè)過程。,WHO （1997年）建議的糖尿病 分型方案,1型糖尿?。═1DM） 胰島β細(xì)胞破壞導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏：A.免疫型；B.特發(fā)型 2型糖尿?。═2DM） 胰

2、島素抵抗為主體的胰島素相對(duì)缺乏，或胰島素分泌受損為主體的胰島素抵抗 其他特殊類型糖尿病 妊娠期糖尿病,1型糖尿病的流行病學(xué),主要見于15歲以前的兒童和未成年人； 亞洲及我國(guó)發(fā)病率相對(duì)較低（我國(guó)兒童中的發(fā)病率為0.59/10萬(wàn)每年，全國(guó)T1DM的總數(shù)至少200-400萬(wàn)） 各國(guó)的1型糖尿病較以前有逐年增加趨勢(shì)； 不少地區(qū)的1型糖尿病的發(fā)病率與季節(jié)有關(guān),1型糖尿病的發(fā)病機(jī)制,遺傳易感性 環(huán)境因素 感染、飲食、地理、氣候 β細(xì)胞自身免疫損傷 β細(xì)胞破壞、功能損害 胰島素分泌缺乏,,,,,1型糖尿病的病程,,,,,,,,,,β細(xì)胞量,1型糖尿

3、病的病程,遺傳易感性,環(huán)境因素 胰島素正常 自身抗體陽(yáng)性 血糖正常,胰島素↓ 血糖正常 應(yīng)激血糖↑,胰島素↓↓ 血糖↑,80% β細(xì)胞破壞 胰島素缺乏 臨床糖尿病,1型糖尿病和2型糖尿病的比較,1型糖尿病和2型糖尿病的區(qū)分,一般<30歲，起病急，中到重度癥狀 明顯體重下降，消瘦，尿酮或DKA 空腹或餐后C肽低下 免疫標(biāo)記物(GADA,ICA,IA-2) 是 否 T1DM T2DM,,,,,免疫介導(dǎo)型1型糖尿病亞型的特征,抗胰島細(xì)胞抗體(ICA),1974年Bottazzo采用間接免疫熒光法在胰島素依賴性

4、糖尿病患者血清中首次檢測(cè)到抗胰島細(xì)胞抗體（islet cell autoantibodies, ICA）。 ICA是針對(duì)胰島細(xì)胞內(nèi)多種抗原的一組抗體,其靶抗原至今尚未完全闡明。,,與糖尿病相關(guān)的自身抗原不僅在β細(xì)胞表達(dá)，這些抗原的組織分布可分為： (1) β細(xì)胞特異的，如胰島素； (2)胰島細(xì)胞特異的； (3)神經(jīng)內(nèi)分泌特異的，如分子量為65 kD的谷氨酸脫羧酶（GAD65kD）、ICA512、神經(jīng)節(jié)苷脂（ganglioside）、腦硫脂（sulfatides）等； (4)較廣泛的分布，如HSP62等。 目前所知的ICA主要抗原的是谷氨酸脫羧酶（GAD）和酪氨酸磷酸酶（IA2）,

5、檢測(cè)方法： 間接免疫熒光法 組織化學(xué)染色法 免疫沉淀化學(xué)法 ELISA法,,,目前ICA的檢測(cè)方法主要是以猴胰腺為基質(zhì)的間接免疫熒光法，但易受組織的固定方法的影響。 抗胰島細(xì)胞抗體與胰腺的內(nèi)分泌部位反應(yīng)，可見所有胰島細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)均質(zhì)到顆粒型熒光。,檢測(cè)方法的標(biāo)化： 1983年瑞典的Ludvigsson為一名1型糖尿病新發(fā)病者做了血漿置換,這份血漿在青少年糖尿病基金會(huì)(FDA)組織的ICAs定標(biāo)實(shí)驗(yàn)中,在參加這項(xiàng)工作的所有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)均為ICAs陽(yáng)性,于是用這份血樣定出了ICAs的JDF單位,并逐漸成為國(guó)際上較為通用的單位。,,敏感度 81 %(44 %～100 %) ，特異度 9

6、6 %(64 %～100 %) 特異度較GADA和IA2A差 ICA可作為早期預(yù)測(cè)指標(biāo) 能早于T1DM發(fā)病8年前被檢測(cè)出 高滴度的ICA（大于20-40JDF單位）預(yù)示疾病進(jìn)展的高危險(xiǎn)性。 大部分T1DM病人的ICAs在發(fā)病2年后消失，ICA持續(xù)陽(yáng)性超過2~3年者，僅占T1DM的10%。 ICA滴度的持續(xù)高水平通常與β細(xì)胞的損傷有關(guān)，ICA的水平與C肽水平呈負(fù)相關(guān)。 ICA和其他胰島自身抗體（如GAD或IAA）同時(shí)陽(yáng)性對(duì)疾病更有診斷價(jià)值，這類病人發(fā)生T1DM的危險(xiǎn)性是僅ICA陽(yáng)性的病人的3-5倍。,,ICA在不同人群中的陽(yáng)性率,ICA的檢測(cè)對(duì)1型糖尿病有很好的預(yù)測(cè)價(jià)值,谷氨酸脫羧酶抗體(GA

