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1、DXS6804基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的克隆制備及其群體遺傳學(xué)研究 　　　　目的 用分子克隆技術(shù)制備DXS6804基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，并用于中國(guó)云南普米族人群的群體遺傳學(xué)研究，解決長(zhǎng)期困擾短串聯(lián)重復(fù)序列分型上存在的準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題。方法 用PCR擴(kuò)增出DXS6804基因座的各等位基因片段，PCR產(chǎn)物克隆后，DNA測(cè)序證實(shí)插入片段的大小和結(jié)構(gòu)，按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行命名后，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、擴(kuò)增及再鑒定后，制備出該基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，進(jìn)行群體研究。結(jié)果 調(diào)查了中國(guó)云南地區(qū)普米族人群基因座的基因型分布頻率，發(fā)現(xiàn)DXS6804基因座兩個(gè)分型標(biāo)準(zhǔn)物外等位基因。結(jié)論 分子克隆技術(shù)是

2、制備等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的可靠方法，DXS6804基因座是一個(gè)適合我國(guó)法醫(yī)學(xué)和群體遺傳學(xué)分析的遺傳標(biāo)記。 等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物；短串聯(lián)重復(fù)序列；遺傳多態(tài)性 　　Study on the construction of standard DXS6804 allelic laddervia molecular cloning and its genetic polymorphism　in Chinese yunnan pumi populations 　　ABSTRACT: ObjectiveTo resolve the problem of the accuracy and sta

3、ndardization of STRPCR typing in forensic practice, construct DXS6804 allelic ladder by molecular clonning and apply them in a population study on the Pumi population in Yunnan, China. MethodsPCR was used to produce several different allelic fragments of the locus. After cloning the PCR products, t

4、he recombinant plasmids were sequenced. Then we denominated them and used them as template for reamplification to generate the locus standard ladder. ResultsThe sequencing results confirmed that the size and the construction of the inserts were correct. The genetic polymorphisms of this locus in Yu

5、nnan Pumi population of China were studied. Two offladder alleles of DXS6804 locus were found. ConclusionThis method is of high value for forensic DNA typing to construct standard ladders. DXS6804 is robust for genetic research and forensic application. 　　KEY WORDS: allelic ladder; short tandem

6、repeats; genetic polymorphism 　　短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats, STR)是一類(lèi)在人類(lèi)基因組中分布廣泛并且具有高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記。具有分型檢測(cè)所需檢材量少、尤其適合降解DNA的擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和同一認(rèn)定以及民事案件中的親權(quán)鑒定[12]。特別是X染色體STR基因座，具有擴(kuò)增片段短、等位基因多、分型方法簡(jiǎn)單、多態(tài)信息含量高的優(yōu)點(diǎn)，更受到格外關(guān)注。而且它特別適用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中在母方缺如(去世或失蹤)情況下兄弟姐妹的親權(quán)鑒定，另外，也可以作為性別的輔助鑒定，為法醫(yī)學(xué)研究提供了一種新的工具。但是，由于目前已知的X染

7、色體多態(tài)性遺傳標(biāo)記的數(shù)量較少，適用于法醫(yī)學(xué)的更少，而且其研究方法還處于摸索階段[3]?！　〉任换蚍中蜆?biāo)準(zhǔn)物(allelic ladder)是人群中常見(jiàn)的等位基因混合物，用來(lái)與未知樣品比對(duì)確定基因型。只有具備了一套精確的、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化命名的標(biāo)準(zhǔn)參照物，才有可能對(duì)STR分型結(jié)果作出正確的判型和命名,STR數(shù)據(jù)才能在各實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行交流和合作[4]。為此，我們應(yīng)用分子克隆技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外首先制備出DXS6804基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。應(yīng)用自制的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，首次調(diào)查了中國(guó)云南地區(qū)普米族人群基因型分布頻率，評(píng)價(jià)該基因座在法醫(yī)學(xué)和群體遺傳學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值。 　　1對(duì)象與方法 　　1.1

