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1、基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因的檢測(cè)與鑒定,,,（一）目的基因的提取,目的基因：主要是指___________________ 。 獲取方法： 1、____________中獲取目的基因 2、 PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA 2、人工合成法：如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。,基本操作步驟,從基因文庫(kù),編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,,從基因文庫(kù)中獲取目的基因,什么是基因文庫(kù)？ 什么是基因組文庫(kù)？ 什么是部分基因文庫(kù)？ 怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因？ 目的基因的有關(guān)信息與什么相聯(lián)系？,,1.從基因

2、文庫(kù)中獲取目的基因,基因文庫(kù)： 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。,基因文庫(kù),,基因組文庫(kù),部分基因文庫(kù) （如cDNA文庫(kù)）,一種生物所有的基因,一種生物的一部分基因,,基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程,基因組文庫(kù),,目的基因的mRNA,單鏈DNA (cDNA）,雙鏈DNA (即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,,,1）反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,目的基因,推測(cè),推測(cè),化學(xué)合

3、成,,,,2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,cDNA：,,,,,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),,,外顯子,內(nèi)含子,終止子,基因的結(jié)構(gòu),啟動(dòng)子,原核,真核,,,一個(gè)典型的原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖,編碼區(qū):組成基因的核苷酸序列可以分為不同的區(qū)段,有的區(qū)段能夠轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的信使RNA，進(jìn)而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，這樣的區(qū)段叫做編碼區(qū)。,,,非編碼區(qū)：有的區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，也就是說(shuō)不能編碼蛋白質(zhì)，這樣的區(qū)段叫做非編碼區(qū)。,,一個(gè)典型的真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖,真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的主要特點(diǎn)是： 編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的。,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子， 一般不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列

4、叫做內(nèi)含子。,,,2.PCR技術(shù)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（體外）,原理： 前提： 條件：,PCR擴(kuò)增儀,DNA雙鏈復(fù)制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四種脫氧核苷酸（dNTP）,一對(duì)引物,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的兩條鏈為模板,溫度控制,方式：,以_____形式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,,過(guò)程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA 退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合 延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈,,需要提供合成模板； 合成的方向都是53。 DNA聚合酶

5、不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3-OH；,,,1.目的基因DNA受熱變性，解鏈； 2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合； 3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。,,,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,,胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較：,高溫變性,Taq DNA聚合酶,DNA母鏈,dNTP,3個(gè)溫度,DNA或RNA,,1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作 的名詞及對(duì)應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是,2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫(kù)中提取 從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成 A. B. C. D.,,3、在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的DNA

6、分子片段為ATGTGTACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物 溫度變化 恒溫 A B C D,4、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌呤脫氧核苷酸是460個(gè)）放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是 A.540個(gè) B.8100個(gè) C.17280個(gè)D.7560個(gè),,消耗的脫氧核苷酸數(shù) 設(shè)親代DNA分子中含有某種脫氧核苷酸數(shù) m個(gè)，則： (1)經(jīng)過(guò)n次復(fù)制，共需要消耗游離的該脫氧核苷

7、酸數(shù)： (2)在第n次復(fù)制時(shí)，共需要消耗游離的該脫氧核苷酸數(shù)：,m (2n-1),m 2n-1,,（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心,,質(zhì)粒,DNA分子,,,,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA 連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,,同一種 限制酶,目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。,,（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。 （2）用_______________切斷目的基因，使其產(chǎn)生 ____________。,（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，

8、形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA連接酶,重組質(zhì)粒形成過(guò)程:,,科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。 然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。,資 料:,基因表達(dá)載體構(gòu)建,,基因表達(dá)載體的組成：,目的：使目的基因在受體細(xì)胞中

9、穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合部位,位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄,檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞， 篩選出含目的基因的受體細(xì)胞,,1、（多選）一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括 A目的基因 B啟動(dòng)子 C終止子 D標(biāo)記基因,ABCD,2、下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是 A啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼 B啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用 C標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選 D基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別,A,3、目前轉(zhuǎn)基因工程可