7、D-Ab),谷氨酸脫羧酶 γ氨基丁酸（GABA）的合成酶 表達(dá)于人腦及胰島中均有，主要位于細(xì)胞漿中 具有抑制生長(zhǎng)抑素和胰高糖素分泌的作用，并可調(diào)節(jié)胰島素的分泌和胰島素原的合成,1990年，Beakkeskov首次證明GAD是1型糖尿病的自身抗原 GAD分子存在65kD和67kD兩種形式，兩者在氨基酸水平上有65%的同源性和80%的相似性，免疫源性也基本相同，目前認(rèn)為T1DM中抗GAD65抗體更常見,,檢測(cè)方法： 免疫沉淀酶活性法 放射免疫法 ELISA法 間接免疫熒光法 化學(xué)發(fā)光法,,,最常用的GAD-Ab的檢測(cè)方法是ELISA法和放免法。 放免法由于存在放射性污染目前已逐漸被ELI

8、SA法替代 ELISA法采用親和素和生物素?cái)U(kuò)大級(jí)聯(lián)反應(yīng)增強(qiáng)了檢測(cè)的敏感性,,,,,,,,,,,,,,,,,,GAD檢測(cè)方法的評(píng)價(jià),GAD 自身抗體:41 個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定了血清GADab ,其中多數(shù)運(yùn)用重組人GAD 的RIA法,其調(diào)整敏感性是0～91 %(平均81 %) 。ELISA 法與RIAs 法比較,有較好效果,其調(diào)整敏感性77 % ,雙管測(cè)定的陽(yáng)性或陰性一致性為100 %。 在125例血清RIA法的陽(yáng)性率為22.4%， ELISA的陽(yáng)性率為26.4%， 兩者的顯著相關(guān)（P=0.025)。均 與ICA顯著相關(guān)P值分別為0和0.01。 說明ELISA法可以替代RIA法做為1型糖尿病自身抗體篩選

9、的有效手段。 （RIA試劑——?dú)W蒙公司 ； ELISA試劑——美國(guó)BLOMERICA 公司）,GAD在T1DM發(fā)病機(jī)理中的作用,分子模擬(molecular mimicry) 機(jī)制致病學(xué)說： 病毒蛋白如柯薩奇B 病毒p2C 蛋白肽段, 胰島β細(xì)胞抗原分子谷氨酸脫羧酶(GAD) 的部分肽段序列相似,前者(外源性蛋白多肽) 在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫的同時(shí),亦可能誘發(fā)針對(duì)自身胰島β細(xì)胞的攻擊，導(dǎo)致β細(xì)胞的損傷。,GAD-Ab具有與β細(xì)胞緩慢損傷相關(guān)性好、出現(xiàn)早、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、年齡跨度大、陽(yáng)性率高、檢測(cè)易標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，是目前公認(rèn)的診斷LADA及預(yù)測(cè)胰島功能的免疫學(xué)指標(biāo) GAD-Ab可于發(fā)病前10年測(cè)出，且

10、在此期間呈高低度持續(xù)存在，約80%新發(fā)患者血清中GAD陽(yáng)性且水平較穩(wěn)定，病程10年以上仍存在高滴度GAD抗體 。,GAD的臨床應(yīng)用,GAD抗體在大多數(shù)T1DM患者中陽(yáng)性，且陽(yáng)性率不隨病程延長(zhǎng)而下降。 實(shí)驗(yàn)顯示新診斷的患兒中GAD抗體陽(yáng)性率為74%，長(zhǎng)病程者為67%，而他們的ICA陽(yáng)性率分別為64%和14%。 如在初發(fā)T1DM患者中查到GAD抗體有助于排除T2DM，以助于DM診斷分型并指導(dǎo)治療。 在T1DM一級(jí)親屬（高危人群）， 33.3% 的GADA陽(yáng)性者可能患TIDM。 TIDM一級(jí)親屬中GAD抗體陽(yáng)性率為15%左右，其中1/3在6~18個(gè)月后發(fā)展為T1DM。 GADA在僵人綜合征（SMS

11、）中的陽(yáng)性率為100%, 此外還見于與T1DM相關(guān)的多腺體自身免疫綜合征。,GAD在不同人群中的陽(yáng)性率,,抗酪氨酸磷酸酶抗體(ICA 512/IA 2ab),ICA 512/IA 2是利用1型糖尿病患者或其前期病人的血清免疫篩選胰島細(xì)胞的cDNA文庫(kù)得到的一個(gè)新的β細(xì)胞自身抗原。 其氨基酸序列與T淋巴細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)CD45相似，而堿基序列與人胰島素瘤克隆的 cDNA (IA2)相近。Northern印跡示ICA 512/IA 2在胰島、腦和垂體中均有表達(dá)。 Rabin等發(fā)現(xiàn)ICA512實(shí)際上是ICA的一個(gè)片段。,IA2A存在于大約65%（55%-75%）的新發(fā)T1DM病人中，而

