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1、 成纖維生長(zhǎng)因子-21通過激活A(yù)MPK–SIRT1–PGC-1α信號(hào)通路調(diào)節(jié)能量代謝 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21已經(jīng)被證實(shí)是一種潛在的代謝調(diào)節(jié)因子。對(duì)經(jīng)飲食誘導(dǎo)或遺傳的肥胖的糖尿病嚙齒類和恒河猴施用重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21后，其表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗高血糖和降低甘油三酯并減輕體重的作用。盡管成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21在調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)和能量平衡中發(fā)揮了重要的作用，但是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子作為一種代謝調(diào)節(jié)因子的作用機(jī)制仍然不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)證明了，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21是通過激活A(yù)MP激活蛋白激酶(AMPK)和SIRT1，從而增強(qiáng)了線粒體的氧化能力，對(duì)脂肪組織細(xì)胞進(jìn)行能量平衡的調(diào)節(jié)的。FGF-

2、21作用于來(lái)自O(shè)B/OB小鼠的脂肪細(xì)胞和白色脂肪組織都增強(qiáng)了AMPK的磷酸化水平。FGF-21的應(yīng)用增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)的NAD+水平，從而激活了SIRT1及對(duì)其下游的靶位點(diǎn)進(jìn)行了脫乙酰基作用，過氧化物酶體增殖子激活受體-γ輔助因子-1α (PGC-1α)和第3位組氨酸。FGF-21作用脂肪細(xì)胞后激活了AMPK和SIRT1，進(jìn)而增強(qiáng)了線粒體氧化能力，表現(xiàn)為耗氧量、檸檬酸合成酶的活性的增加，以及誘導(dǎo)關(guān)鍵代謝基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。FGF-21增強(qiáng)線粒體功能的能力需要絲氨酸-蘇氨酸激酶11 (STK11/LKB1)，STK11/LKB1可以激活A(yù)MPK .抑制了AMPK,SIRT1和PGC- 1α的活性，F(xiàn)G

3、F-21對(duì)氧耗和基因表達(dá)的影響降低了，這表明FGF-21的調(diào)節(jié)線粒體功能和增加氧化能力是通過依賴AMPK–SIRT1–PGC1α信號(hào)通路的這一機(jī)制在脂肪細(xì)胞細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的。 AMP激活蛋白激酶（AMPK）是一個(gè)主要能量代謝效應(yīng)器和主要的代謝平衡的調(diào)節(jié)因子。LKB1，一種絲蘇氨酸激酶，是激活A(yù)MPK的主要調(diào)節(jié)因子。LKB1直接對(duì)AMPK的第172位的蘇氨酸進(jìn)行磷酸化進(jìn)而激活A(yù)MPK激酶的活力。LKB1的表達(dá)是由運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的，它作為肝臟中葡萄糖生成的關(guān)鍵介質(zhì)之一。最近，AMPK被指出，其在治療二型糖尿病及代謝綜合癥的基本療法中，如二甲雙胍、噻唑啉二酮類、運(yùn)動(dòng)等發(fā)揮了重要作用。AMPK的激活，開啟

4、了分解代謝通路，增強(qiáng)氧化代謝和線粒體的生物合成，從而維持了能量平衡。最近，AMPK被發(fā)現(xiàn)通過增加細(xì)胞內(nèi)NAD+ 水平來(lái)增強(qiáng)NAD+依賴的三型脫乙酰化酶SIRT1的活性，從而調(diào)節(jié)SIRT1下游靶位點(diǎn)的基因的活性。 SIRT1在哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)代謝功能和延長(zhǎng)壽命中起到了重要作用。SIRT1的激活同樣利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇性利用和通過增強(qiáng)線粒體氧化功能調(diào)節(jié)能量平衡。AMPK 和SIRT1通過協(xié)同作用，對(duì)線粒體生物合成，PGC-1α進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)的刺激后的能量平衡。PGC-1α通過與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用來(lái)刺激線粒體的代謝調(diào)節(jié)能力。 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21已經(jīng)被證實(shí)是一種潛在的