8、對(duì)象 　　1.1.1樣本遵循知情同意原則，隨機(jī)抽取中國(guó)云南地區(qū)100名普米族(其中女性49名)群體中無(wú)親緣關(guān)系個(gè)體的靜脈血，EDTA抗凝，-70℃保存。 　　1.1.2引物引物序列查自GenBank(表1)，由奧科公司合成。 　　1.1.3試劑2X Taq polymerase mix和DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天為時(shí)代公司)；質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen公司)；pGEMT Easy Vector SystemⅠ(美國(guó)Promega公司)；聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒(Biospin公司)；EDTA等其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 　　1.1.4儀器臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Her

9、mle公司)；微量可調(diào)加樣器(10、20、50、100、200、1000μL)(法國(guó)Gilson公司)；三相恒壓電泳儀(美國(guó)Bi aRad公司)；干熱器(美國(guó)Bellco公司)；旋渦混勻器(日本Tomy kogyo公司)；超凈工作臺(tái)(中國(guó)揚(yáng)州醫(yī)療設(shè)備廠)；低溫冰箱(-30℃，-70℃)(日本Sanyo公司)；ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)。 　　1.2方法 　　1.2.1制備標(biāo)準(zhǔn)分型物模板DNA通過(guò)Chelex100法[5]提取云南普米族群體樣本DNA，PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：總體積13μL， 2Taq polymerase mix 6μL，引物1μL(5nmol/L

10、)，DNA 2μL，H2O 2μL。反應(yīng)條件見(jiàn)表1?！　∮米冃跃郾０纺z電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染顯色[67]。從群體樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物中，選出了9個(gè)不同大小片段長(zhǎng)度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒純化各個(gè)片斷，制備成PCR再擴(kuò)增的模板。 　　1.2.2PCR再擴(kuò)增、產(chǎn)物鑒定及純化將制備好的9份DNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系及條件如前。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、銀染后再確定其片段大小，并進(jìn)行純化。 　　1.2.3PCR產(chǎn)物的克隆采用pGEMT Easy Vector SystemⅠ克隆試劑盒，將純化后的PCR片段直接插入質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選

11、擇培養(yǎng)，再用以上的擴(kuò)增方法篩選出含有正確插入片段的克隆。 　　1.2.4重組質(zhì)粒的DNA測(cè)序采用ABI3730全自動(dòng)遺傳分析儀，以質(zhì)粒公用的M13正向引物對(duì)重組質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行測(cè)序，確定插入片段的大小及組成，以國(guó)際法庭血液遺傳學(xué)學(xué)會(huì)(international society of forensic haemogenetics, ISFH)推薦的命名原則進(jìn)行各等位基因命名[89]。 　　1.2.5重組質(zhì)粒的擴(kuò)大培養(yǎng)及保存對(duì)經(jīng)測(cè)序證實(shí)的含有正確等位基因插入片段的質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒后,得到該基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)參照物的重組質(zhì)粒。菌液加甘油后，-70℃保存。 　　1.2

12、.6等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備和再鑒定以含該基因座等位基因插入片段的重組質(zhì)粒DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及條件如前。純化該基因座各等位基因的PCR產(chǎn)物，混合制備成等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物,通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色，驗(yàn)證所得分型標(biāo)準(zhǔn)物的可用性。　　將用分子克隆技術(shù)制備出的DXS6804基因座等位基因標(biāo)準(zhǔn)分型物用于云南地區(qū)普米族群體的遺傳學(xué)研究。 　　1.2.7數(shù)據(jù)分析利用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算該基因座等位基因片段的頻率和基因型頻率。利用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行HardyWeinberg平衡吻合性檢驗(yàn)[10]。根據(jù)等位基因和等位基因型頻率，分別計(jì)算雜合度(H)、個(gè)人識(shí)別力(DP)、多態(tài)信息量(PIC)[1112]。