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1、,細菌內(nèi)毒素檢查,2010.12,,目錄,1、實驗原理 2、實驗試劑 3、試驗器具 4、檢查方法概述 5、供試品溶液的制備 6、內(nèi)毒素限值的確定 7、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定 8、鱟試劑靈敏度復(fù)核 9、干擾試驗 10、供試品的細菌內(nèi)毒素檢查,,實驗原理,利用鱟試劑與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。 陽性結(jié)果,,細菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。,,實驗試劑,鱟試劑 從海洋無脊椎動物“鱟”的藍色血液中提取的變形細胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥精制而成的生物制劑。 鱟試劑的生物活性以其能檢出細菌內(nèi)毒素的最低有效濃度表示，即鱟試劑的靈敏度

2、，單位為EU/ml。,當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。,,實驗試劑,細菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品 系自大腸埃希菌提取精制得到的內(nèi)毒素，用于標(biāo)定細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)定，仲裁鱟試劑靈敏度。,細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 系以細菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。 細菌內(nèi)毒素檢查用水 指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。,,試驗器具,刻度吸管、凝集管（1075mm）、三角瓶、小試管（16100mm）、試管架、洗耳

3、球、封口膜或金屬試管帽、時鐘、脫脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。 耐熱器皿常用干熱滅菌法（250、30 分鐘以上）去除，塑料用具應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械（目前多為無熱原的一次性用品 ）。,,檢查方法概述,凝膠法 限量試驗 半定量試驗 光度測定法 濁度法（終點濁度法和動態(tài)濁度法） 顯色基質(zhì)法（終點顯色法和動態(tài)顯色法） 凝膠法：最簡單、經(jīng)濟、應(yīng)用最廣泛，中國藥典的“仲裁”方法 對干擾相對不敏感。 較光度測定法不靈敏,,供試品溶液的制備,某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。 一般要求供試品溶液的pH 值在6.08.0 的范圍內(nèi)。 可使用酸、堿溶液或適宜的

4、緩沖液調(diào)節(jié)pH 值。,,內(nèi)毒素限值的確定,一般按公式： L=K/M 式中 L 為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性單位）表示。 K 為人每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量。注射劑K=5EU/（kgh），放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kgh），鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kgh）。 M 為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，依據(jù)藥品使用說明書，臨床用藥須知確定。 例：某產(chǎn)品M為14.3mg/kg，L=5/14.3=0.35EU/mg 假如此產(chǎn)品的濃度為100mg/ml，那么， L=0.35100=35EU/ml,,最大有效稀釋倍數(shù)的確定

5、,最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 指在試驗中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。 MVD=cL/ 式中L 為供試品的細菌內(nèi)毒素限值；c 為供試品溶液的濃度，當(dāng)L 以EU/ml 表示時，則c 等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg 或EU/U 表示時，c 的單位需為mg/ml 或U/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD 取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度c=/L；為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml）。,,鱟試劑靈敏度復(fù)核,目的 考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確、考察檢驗人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規(guī)定。 當(dāng)使用新批號的鱟試劑或

6、試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。,細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)備 1、取細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（或國家標(biāo)準(zhǔn)品）一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。,,鱟試劑靈敏度復(fù)核,2、按照標(biāo)準(zhǔn)品說明書，加入規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置漩渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即 2、、0.5和0.25（為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度）四個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30 秒鐘。,示例 某待復(fù)核鱟試劑的靈敏

7、度標(biāo)示值為0.25EU/ml，細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格為150 EU/ml，將細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，再稀釋制備成濃度為0.50 EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml和0.06EU/ml的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。,,鱟試劑靈敏度復(fù)核,細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備圖示：,,鱟試劑靈敏度復(fù)核,待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備 取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑18支，每支加入0.1ml檢查用水使溶解備用（規(guī)格大于 0.1ml支的鱟試劑，按其標(biāo)示量加入細菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶后按0.1ml/管分裝到凝聚管中，至少準(zhǔn)備18管）。,加樣 將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管

8、架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。其中4支4列分別加入0.1ml的2、、0.5和0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。,,鱟試劑靈敏度復(fù)核,加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，垂直放入371恒溫器中，保溫602分鐘。 結(jié)果觀察 將試管輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性，未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。,陽性,陰性,,鱟試劑靈敏度復(fù)核,計算 當(dāng)最大濃度2管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照為陰性時實驗為有效，按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的

9、復(fù)核結(jié)果。 c=lg-1（X/4） 式中 X 為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。 反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。,,鱟試劑靈敏度復(fù)核,例子： 結(jié)果判斷 當(dāng)c 在0.52（包括0.5和2）時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。,,干擾實驗,目的 確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。 當(dāng)進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。 當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須

10、進行干擾試驗。,,干擾實驗,進行干擾試驗一般步驟 供試品限值確定 根據(jù)鱟試劑的靈敏度確定MVD范圍（供試品溶液濃度范圍） 預(yù)試驗（初篩試驗）確定樣品最大不干擾濃度 正式干擾試驗 干擾實驗預(yù)實驗 目的 初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實驗提供依據(jù),避免干擾試驗的盲目性。,,干擾實驗,操作方法 1、將無可檢測到內(nèi)毒素的供試品進行一系列倍數(shù)的稀釋，但最大的稀釋倍數(shù)不得超過MVD=CL/0.03（0.03EU/ml為現(xiàn)今我國市售鱟試劑的最高靈敏度）。 2、使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗。