5、代謝調(diào)節(jié)因子。對(duì)經(jīng)飲食誘導(dǎo)或遺傳的肥胖的糖尿病嚙齒類和恒河猴施用重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21后，其表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗高血糖和降低甘油三酯并減輕體重的作用。最近研究表明，β-klotho,是一種與klotho相似的單次跨膜蛋白，最為一種FGF-21的信號(hào)的輔助受體因子來(lái)發(fā)揮其作用。由于β-klotho在FGF-21信號(hào)中，作為一種關(guān)鍵的輔助因子，所以它的表達(dá)使得FGF-21僅在肝臟、胰臟和脂肪細(xì)胞組織中特異性表達(dá)，因?yàn)棣?klotho主要在這些部位表達(dá)。 最近，F(xiàn)GF-21在肝臟中的作用已被證實(shí)，F(xiàn)GF-21在饑餓中對(duì)能量平衡起到了重要的調(diào)節(jié)作用。FGF-21可通過禁食誘導(dǎo)表達(dá)。在禁食中，肝

6、臟中脂肪氧化、甘油三酯的清除及生酮代謝中，都需要FGF-21的存在。盡管，F(xiàn)GF-21在肝臟代謝調(diào)節(jié)中起到了重要的作用，但是我們對(duì)于其在脂肪組織中所起到的作用還知道的很少。此外，F(xiàn)GF-21在調(diào)節(jié)葡萄糖和能力平衡中的作用機(jī)制，我們?nèi)匀徊磺宄? 這里我們證明了FGF-21是在脂肪細(xì)胞中，通過LKB1激活來(lái)調(diào)節(jié)AMPK和SIRT1的活性來(lái)調(diào)節(jié)能量消耗的。FGF-21改變了細(xì)胞內(nèi)NAD+的水平，導(dǎo)致SIRT1的激活，其下游靶基因的脫乙?；碢GC-1α and histone 3 (H3)。這些關(guān)鍵代謝效應(yīng)器的激活，導(dǎo)致了線粒體氧化功能的增加，從而闡明了FGF-21在代謝調(diào)節(jié)中的作用。 結(jié)果

7、 FGF-21增強(qiáng)了AMPK 的活性 為了深入研究FGF-21調(diào)節(jié)能量消耗的作用機(jī)制，我們用FGF-21 (4.0 μg/mL)處理3T3-L1細(xì)胞3天，通過Western blot來(lái)分析被激活的AMPK的水平。FGF-21的作用，使磷酸化的AMPK增加了53% (P < 0.05; n = 3),但是AMPK總蛋白(t-AMPK)的水平始終沒有改變(Fig. 1A).有趣的是，F(xiàn)GF-21 (4.0 μg/mL for 3 d)作用于分化的人的脂肪細(xì)胞后，使得p-AMPK (P < 0.05;n = 3)有了很大的增加（58%），但是t-AMPK的水平?jīng)]有改變(Fig. 1B).。對(duì)

8、人脂肪細(xì)胞用腺病毒過表達(dá)AMPK的alpha2 亞單位的副結(jié)構(gòu)域(DN-AMPK)抑制AMPK的活性，消除了FGF-21刺激P-AMPK的增加(Fig. 1B)。 Fig.1.FGF-21增強(qiáng)了AMPK的活性。（A和B）Western blot 和（A）用FGF21 (4.0 μg/mL)處理3天的3T3-L1細(xì)胞中P-AMPK的定量和（B）用FGF21 (4.0 μg/mL)處理3天的人的脂肪細(xì)胞中P-AMPK的定量。數(shù)據(jù)是三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值。（C和D）是Western blot和在WAT中（C）p-AMPK和（D）p-ACC，空白對(duì)照組，F(xiàn)GF-21處理組，對(duì)照處理組中，n = 8

9、 animals/group. *P < 0.05 (Student’s t test). **P < 0.01. 為了探索FGF-21在體內(nèi)是否增加AMPK的活性，我們用滲透泵連續(xù)的給ob/ob小鼠灌注重組人FGF-21蛋白來(lái)兩周。與以前的報(bào)告一致，F(xiàn)GF-21的作用導(dǎo)致了總體重的顯著降低 (Fig. S1A),這與10到14天中少量但是顯著的攝食量下降伴隨著發(fā)生(Fig. S1B)。身體和組織的組成測(cè)定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-21處理后的動(dòng)物體中，總的身體中的脂肪的質(zhì)量和肝臟脂肪的含量都有明顯的下降(Fig. S1C).我們分析對(duì)照組和FGF-21實(shí)驗(yàn)組老鼠體內(nèi)的WAT中的P-AMPK的含量時(shí)，F(xiàn)

