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1、第4章 蛋白質(zhì)、氨基酸含量的檢測(cè) 主要內(nèi)容 第一節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法 第二節(jié) 氨基氮含量的檢測(cè)方法 第三節(jié) 多種氨基酸的分離和測(cè)定 第四節(jié) 味精純度的測(cè)定方法,第一節(jié) 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,一、蛋白質(zhì)概況 蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測(cè)定總氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量。,具體測(cè)定方法 （一）凱氏定氮法最常用的，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用普遍 （GB/T5009.52008 第一法）。 （二）分光光度

2、法（GB/T5009.52008 第二法） （三）電位滴定法 （四）雙縮脲反應(yīng) （五）杜馬斯燃燒法(SN/T2115-2008) 進(jìn)出口食品和飼料中總氮及粗蛋白的檢測(cè)方法杜馬斯燃燒法,,二 、 蛋白質(zhì)含量的定量測(cè)定 一些蛋白質(zhì)的含氮量一般為 15%-17.6%， 有的上下浮動(dòng) 可以測(cè)出總氮 N,（一）凱氏定氮法 丹麥化學(xué)家Johan Kieldahl （克達(dá)爾）(1849-1900)研制了今天人所共知的分析有機(jī)物中氮含量的凱氏法。于1883年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法及改良凱氏法。只介紹前三種。,= N6.25 = 蛋白質(zhì)含量,丹麥分析化學(xué)家。1849年生于亞格普里斯,1900

3、年7月18日卒于齊斯維勒萊厄。 1873年在哥本哈根大學(xué)畢業(yè)后,做過(guò)農(nóng)業(yè)中學(xué)的教師。1875年任卡爾斯堡研究所化學(xué)部負(fù)責(zé)人,1876年任所長(zhǎng),在研究所工作近20年。他是丹麥皇家科學(xué)院院士,1884年哥本哈根大學(xué)授予他名譽(yù)博士學(xué)位。他主要研究發(fā)酵化學(xué)。1883年發(fā)明測(cè)定有機(jī)化合物中氮含量的方法:他將一定質(zhì)量的試樣與硫酸作用,使試樣中的氮全部轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@,然后往硫酸銨溶液中加入堿,再將生成的氨蒸餾到一定體積的標(biāo)準(zhǔn)酸溶液中,再滴定過(guò)量的酸,就能測(cè)出試樣的含氮量。此法普遍用于化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和藥物工業(yè)。后人稱此法為克氏定氮法。此法所用的儀器是一種梨形長(zhǎng)頸燒瓶,容量通常約300毫升,微量分析用的

4、可以小到10毫升,后人稱這種燒瓶為克氏燒瓶。,常量凱氏定氮法,1. 原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。 用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。 也可以用過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定過(guò)量的酸。,整個(gè)過(guò)程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定,、消化 總反應(yīng)式：,（1）加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)， 純硫酸沸點(diǎn) 340，加入硫酸鉀之后可以提高 至400以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提 高沸點(diǎn)，但效果

5、不如硫酸鉀。,（2） 加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做蒸餾時(shí)堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。,（3）加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī) 物氧化速度。,右圖為消化裝置,、蒸餾 消化液 + 400g/L氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。,、 吸收與滴定 （1）用20g/L硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅溴甲酚綠混合指示劑）或亞甲基藍(lán)甲基紅。 指示劑 紫紅色 亮綠色 暗灰色 （酸） （堿） （酸） 2NH3 + 4H3BO3 =（NH4）2B4O7 + 5H2O （NH4）2B4O7 + 2HCl

6、+ 5H2O = 2NH4Cl + 4H3BO3 或（2）用過(guò)量的 H2SO4 或 HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過(guò)剩的酸液。,,,吸收,滴定,結(jié)果計(jì)算： 蛋白質(zhì)（%）= 100 注意：F氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為 6.25，玉米、高粱為6.24，大豆及其制品為5.71，大麥為5.83。 說(shuō)明： 整個(gè)消化過(guò)程要在通風(fēng)櫥進(jìn)行。 消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無(wú)硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。 消化時(shí)，作空白試驗(yàn)。,, 消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消