11、每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度）。另取2支細菌內(nèi)毒素檢查用水作陰性對照，2支加入2濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對照。 例 制備稀釋倍數(shù)為4的供試品陽性對照溶液：0.3ml4.0EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液+0.3ml稀釋倍數(shù)為2的供試品稀釋液0.6ml含2EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋倍數(shù)為4的供試品稀釋液 3、保溫602分鐘，觀察并記錄結(jié)果。,,干擾實驗,4、當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗有效。當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋

12、倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)進行正式干擾實驗。 5、當(dāng)系列濃度中所有濃度的供試品管都不為陰性，或供試品陽性對照不為陽性時，說明供試品對內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)存在干擾，則應(yīng)對供試品進行更大稀釋倍數(shù)（不得超過MVD=CL/0.03 ），或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。 6、當(dāng)供試品的內(nèi)毒素限值單位為EU/mg或EU/U活性單位時，應(yīng)將最小不干擾稀釋倍數(shù)換算成最大不干擾濃度（即稀釋倍數(shù)下溶液的濃度），以mg/ml或活性單位/ml表示。,,干擾實驗,舉例 某注射液限值為2.5EU/ml，按MVDCL/計算出靈敏度為0.03EU/ml下的MVD為83倍，將供試品溶液進行一

13、系列稀釋，用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑預(yù)實驗，結(jié)果如下：,,由以上結(jié)果可初步確定該樣品的最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，可在此濃度下進行正式干擾試驗。,,干擾實驗,正式干擾實驗 制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液 取1支細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2、、0.5、0.25。 制備含內(nèi)毒素的供試品溶液 將供試品稀釋至預(yù)實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將同支細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個濃度即2、、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。 鱟試劑的準(zhǔn)備 取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，備用。,,干擾實驗,加樣 準(zhǔn)備好的36支鱟試劑放在試管架上，按

14、下圖加樣。,0.1ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液,0.1ml檢查用水,0.1ml含內(nèi)毒素的供試品液,0.1ml供試品液,加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，放入371恒溫器中，保溫602分鐘，觀察并記錄結(jié)果。,,干擾實驗,實驗結(jié)果計算 如兩組最大濃度2.0均為陽性，最低濃度0.25均為陰性，陰性對照4管均為陰性時，按下式計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）。 Es=lg-1（Xs/4） Et=lg-1（Xt/4） 式中 Xs、Xt 分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶

15、液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。,,干擾實驗,當(dāng)Es 在0.52（包括0.和2）及Et 在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）時，則認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用，可在該濃度下對此供試品進行細菌內(nèi)毒素檢查。 當(dāng)Et不在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）時，則認(rèn)為供試品在該濃度下干擾實驗。應(yīng)使用適宜方法排除干擾，如可將供試品進行更大倍數(shù)稀釋（不超過MVD ）。 建立新品種細菌內(nèi)毒素檢查方法時，每個廠家至少取三個批號的供試品。用兩個以上鱟試劑生產(chǎn)廠家的鱟試劑進行干擾實驗。,,供試品細菌內(nèi)毒素檢查,在細菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時每次實驗必

16、須做2支陽性對照和2支陰性對照。 供試品溶液的制備 根據(jù)內(nèi)毒素限度值，計算MVD=CL/。然后將供試品進行稀釋，其稀釋倍數(shù)不得超過MVD。 一般稀釋至MVD；如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗要求的第二濃度作為日常檢查濃度。 陽性對照溶液的制備 用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。,,供試品細菌內(nèi)毒素檢查,供試品陽性對照溶液的制備 用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。 陰性對照 即細菌內(nèi)毒素檢查用水。 鱟試劑的準(zhǔn)備 取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支，每支加入0.1ml檢查用水使溶解備用。 加樣 8支管中2支加入0.ml供試品溶液

17、或其稀釋液作為供試品管，2支加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管，2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管,2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管。 將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘。,,供試品細菌內(nèi)毒素檢查,結(jié)果判斷 當(dāng)陽性對照都為陽性、供試品陽性對照都為陽性且陰性對照都為陰性時，實驗方有效。 若供試品2管均為陰性，認(rèn)為該供試品符合規(guī)定；如供試品2管均為均為陽性，應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定；如2管中1管陽性，1管陰性，則另取4支供試品管復(fù)試，4管中如有1管為陽性，即認(rèn)為不符合規(guī)定。若第一次實驗時供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而結(jié)果出現(xiàn)2管均為陽性或2管中1管為陽性時，按同樣方法復(fù)試，復(fù)試時要求將稀釋至MVD。,,供試品細菌內(nèi)毒素檢查,例 某葡萄糖注射液，其內(nèi)毒素限值為0.5EU/ml，設(shè)所用鱟試劑的靈敏度為0.125EU/ml。 MVD=CL/=0.5/0.125=4 將樣品進行4倍稀釋，并做4倍稀釋下的供試品陽性對照。,,,結(jié)束，謝謝！,