10、GF-21實(shí)驗(yàn)組老鼠體內(nèi)的WAT中的P-AMPK的含量增加了53%，表明增加了AMPK的激活(Fig. 1C).這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，F(xiàn)GF-21通過激活A(yù)MPK來(lái)調(diào)節(jié)能量消耗。 為了確定FGF-21的作用是否不依賴于體重，我們做了對(duì)照飼養(yǎng)研究實(shí)驗(yàn)來(lái)比較對(duì)照組和FGF-21處理組的體重。與之前的研究一致，F(xiàn)GF-21處理的老鼠未禁食的血糖水平被明顯降低，而對(duì)照組則沒有(Fig. S1D).。一個(gè)口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)GF-21處理后可明顯提高葡萄糖的耐受(Fig. S1E)并且降低至曲線下的區(qū)域?yàn)?5% (Fig. S1F).重要的是，F(xiàn)GF-21處理組動(dòng)物的p-AMPK的水平增加了53%，但是

11、在對(duì)照組中則沒有(Fig. 1C).此外，F(xiàn)GF-21處理的動(dòng)物的P-ACC的水平增加了（66%）,它是AMPK下游的一個(gè)靶基因(Fig. 1D).這些數(shù)據(jù)表明FGF-21可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)AMPK的激酶的活性。這些結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)GF-21對(duì)能量平衡的影響與AMPK激活是對(duì)立的改變體重的。 FGF-21增加NAD+新城代謝和SIRT1的活性 現(xiàn)在，已經(jīng)被證明，AMPK直接通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)NAD+/NADH的水平來(lái)直接激活SIRT1(8).因?yàn)镕GF-21增加AMPK的活性，我們猜測(cè)FGF-21是否能改變胞內(nèi)NAD+/NADH的水平。與我們的假設(shè)一致，F(xiàn)GF-21分別使3T3-L1細(xì)胞和人脂肪細(xì)

12、胞中的NAD+/NADH增加了48% (P < 0.05;n = 3) 和52% (P < 0.05, n = 3) (Fig. 2 A and C).重要的是，NAD+/NADH的水平，在FGF-21處理的ob/ob的WAT中增加了40%(P < 0.05, n = 8),但是空白對(duì)照組中卻沒有(Fig. 2B).用DN-AMPK抑制AMPK的活性，降低了FGF-21刺激的NAD+/NADH的增加，說(shuō)明FGF-21激活A(yù)MPK在SIRT1激活的上游。 為了確定FGF-21誘導(dǎo)的升高的NAD+/NADH是否影響SIRT1的活性，我們確定了已知的SIRT1底物的乙?；饔媚Ｐ蚉G

13、C-1α and H3. 3T3-L1脂肪細(xì)胞被轉(zhuǎn)染進(jìn)腺病毒表達(dá)的shRNA的不含SIRT1的和腺病毒表達(dá)的一個(gè)Flag–PGC-1α結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用FGF21 (4.0 μg/mL) 處理 3 d。用FGF-21處理過的3T3-L1脂肪細(xì)胞PGC-1α 的乙酰化降低了28% (P < 0.05;n = 3),.shRNA敲出SIRT1 (Fig. 2D)的基因，降低了它的影響。此外，在降低H3的乙?；缴?(68%;P < 0.05; n = 8) 經(jīng)過FGF21處理的老鼠要比空白對(duì)照組明顯 (Fig. 2E). 這些數(shù)據(jù)表明，在體外脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)GF21 改變 NAD+代謝水平并且激

14、活了 SIRT1 a的活性?？傊@些結(jié)果表明FGF-21是通過激活A(yù)MPK 和SIRT1來(lái)控制能量代謝的。 FGF-21增加線粒體基因和蛋白的表達(dá) AMPK和 SIRT1都是線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。為了檢驗(yàn)FGF-21在線粒體生物合成和功能中的作用，我們對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR來(lái)測(cè)定線粒體功能相關(guān)基因的表達(dá)。FGF-21處理3T3-L1脂肪細(xì)胞后，導(dǎo)致其CPT1a的顯著增加（CPT1a是參與游離脂肪酸跨線粒體膜進(jìn)行脂肪β-氧化），Idh3a增加了1.6倍（是TCA循環(huán)的限速步驟），CytC增加了 (Fig. S2A).2.1倍。此外，這些基因水平上的改變相互關(guān)聯(lián)，

15、增加了Cyt A蛋白的表達(dá)水平(6%; P < 0.05; n = 3; Fig. 3A). 此外，F(xiàn)GF21處理人的脂肪細(xì)胞后，顯著增加了與線粒體生物合成、β-脂肪酸氧化，包括CPT1a (45%), PPARδ（ 23%), 和PGC-1α (20%)的表達(dá) (Fig. S2C).這些基因表達(dá)水平的改變也導(dǎo)致了CytC蛋白的表達(dá)水平 (P < 0.05; n = 3) (Fig. 3B). Fig2.FGF-21增加細(xì)胞內(nèi)的NAD+并且降低H3的乙?；饔?。(A)NAD+/NADH在3T3-L1脂肪細(xì)胞中的水平。3T3-L1脂肪細(xì)胞是經(jīng)過FGF-21 (4.0 μg/mL; bla