10、以 A. 打破地理隔離但不能突破生殖隔離 B. 打破生殖隔離但不能突破地理隔離 C. 完全突破地理隔離和生殖隔離 D. 部分突破地理隔離和生殖隔離,C,,,(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,常用的受體細(xì)胞：,動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,轉(zhuǎn)化,目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),,導(dǎo)入植物 細(xì)胞：,（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,導(dǎo)入動(dòng)物 細(xì)胞：,導(dǎo)入微生物細(xì)胞：,受體細(xì)胞 導(dǎo)入方法,體細(xì)胞 受精卵,受精卵,顯微注射法,Ca2處理法,,1、將

11、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點(diǎn):,,能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無(wú)感染能力,Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上,,轉(zhuǎn)化過(guò)程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,植物細(xì)胞,植物細(xì)胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,,（2）基因槍法,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,,（3）花粉通道法,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通

12、道進(jìn)入受體細(xì)胞。,,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,,方法:,顯微注射技術(shù),操作程序:,提純含目的基因表達(dá)載體,取受精卵,顯微注射,移植到子宮,,受精卵發(fā)育,,新性狀動(dòng)物,,,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過(guò)程：,Ca2+處理大腸桿菌,,感受態(tài)細(xì)胞,,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,增大細(xì)胞壁的通透性,,1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是 A結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便 B繁殖速度快 C遺傳物質(zhì)含量少、簡(jiǎn)單 D性狀穩(wěn)定、變異少 2、基因工程常用的受體細(xì)胞有 大

13、腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動(dòng)植物細(xì)胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 A.人工合成基因 B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá),C,,4. 采用基因工程的方法培育抗蟲(chóng)棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng) A B C D,C,5. 下列屬于基

14、因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管道法 顯微注射法 胚胎移植 DNA分子雜交法 A B C D,C,,目的基因是否插入轉(zhuǎn)基 因生物染色體的DNA上,（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定,目的基因是否表達(dá)：,目的基因是否轉(zhuǎn)錄：,鑒定,抗蟲(chóng)性鑒定、抗病性鑒定、生物活性鑒定等（生理、性狀水平的檢測(cè)）,,檢測(cè),,知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開(kāi)，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,,,,基因工程概念解讀：,基因重組,體外,基因

15、,DNA分子水平,剪切拼接導(dǎo)入表達(dá),新的生物類型和生物產(chǎn)品,密碼子的通用性：生物界共用一套相同的密碼子,基本單位相同 結(jié)構(gòu)相同堿基配對(duì)方式相同,安全性問(wèn)題：生物安全、食品安全、環(huán)境安全,轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉,打破生殖隔離定向改造生物時(shí)間短,,1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是 A結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便 B繁殖速度快 C遺傳物質(zhì)含量少、簡(jiǎn)單 D性狀穩(wěn)定、變異少 2、基因工程常用的受體細(xì)胞有 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動(dòng)植物細(xì)胞 A B C D,B,D,2、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 A.人工合成基因

16、 B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá),C,,3. 采用基因工程的方法培育抗蟲(chóng)棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng) A B C D,C,4. 下列屬于基因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管道法 顯微注射法 胚胎移植 DNA分子雜交法 A B C D,C,,5、應(yīng)用基因工程技術(shù)診斷疾病的過(guò)程中必須使用基因

17、探針才能達(dá)到檢測(cè)疾病的目的。這里的基因探針是 A用于檢測(cè)疾病的醫(yī)療器械 B用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子 C合成-珠蛋白的DNA D合成苯丙羥化酶的DNA片段,,6.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè) C增加質(zhì)粒分子的分子量 D便于與外源基因連接 7. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的 C質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,,8.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分( ) A.啟動(dòng)子 B.終止密碼 C.標(biāo)記基因 D.目的基因 9.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法( ) A基因槍法 B顯微注射法 C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D花粉管通道法,,10）（多選）人們利用基因工程的方法，用大腸桿菌生產(chǎn)人類胰島素，這一過(guò)程涉及到（ ） A.用適當(dāng)?shù)拿笇?duì)胰島素基因與運(yùn)載體進(jìn)行切割并連接 B.把重組后的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增 C.檢測(cè)重組DNA分子是否導(dǎo)入受體細(xì)菌內(nèi)并表達(dá)出性狀 D.篩選出能產(chǎn)生胰島素的“工程菌”,ABCD,,