12、正常對(duì)照人群中陽(yáng)性率小于1%。 IA-2Ab 特異性強(qiáng),在不伴1型DM的自身免疫病患者中較少發(fā)現(xiàn)。 T1DM患者中IA2A陽(yáng)性率可能受多種因素影響，15歲以上T1DM者IA2A陽(yáng)性率最高，隨增齡陽(yáng)性率逐漸下降，但其發(fā)生率與DGA抗體無關(guān)。 攜帶IA-2抗體的個(gè)體在5歲時(shí)患Ⅰ型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)是34歲時(shí)的11倍。,檢測(cè)方法 酶聯(lián)免疫吸附分析法( ELISA) 放射配體分析法(RLA) 35S標(biāo)記的放射免疫沉淀法,,抗胰島素自身抗體(IAA),IAA的識(shí)別的抗原表位是胰島素A鏈的A8-A13殘基和B鏈的B1-B3殘基 IAA與逆轉(zhuǎn)錄病毒的p73蛋白間存在交叉反應(yīng)，提示內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染與T1DM

13、的發(fā)生有關(guān) IAA與胰島素治療誘導(dǎo)的抗胰島素抗體相似,IAA在新診斷的T1DM患者中的陽(yáng)性率為40%，多見于兒童（≤4歲），在成人中的陽(yáng)性率僅為4%，在5歲以前發(fā)生的IAA陽(yáng)性率達(dá)50%，IAA滴度隨增齡而降 IAA與ICA相關(guān)，在高危人群中約40%ICA陽(yáng)性者IAA陽(yáng)性。 IAA水平與T1DM發(fā)生的速度呈相關(guān)性，高滴度IAA者發(fā)病較快,,檢測(cè)方法 放免法；ELISA法 不同實(shí)驗(yàn)室及不同方法測(cè)定IAAs,結(jié)果的一致性顯著低于IA2A和GADAs。,,自身抗體對(duì)T1DM的診斷 敏感性和特異性,,T1DM患者中胰島自身抗體的陽(yáng)性率常因種族、發(fā)病年齡、病程和臨床亞型不同而不同。單一的自身抗體的

14、檢測(cè)缺乏最佳的敏感性和特異性，目前常采用多項(xiàng)自身抗體的聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)T1DM的診斷準(zhǔn)確性更高 IA2－Ab 聯(lián)合GAD－Ab 及IAA 兩種以上抗體陽(yáng)性具有68 %的陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值, 80 %敏感性和100 %特異性。,預(yù)測(cè)率最高的組合是ICA加IA-2A和（或）IA-2β抗體。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)采用兩步篩查法，即先篩查IA-2A和（或）GAD抗體，然后篩查IAA和（或）ICA，對(duì)糖尿病的預(yù)測(cè)敏感度最高 。 另有人認(rèn)為ICA的檢測(cè)缺乏穩(wěn)定性，通常所用的間接免疫熒光法僅能做到半定量，而推薦使用IA22Ab 聯(lián)合GAD2Ab 及IAA的篩選組合。 近來,國(guó)外還建立了一種GAD-Ab 和IA2-Ab 一步性

15、聯(lián)合檢測(cè)法。其結(jié)果與GAD-Ab、IA2-Ab 分別檢測(cè)結(jié)果高度一致。此法簡(jiǎn)單高效、成本低、重復(fù)性好,并可用毛細(xì)血管血作為標(biāo)本,適于在一般人群特別是少兒中進(jìn)行普查。,,,胰島細(xì)胞 自身抗體的組合 預(yù)測(cè)Ⅰ型糖尿病,跟蹤的年數(shù),糖尿病的發(fā)病率,Progression to Diabetes vs Number of Autoantibodies (GAD, ICA512, Insulin),Percent not Diabetic,Years of Follow-up,3 Ab n = 41 17 8 1 2 Abs n = 44 27 15 4 2 1

16、 1 Abs n = 93 23 14 10 6 4,Verge et al. Diabetes, 1996;45;926,Gestational Diabetes: Risk at 2 years Type 1 Diabetes by Autoantibodies ICA, GAD65, ICA512(IA-2),Sensitivity GAD=63%; Sensitivity 3 Abs=82% Ziegler et al. Diabetes 1997: 46:1459-67, N=437,Progression,Insulin GAD IA-2,,A. Ziegler,First antibody is insulin/proinsulin,,10,,8,,6,,4,,2,,0,,8,,6,,4,,2,,0,,,,,,,IAA,,,,10,,8,,6,,4,,2,,0,,8,,6,,4,,2,,0,,,,,,,,Age (years),Cumulative frequency (%),A. Ziegler,,