16、ck bars) 或者 PBS空白處理3天。（B）)NAD+/NADH在對(duì)照組，F(xiàn)GF-21實(shí)驗(yàn)組，和空白組老鼠（N=8只動(dòng)物/組）的WAT中的水平。（C）)NAD+/NADH在人的脂肪細(xì)胞中，用腺病毒表達(dá)對(duì)照載體和DN-AMPK轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞.轉(zhuǎn)染后的脂肪細(xì)胞用 FGF21 (4.0 μg/mL)或者;PBS 處理。（D）Western blot定量檢測(cè)3T3-L1細(xì)胞中(Ac-PGC-1α) 3T3-L1 脂肪細(xì)胞經(jīng)過腺病毒表達(dá)SIRT1-shRNA 和Flag–PGC-1αadipocytes 。 Flag–PGC-1α 是用表面乙?；馁嚢彼峥贵w免疫沉淀和點(diǎn)雜交的。 t-PGC-

17、1α, 是總的 PGC-1α.（E）Western blot定量檢測(cè)在對(duì)照組，F(xiàn)GF-21實(shí)驗(yàn)組，和空白組老鼠（N=8只動(dòng)物/組）的WAT中的Ac-H3的水平。所以的數(shù)據(jù)都是通過三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均值得來(lái)的。N=8只/組*P < 0.05 (學(xué)生實(shí)驗(yàn)). FGF-21曾經(jīng)被證明其能在體內(nèi)增加基因的表達(dá)。因此，我們檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)組的WAT中線粒體蛋白的表達(dá)水平。FGF-21處理的實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的CytC蛋白的表達(dá)水平增加了32%(P <0.05; n = 8)，在對(duì)照組或者對(duì)照鼠中，沒有改變(Fig. 3C). FGF-21增強(qiáng)線粒體的氧化能力 為了更深入的了解FGF-21對(duì)線粒體功能的影響，我

18、們檢測(cè)了FGF-21處理的3T3-L1細(xì)胞中，線粒體酶的活性，主要是檢測(cè)檸檬酸合酶的活性，它是TCA循環(huán)中的一個(gè)關(guān)鍵的組成部分。FGF-21顯著增加了檸檬酸合酶的活力，大約增加了1.7倍，表明FGF-21增強(qiáng)了TCA循環(huán)的活力。 為了進(jìn)一步了解FGF-21在增加線粒體氧化功能的能力，我們測(cè)定了FGF21處理后的 3T3-L1 和人的脂肪細(xì)胞的氧耗量。FGF-21增加了基礎(chǔ)氧耗量達(dá)1.2倍 (P < 0.05; n = 3)并且增加了寡霉素處理后的3T3-L1細(xì)胞的氧耗量達(dá)1.3倍(P < 0.05; n = 3; Fig. 3E). FCCP是一種化學(xué)耦合器，它能廢除呼吸鏈和氧化磷酸化系統(tǒng)之

19、間的聯(lián)系，并且最大化的增加線粒體的呼吸能力。FGF-21處理后的3T3-L1細(xì)胞中，顯著增強(qiáng)了FCCP刺激氧耗的能力，分別增加了1.9和1.7倍(P < 0.01; n = 3)，表明FGF-21增加了氧耗，并且增強(qiáng)了氧化能力(Fig. 3 E and F).。 FGF-21在對(duì)線粒體功能的影響時(shí)，需要LKB1, AMPK, and SIRT1的幫助 為了確定FGF-21誘導(dǎo)的對(duì)線粒體功能的刺激是否需要AMPK，我們有新病毒表達(dá)DN-AMPK來(lái)轉(zhuǎn)染人的脂肪細(xì)胞。用DN-AMPK抑制AMPK的活性，降低了FGF-21刺激增加CPT-1a and PGC-1α 基因表達(dá)和增加氧耗的能力