7、化完全。,當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過(guò)氧化氫 2-3 mL 后再繼續(xù)加熱消化。 一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。,蒸餾裝置不能漏氣。 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。, 蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。 硼酸吸收液的溫度不能超過(guò)40。 混合指示劑在pH5.2時(shí)為紫紅色， pH5.4時(shí)

8、為暗灰色， pH5.6時(shí)為亮綠色， 變色點(diǎn)為pH5.4，指示劑變色范圍很窄，靈敏度高。,微量凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、與常量法不同點(diǎn)： 加入硼酸量由50 ml 10 ml, 滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 常量法全量蒸餾，微量法少部分蒸餾。 微量法用微量滴定管滴定。 3、蒸餾裝置下圖 。,,,,,,問(wèn)題：用微量凱氏定氮法測(cè)定一樣品的蛋白質(zhì)含量時(shí)，測(cè)定結(jié)果比實(shí)際值偏低，試分析其可能的原因？ 應(yīng)用實(shí)例： 1、醬油中全氮含量的測(cè)定 2、乳與乳制品中非蛋白氮含量的測(cè)定（ GB/T 21704-2008） 3、麥芽中庫(kù)爾巴哈值;蛋白質(zhì)區(qū)分 （1）庫(kù)爾巴哈值

9、：制麥過(guò)程中蛋白質(zhì)的溶解度，用可溶性氮占總氮的比值表示。 （2）啤酒中蛋白質(zhì)區(qū)分,自動(dòng)凱氏定氮法,1、原理及適用范圍: 同前 2、特點(diǎn)： （1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。 （2）快速：一次可同時(shí)消化8-24個(gè)樣品。 （3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，幾分鐘完成1個(gè)樣。,福斯2300,（二）分光光度法（乙酰丙酮比色法） 1、原理 （1）樣品消化 硫酸銨。 （2）在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中，銨與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。 （3）在波長(zhǎng)400n

10、m處測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。 （4）結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。 2、方法特點(diǎn) （1）操作簡(jiǎn)便 （2）適合大批量樣品蛋白質(zhì)的測(cè)定,,（三）電位滴定法 1、原理 （1）樣品消化 硫酸銨。 （2）中和樣品至pH8.2。 （3）4 NH4 + +6HCHO (CH2)6N4+2H+ +6H2O （4）2H+ +OH- H2O 2、方法特點(diǎn),,,,（四）雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有環(huán)境污染。 新開(kāi)發(fā)的：雙縮脲法（由農(nóng)業(yè)部于2008.10.20發(fā)布并實(shí)施） 適合于乳與乳制品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。,,1.原理 脲（尿素）N

11、H2CONH2 加熱至150160時(shí)，兩分子縮合成雙縮脲。,,雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)合物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)） 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵 CONH 與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)其吸光度，確定含量。（540nm）,NH2CONHCONH2 + NH3,2.應(yīng)用 乳與乳制品中蛋白質(zhì)的測(cè)定 雙縮脲比色法（NY/T 1678-2008）,（五） 杜馬斯燃燒法 1、原理 待測(cè)樣本在純氧（99.99%）環(huán)境中高溫燃燒，將其所含的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化成氮的氧化物后被還原劑還原成氮?dú)?。最后，用TCD檢測(cè)

12、器檢測(cè)氮?dú)夂?，?jì)算蛋白質(zhì)含量。 2、特點(diǎn)：杜馬斯燃燒法不僅能夠在46分鐘內(nèi)準(zhǔn)確地測(cè)定出樣品的總氮含量，而且還能測(cè)定出凱氏法所不能測(cè)定的硝態(tài)氮。還能減少對(duì)環(huán)境的污染以及對(duì)人類健康的危害。,第二節(jié) 氨基氮含量的檢測(cè)方法,一、甲醛滴定法 1.原理：氨基酸本身既有堿性 NH2，又有 酸性 COOH ，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與 NH2 結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來(lái)滴定 COOH 基。,2特點(diǎn)：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氨基氮量，其發(fā)酵過(guò)程中氨基氮量減少情況等（適于游離氨基酸的測(cè)定） 。 3、應(yīng)用實(shí)例 釀造醬油（GB18186-2000 ）氨基氮含量的測(cè)定 （1）試劑 a) 甲醛溶液：374

