《5.2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《5.2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段（26頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、1 1.DNA.DNA的基本單位的基本單位五碳糖五碳糖磷酸基團磷酸基團羥基羥基3，端端5，端端ATGCATGC5，端（含磷酸基團）端（含磷酸基團）3，端（含羥基）端（含羥基）3，端端5，端端2.2.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈的形成3.DNA3.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)4.4.復制過程復制過程參與的組分參與的組分在在DNADNA復制中的作用復制中的作用解旋酶解旋酶打開打開DNA雙鏈雙鏈DNA母鏈母鏈提供提供DNA復制的模板復制的模板4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸合成子鏈的原料合成子鏈的原料DNA聚合酶聚合酶引物引物使使DNA聚合酶能夠從引物的聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸

2、端開始連接脫氧核苷酸催化合成催化合成DNA子鏈子鏈DNADNA聚合酶的特性聚合酶的特性 DNA DNA聚合酶不能從頭開始合聚合酶不能從頭開始合成成DNADNA，而只能從，而只能從3 3端延伸端延伸DNADNA鏈。鏈。因此，因此，DNADNA復制需要引物。復制需要引物。小資料：小資料：引物是一小段引物是一小段DNA或或RNA，它能與，它能與DNA母鏈母鏈的一段堿基序列互補配對。用于的一段堿基序列互補配對。用于PCR的引物長度通常為的引物長度通常為2030個核苷酸。個核苷酸。3553因此，因此，DNA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的5，端向端向3，端延伸。端延伸。4.4.復制過程復制過

3、程 是一種體外迅速擴增是一種體外迅速擴增DNADNA片段的技術(shù)，片段的技術(shù)，它能以極少量的它能以極少量的DNADNA為模板，在幾小時內(nèi)復為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的制出上百萬份的DNADNA拷貝?？截悺＿z傳疾病的診斷、刑偵破案、古生遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和物學、基因克隆和DNADNA序列測定。序列測定。解旋酶（解旋酶（打開打開DNA雙鏈）雙鏈）DNADNA母鏈（母鏈（模板）模板）4 4種脫氧核苷酸（種脫氧核苷酸（合成子鏈原料）合成子鏈原料）DNADNA聚合酶（聚合酶（催化子鏈合成）催化子鏈合成）引物引物（RNA）（）（使使DNA聚合酶能聚合酶能從引物從引物3端開始連

4、接脫氧核苷酸）端開始連接脫氧核苷酸）自主閱讀自主閱讀P59，并，并思考：思考：體外擴增體外擴增DNADNA，需要怎樣環(huán)境？，需要怎樣環(huán)境？變性變性（80-100）TaqTaq聚合酶（耐高溫）聚合酶（耐高溫）20203030個核苷酸構(gòu)個核苷酸構(gòu)成成DNADNADNADNA母鏈母鏈4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸緩沖溶液，控制溫度緩沖溶液，控制溫度 DNA雙鏈雙鏈單鏈單鏈變性（加熱變性（加熱80-100）復性（緩慢冷卻）復性（緩慢冷卻）變性的目的：變性的目的：復性的目的：復性的目的：解開雙鏈解開雙鏈有利于引物與兩條單鏈結(jié)合有利于引物與兩條單鏈結(jié)合 在在80100 的溫度范圍內(nèi)，的溫度范圍內(nèi)，DNAD

5、NA的雙螺旋的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性變性PCRPCR技技術(shù)總術(shù)總結(jié)結(jié) 利用利用DNA分子的熱變性原理，通過控制分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DNA分子的擴增。分子的擴增。四種脫氧核苷酸、耐熱四種脫氧核苷酸、耐熱的的DNADNA聚合酶、聚合酶、引物、引物、DNA DNA模板模板、緩沖溶液和控制溫度的溫緩沖溶液和控制溫度的溫控設備?？卦O備。子鏈的子鏈的5端向端向 3端延伸端延伸5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物變性變性95oC復性復性55oC延伸延伸72

6、oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次復制第二次復制第一次復制第一次復制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 每次循環(huán)分為：每次循環(huán)分為：PCRPCR的反應過程總結(jié)的反應過程總結(jié)變性變性 復性復性延伸延伸PCR的反應結(jié)果的反應結(jié)果（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液移液）（3）蓋嚴蓋嚴離心管口的蓋子，用手指離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊輕輕彈擊管壁（管壁（混合混合）（4）將微量離心管放在離心機）

7、將微量離心管放在離心機上上離心約離心約10s（離心離心）（5）將離心管放入）將離心管放入PCR儀上，設置好儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序（儀的循環(huán)程序（反應反應）三、三、結(jié)果分析與評價結(jié)果分析與評價練習鞏固練習鞏固1、關于、關于PCR技術(shù)的應用，錯誤的一項是技術(shù)的應用，錯誤的一項是A 古生物學、刑偵破案、古生物學、刑偵破案、DNA序列測定序列測定B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學C DNA序列測定、基因克隆、刑偵破案序列測定、基因克隆、刑偵破案D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定序列測定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向

8、的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點是技術(shù)最突出的優(yōu)點是A 原理簡單原理簡單 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐熱性聚合酶有耐熱性D 快速、高效、靈活、易于操作快速、高效、靈活、易于操作從子鏈的從子鏈的5端向端向3端延伸端延伸4、做、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進行的關鍵步驟沖液及蒸餾水使用前必須進行的關鍵步驟是是A 反復洗滌反復洗滌 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高壓滅菌高壓滅菌 D 在在20 儲存儲存體內(nèi)體內(nèi)DNA復制與復制與PCR的技術(shù)區(qū)別：的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復制體內(nèi)復制P

9、CRPCR技術(shù)技術(shù)解旋解旋在解旋酶作用下，細在解旋酶作用下，細胞提供胞提供ATPATP，部分解開，部分解開加熱到加熱到9494o oC,C,雙鏈全雙鏈全部解開，不需解旋酶部解開，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶細胞自身的細胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高溫）（不耐高溫）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶復制特點復制特點半保留復制，邊解旋半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。邊復制，多起點復制。半保留復制，完全解半保留復制，完全解旋后復制，從模板鏈旋后復制，從模板鏈的一端開始復制。的一端開始復制。復制的方向復制的方向 子鏈的子鏈的55端向端向 3 3端端延伸延伸子鏈的子鏈的55端向端向 3 3端延伸端延伸課堂小結(jié)課堂小結(jié)多聚酶鏈式反應擴增多聚酶鏈式反應擴增DNA片段片段PCR原理原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響的變性和復性受溫度影響PCR過程過程變性變性復性復性延伸延伸操作步驟操作步驟配制配制PCR反應體系反應體系移入離心管移入離心管放入放入PCR設置工作參數(shù)設置工作參數(shù)DNA擴增擴增測定含量測定含量稀釋稀釋調(diào)零調(diào)零測定并讀數(shù)測定并讀數(shù)計算計算