20、 (Fig. 4B). 因?yàn)長(zhǎng)KB1調(diào)節(jié)AMPK的活性，我們通過使用慢性病毒表達(dá)shRNA而不表達(dá)LKB1和對(duì)照shRNA來(lái)預(yù)測(cè)FGF-21在線粒體功能的作用是否也需要LKB1。含LKB1-shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的PBS 和FGF-21處理后的脂肪細(xì)胞LKB1 mRNA 的水平增加了大于70%(Fig. 4C). FGF21顯著增強(qiáng)了在基礎(chǔ)水平上的氧耗率(1.3-fold;P < 0.01; n = 3) 和 FCCP 的處理(1.4-fold; P < 0.001;n = 3) (Fig. 4D). 因?yàn)锳MPK激活SIRT1，我們接下來(lái)要探討AMPK下游的SIRT1是否介導(dǎo)FGF-2

21、1對(duì)線粒體功能的影響 用腺病毒轉(zhuǎn)染3T3-L1脂肪細(xì)胞表達(dá)SIRT1-shRNA 或者對(duì)照 shRNA.這些細(xì)胞是經(jīng)過FGF21 (4.0 μg/mL)處理3天。在PBS- and FGF21處理后的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞中SIRT1 mRNA 水平被SIRT1-shRNA降低了大于 60% 。FGF21的作用顯著增加了在基礎(chǔ)水平上的氧耗率(1.5-fold; P < 0.05; n = 3)，同樣的效果也表現(xiàn)在寡霉素處理的細(xì)胞中(1.4-fold; P < 0.05; n = 3) 和 FCCP(1.7-fold; P < 0.01; n = 3) 處理的細(xì)胞中(Fig. 4F)

22、. FGF21誘導(dǎo)氧耗量的增加的能力在用shRNA敲出的SIRT1基因后有所降低 (Fig. 4F).總之，結(jié)果證明FGF-21是通過依賴 LKB1-,AMPK-, and SIRT1通路來(lái)增強(qiáng)線粒體功能的。 Fig3.為FGF-21在（A）FGF-21處理后的3T3-L1細(xì)胞和（B）人脂肪細(xì)胞，空白，PBS處理，背景空白，F(xiàn)GF-21處理中增加線粒體蛋白的表達(dá)和功能CytC蛋白水平的結(jié)果分析。（C）CytC 蛋白的水平在對(duì)照組, FGF21處理的實(shí)驗(yàn)組，和 空白組老鼠的WAT中 (D)CS 的活性FGF-21處理的3T3-L1 的脂肪細(xì)胞. (E)氧耗量在3T3-L1 細(xì)胞 和 (F)

23、人的脂肪細(xì)胞用 PBS (white bars) 或FGF21(black bars). 數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值. *P < 0.05;**P < 0.01 (Student’s t test). Fig. 4. FGF21 effects in adipocytes require AMPK activity. (A)Gene expression in human adipocytes infected with adeno-virus expressing DN-AMPK or GFP (Ctrl) and treated with PBS(white bars) or

24、 FGF21 (black bars). (B) Oxygen consumption inhuman adipocytes infected with adenovirus expressing DN-AMPK or GFP (Ctrl) and treated with PBS (white bars) orFGF21 (black bars). (C) Gene expression in human adipocytesinfected with lentivirus expressing shRNA against LKB1 orcontrol s

25、hRNA (Ctrl) and treated with PBS (white bars) or FGF21 (black bars). (D) Oxygen consumption in 3T3-L1 adipo- cytes infected with lentivirus expressing shRNA against LKB1or control shRNA (Ctrl) and treated with PBS (white bars) orFGF21 (black bars). (E) Gene expression in human adipocytesinf

26、ected with adenovirus expressing shRNA against SIRT1 orcontrol shRNA (Ctrl) and treated with PBS (white bars) orFGF21 (black bars). (F) Oxygen consumption in 3T3-L1 adipo-cytes infected with adenovirus expressing shRNA against SIRT1or control shRNA (Ctrl) and treated with PBS (white bars) o

27、rFGF21 (black bars). Data are averages of three independentexperiments. All gene-expression data are quantitative RT-PCRs,normalized to the housekeeping gene, TATA box binding pro-tein. *P < 0.05; **P < 0.01 (Student’s t test). ***P < 0.001. FGF21介導(dǎo)的影響線粒體功能上需要PGC-1α 因?yàn)锳MPK 和 SIRT1 都調(diào)節(jié)PGC-1α 表達(dá)