13、0； b) 0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液 （2）分析步驟,吸取5.0mL樣品，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0mL，置于200mL燒杯中，加水60mL水，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液c(NaOH)=0.05mol/L滴定至酸度計(jì)指示pH8.2記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05mol/L）的毫升數(shù)，可計(jì)算總酸含量。 加入10.0mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05mol/L）繼續(xù)滴定至pH9.2, 記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05mol/L）的毫升數(shù)。 同時(shí)取80mL水，先用氫氧化鈉溶液（0.05mol/L）調(diào)節(jié)pH為8.2，再

14、加入10.0mL甲醛溶液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05mol/L）滴定至pH=9.2，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。,二、茚三酮比色法 1、 原理：茚三酮與樣品中的-氨基氮反應(yīng)，得到還原茚三酮，再與氨和未還原的茚三酮反應(yīng)，生成藍(lán)紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與-氨基氮含量成正比。在570nm下，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中的-氨基氮含量。,,2、操作過(guò)程 （1）取7支試管并編號(hào)，于0號(hào)試管中加入蒸餾水2.00 mL，于1、2、3號(hào)試管中分別加入樣液2.00 mL，4、5、6號(hào)試管中分別加入甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液2.00 mL。 （2）7支試管中各加入發(fā)色劑1.00 mL，混勻，蓋塞，將試管放入沸水浴中，準(zhǔn)確加熱16mi

15、n， （3）在20水浴中冷卻20min。再各加入碘酸鉀稀釋溶液5.00 mL，充分搖勻。 （4）用空白液管調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，于570nm波長(zhǎng)下，測(cè)量吸光度。,3、計(jì)算 4、應(yīng)用 啤酒生產(chǎn)中：麥汁、麥芽中-氨基氮的測(cè)定,,,第三節(jié) 多種氨基酸的分離和測(cè)定,一、氨基酸自動(dòng)分析儀法 原理： 1、使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（聚苯乙烯經(jīng)交聯(lián)再磺化）在色譜柱進(jìn)行分離； 2、洗脫下來(lái)的氨基酸可用茚三酮顯色，從而定量各種氨基酸。,10-3,二、HPLC,第四節(jié) 味精純度的測(cè)定方法,GB/T8967-2007,分析方法 1、高氯酸非水溶液滴定法 原理：在乙酸存在下，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定樣品中的谷氨酸鈉，以電位滴定法

16、確定其終點(diǎn)，或以-萘酚苯基甲醇為指示劑，滴定溶液至綠色為終點(diǎn)。 2、旋光法,本章復(fù)習(xí)題,1、為什么凱氏定氮法測(cè)定出的蛋白質(zhì)含量為粗蛋白含量？ 2、凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理及所用試劑的作用？ 3、用微量凱氏定氮法測(cè)定一樣品的蛋白質(zhì)含量時(shí)，測(cè)定結(jié)果比實(shí)際值偏低，試分析其可能的原因？ 4、試述粗蛋白質(zhì)測(cè)定中，樣品消化過(guò)程中必須注意的事項(xiàng)？ 5、試比較凱氏定氮法與其他幾種常用蛋白質(zhì)定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)？ 6、說(shuō)明甲醛滴定法測(cè)定氨基氮的原理及操作要點(diǎn)？ 7、雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)原理？ 8、味精純度的測(cè)定方法有哪些？,作業(yè)題 1、常用的樣品預(yù)處理方法有哪些？其中有機(jī)物破壞法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？ 2、試述藍(lán)-愛(ài)儂法測(cè)定葡萄酒中總糖的原理及注意事項(xiàng)？ 3、用微量凱氏定氮法測(cè)定一樣品的蛋白質(zhì)含量時(shí)，測(cè)定結(jié)果比實(shí)際值偏低，試分析其可能的原因？,