28、和活性，我們通過定量PCR來(lái)鑒定FGF-21處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞中PGC-1α的增加。有趣的是，經(jīng)過處理的細(xì)胞中，F(xiàn)GF21 并沒有表現(xiàn)出增加PGC-1α的mRNA的表達(dá)(Fig. 5A).可是，我們發(fā)現(xiàn)FGF21通過對(duì) SIRT1的去乙酰化來(lái)調(diào)節(jié)PGC-1α的活性(Fig. 2D).為了驗(yàn)證FGF-21調(diào)節(jié)線粒體的功能是否需要PGC-1α,我們完成了3T3-L1細(xì)胞中shRNA敲出研究。在經(jīng)過PGC-1α–shRNA 轉(zhuǎn)染的3T3-L1脂肪細(xì)胞與空白相比PGC-1α 的mRNA 水平降低了大于70% 在3T3-L1脂肪細(xì)胞中(Fig. 5A).敲除了PGC-1α降低了FGF-21在CT

29、P-1a 和CytC基因表達(dá)上的影響，完全抑制了FGF21誘導(dǎo)的氧耗量的在基礎(chǔ)水平上，與寡霉素和FCCP處理的結(jié)果同(Fig. 5B)。因此，我們的結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-21在調(diào)節(jié)線粒體功能的綜合作用中需要PGC-1α.。 Fig. 5. FGF21 effects in adipocytes require PGC-1α. (A) PGC-1α expression in 3T3-L1 adipocytes infected with shRNA-cytomegalovirus (CMV) (Ctrl) or shRNA–PGC-1α adenovirus and treated wi

30、th PBS (white bars) or FGF21 (black bars). Data shown are from quantitative RT-PCRs, normalized to the housekeeping gene,TATA box binding protein. (B) Oxygen consumption in 3T3-L1 adipocytes infected with shRNA-CMV (Ctrl) or shRNA–PGC-1α adenovirus and treated with PBS(white bars) or FGF21 (black ba

31、rs). Data are averages of three independent experiments. *P < 0.05; **P < 0.01 (Student’s t test). (C) Schematic diagramshowing FGF21 activation of AMPK via LKB1, which indirectly activates SIRT1 by increasing the cellular NAD+/NADH ratio. The pathway converges on reg-ulation of PGC-1α activity and,

32、 ultimately, on mitochondrial oxidative function. 討論 這里 我們證實(shí)了FGF21能通過增強(qiáng)線粒體的功能和效率來(lái)調(diào)節(jié)能量的自我平衡，這是通過在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)中增強(qiáng)AMPK和SIRT1實(shí)現(xiàn)的。在圖5C中我們的數(shù)據(jù)提供了FGF21的工作模型。FGF21通過LKB1增加了AMPK的磷酸化水平。AMPK的激活導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)NAD+水平的增加，又激活了SIRT1隨后影響了多種代謝通路。這里我們調(diào)查了調(diào)節(jié)線粒體氧化功能的通路。結(jié)果顯示FGF21在增加線粒體功能上的效果是通過PGC1-ɑ介導(dǎo)的。 再FGF21治療的脂肪細(xì)胞中，AMPK和SIRT

33、1的活化集中增強(qiáng)了線粒體的氧化功能，包括氧耗量的增加，檸檬酸合成酶的活性以及一些關(guān)鍵代謝基因的誘導(dǎo)，這些基因包括CPT1ɑ和CytC。通過顯性失活和shRNA腺病毒和慢病毒來(lái)抑制LKB1，AMPK和SIRT1的活性弱化了FGF-21在氧耗量和基因表達(dá)方面的作用，顯示FGF-21是通過依賴于AMPK和SIRT1的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)線粒體功能和增加氧容量。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中我們都觀察到FGF-21對(duì)AMPK和SIRT1的作用，證明這些作用很可能直接與體重和肥胖的變化有關(guān)而非間接地。 Ｗａｎｇ等人已經(jīng)證實(shí)，在脂肪形成過程中，PPARγ的配體結(jié)合域的７個(gè)螺旋對(duì)于PPARγ對(duì)內(nèi)源性配體的應(yīng)答是必須的，同樣對(duì)于一些

34、小分子的表達(dá)也是必須的如ＦＧＦ２１。這些小分子基因的表達(dá)式受SIRT1抑制的，使SIRT1抑制能夠產(chǎn)生與PPARγ配體相同的作用效果。有趣的是，我們的結(jié)果還證實(shí)了，在用FGF-21治療肥胖的過程中抑制了PPARγ的表達(dá)增強(qiáng)了AMPK和SIRT1的活性，很有可能SIRT1抑制FGF-21的表達(dá)在脂肪形成過程中是必要的，但是在成熟的脂肪細(xì)胞中FGF-21能增強(qiáng)SIRT1的活性來(lái)維持能量的自我平衡。 Ｃｏｓｋｕｎ等人先前證明FGF-21在ＷＡＴ中能誘導(dǎo)PGC1-ɑ的表達(dá)，與他們的結(jié)果相一致，我們也證實(shí)FGF-21在線粒體功能上起作用需要PGC1-ɑ，我們進(jìn)一步顯示了FGF-21能增加AMPK和SI

35、RT1的活性與PGC1-ɑ協(xié)同作用來(lái)維持能量的自我平衡。 最近通過饑餓實(shí)驗(yàn)表明PGC1-ɑ能夠下調(diào)肝臟中FGF-21的表達(dá)。在老鼠中慢性的減少PGC1-ɑ的表達(dá)能夠增加FGF-21的表達(dá)。當(dāng)PGC1-ɑ水平很低FGF-21能介導(dǎo)生酮作用，這種情況下動(dòng)物代謝水平與饑餓情況相似。與先前的研究相似，F(xiàn)GF-21在肝臟的脂代謝中起作用需要PGC1-ɑ，我們的結(jié)果顯示用ＦＧＦ２１治療肥胖能增肌線粒體的氧容量同時(shí)也需要PGC1-ɑ。 與我們的假說(shuō)相一致，使用FGF-21治療肥胖小鼠引出了本來(lái)的代謝作用與過表達(dá)SIRT1的轉(zhuǎn)基因小鼠相似。FGF-21治療的和SIRT1轉(zhuǎn)基因的都顯示體重，血漿中胰島素及葡

36、萄糖水平的下降也增強(qiáng)了葡萄糖的耐受性。另外，使用AMPK激活因子如二甲雙胍引起的代謝作用與FGF-21相似包括葡萄糖的下降。我們觀察到在FGF-21治療的小鼠中產(chǎn)生了匯聚性的生物學(xué)效應(yīng)如AMPK和SIRT1的活化與我們的假說(shuō)FGF-21能夠誘導(dǎo)AMPK和SIRT1的活性相一致。 我們結(jié)果顯示FGF-21能通過LKB1激活A(yù)MPK的活性，F(xiàn)GF-21對(duì)線粒體功能起作用需要LKB1。FGF-21的信號(hào)通路是通過β-klotho和FGF受體介導(dǎo)了ERK 1/2的活化從而調(diào)節(jié)了LKB1的活性。很有可能FGF-21是通過ERK 1/2和LKB1相互作用來(lái)調(diào)節(jié)AMPK的。 FGF的作用限于表達(dá)β-kl

37、otho的組織，包括肝臟胰腺和脂肪組織。我們的研究顯示FGF-21在脂肪組織中能夠刺激AMPK和SIRT1的活性。最近發(fā)現(xiàn)FGF-21能增加PGC1-ɑ的表達(dá)以及激活肝臟中脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)。將會(huì)很有意思去確定FGF-21在肝臟中是否能激活A(yù)MPK和SIRT1的活性與PGC1-ɑ協(xié)調(diào)一致作用。先前研究已經(jīng)證明FGF-21能夠保護(hù)胰島β細(xì)胞免受糖脂毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和功能障礙，已經(jīng)證實(shí)SIRT1和NAD＋的代謝在胰島的功能和代謝上起到關(guān)鍵作用，也很有興趣去研究FGF-21在β細(xì)胞存活和功能上是受SIRT1介導(dǎo)的。很有可能FGF-21在這些通路中的作用在其他的組織中也有發(fā)生，例如肝臟胰腺和脂肪

38、組織中，他們共同調(diào)節(jié)了能量的自我平衡。 總之，我們的結(jié)果揭示了FGF-21增強(qiáng)線粒體功能和氧化能力的大體過程。FGF-21主要通過激活A(yù)MPK和SIRT1以及他們下游靶位點(diǎn)， 包括脂肪細(xì)胞中的PGC-1α。因此，對(duì)于這些改變的綜合反映生理的能力生產(chǎn)和脂肪酸的氧化提高了脂肪酶和胰島素的敏感性，表明了FGF-21在代謝調(diào)節(jié)上的優(yōu)勢(shì)。我們的在人的脂肪細(xì)胞的結(jié)果顯示，在嚙齒類和人的細(xì)胞中對(duì)線粒體功能有相同的促進(jìn)作用，也表現(xiàn)出了FGF-21在治療肥胖和二型糖尿病上的潛在價(jià)值。 方法 動(dòng)物及治療 8周齡的雄性ob/ob小鼠來(lái)源于杰克遜實(shí)驗(yàn)室，所有的操作過程都符合美國(guó)健康管理局及人類服務(wù)

39、中心的標(biāo)準(zhǔn)，也得到動(dòng)物保護(hù)及 委員會(huì)的批準(zhǔn)。小鼠隨機(jī)分配成治療組和空白組。通過飲食時(shí)的體重指數(shù)和血糖水平進(jìn)行區(qū)分，空白對(duì)照組給予PBS，治療組通過滲透泵持續(xù)給予FGF-21皮下注射。通過尾靜脈采血，血糖通過精確的G葡糖糖測(cè)試系統(tǒng)，禁食過夜后進(jìn)行葡糖糖耐受實(shí)驗(yàn)，裝載量為1G/KG. 細(xì)胞培養(yǎng) 體外治療 腺病毒轉(zhuǎn)染 3T3-L1細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)中心，3T3-L1在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中會(huì)發(fā)生富集，將細(xì)胞孵育在分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化，時(shí)間為四天，然后再孵育在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中四天，讓其完全的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)變。在第八天，細(xì)胞孵育在加油FGF-21（4ug/ml）或者PBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，孵育72小時(shí).每24

40、小時(shí)進(jìn)行換液。人脂肪細(xì)胞來(lái)源于細(xì)胞應(yīng)用中心，人前脂肪細(xì)胞在前脂肪細(xì)胞中培養(yǎng)進(jìn)行富集，將細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中分化10天進(jìn)行分化培養(yǎng)。對(duì)于基因沉默實(shí)驗(yàn)，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將表達(dá)阻抗SIRT1 、PGC-1 α等基因表達(dá)的腺病毒shRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)人的3T3-L1細(xì)胞。對(duì)于LKB1的基因沉默，通過慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA阻抗LKB1基因的表達(dá)。LKB1-shRNA慢病毒是從Santa Cruz 生物技術(shù)中心購(gòu)買的。DN-AMPKα2購(gòu)買于Eto生物科學(xué)中心，對(duì)于PGC-1 α乙酰化實(shí)驗(yàn)，通過表達(dá)SIRT1-shRNA慢病毒感染3T3-L1細(xì)胞。 表達(dá)和純化重組人的FGF-21 cDNA編碼位于TEV

41、酶切位點(diǎn)后的N端帶有六個(gè)HIS標(biāo)簽33–209的氨基酸殘基，克隆在pET-15b的NcoI和Xhol位點(diǎn)之間。HIS標(biāo)簽可以通過TEV蛋白酶切除，樣品之后可以進(jìn)行5K分子量濃縮，然后泵入Superd ex 200的凝膠柱，用PBS平衡柱子，蛋白濃度通過Bradford蛋白法。 RNA分離 逆轉(zhuǎn)錄 熒光定量PCR RNA通過TRIzo試劑從細(xì)胞和組織中提取出來(lái)，再通過Qi agen RNA酶試劑盒進(jìn)行純化，分離的RNA按照試驗(yàn)步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，樣品一式三份通過ABI Prism 790 0H T進(jìn)行熒光定量PCR，試驗(yàn)需要的引物及探針來(lái)源于A pplied B iosystem

42、s. 氧消耗及檸檬酸合成活性試驗(yàn) 檸檬酸合成活性通過檸檬酸合成試劑盒檢測(cè)，總共需要2ug蛋白進(jìn)行試驗(yàn)，XF24細(xì)胞外流量分析進(jìn)行氧消耗量檢測(cè)，氧消耗量通過fi xed delta機(jī)器產(chǎn)生的斜率進(jìn)行計(jì)算。 NAD+/NADH and CytC 的分析. NAD+和 NADH 的水平是通過 NAD/NADH分析試劑盒來(lái)確定（購(gòu)自Abcam）. CytC 蛋白的水平是通過 CytC ELISA 來(lái)測(cè)定的（通過R&D 系統(tǒng)獲得）。 蛋白免疫印跡和免疫沉淀反應(yīng) 在裂解緩沖液（含有蛋白酶和磷酸鹽抑制劑）中裂解細(xì)胞，裂解物超聲破碎1min，4C14,000g離心10min，為

43、了進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，將800μg的蛋白在4C與帶有抗Flag的瓊脂糖顆粒孵育，跑SDS-PAGE膠并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)的分析使用的是學(xué)生實(shí)驗(yàn)差異顯著用星號(hào)表示 參考文獻(xiàn) 1. Hardie DG (2007) AMP-activated/SNF1 protein kinases: Conserved guardians of cellular energy. Nat Rev Mol Cell Biol 8:774–785. 2. Shaw RJ, et al. (2004) The tumor suppressor LKB

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