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1、微生物發(fā)酵工程6無菌保障 2 6無菌保障 v 6 無菌保障提取困難 pH 噬菌體細胞裂解產率下降污染的危害 3 6無菌保障 v；無菌的保障設備無死角種子，培養(yǎng)過程加入的物料無污染。培養(yǎng)基和生產環(huán)境滅菌好氧發(fā)酵過程空氣除菌； 4 6無菌保障 滅菌（除菌）的方法v培養(yǎng)基濕熱滅菌 空氣過濾除菌 發(fā)酵的污染與防治6 無菌保障 5 6無菌保障 滅菌：用物理或化學方法殺滅或去除物料或設備中一切生命的過程。一些化學藥劑能使微生物中的蛋白、酶及核酸發(fā)生反應。 乙醇，甲醛，氯，高錳酸鉀，環(huán)氧乙烷， 季銨鹽，臭氧等。主要用于器械和環(huán)境滅菌和消毒化學滅菌1 160下保溫1-2h。要求保持干燥的器具和材料。v干熱滅菌

2、3 4v利用飽和蒸汽進行滅菌。有效，使用廣泛。2利用電磁波、紫外線、x射線、r-射線等射線滅菌濕熱滅菌過濾除菌利用過濾方法截流微生物，達到除菌的目的。適用于熱敏性培養(yǎng)基和制備無菌空氣過濾除菌3 6 6無菌保障 v原理：當溫度超過最高限度時，微生物細胞中的原生質和酶的基本成分-蛋白質發(fā)生不可逆的變化，使微生物在很短時間內死亡。v以能否殺死芽孢細菌為標準。v殺死微生物的極端溫度稱為致死溫度。 在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時間稱為致死時間。 v6.2 培養(yǎng)基濕熱滅菌 7 6無菌保障 v培養(yǎng)基進行濕熱滅菌時，培養(yǎng)基中的微生物受熱死亡的速率與殘存的微生物數量成正比。v即： dN/dt= -kNv式

3、中：N- 培養(yǎng)基中殘留活菌數（ 個）v t- 受熱時間（ min）v k- 反應速率常數或比死亡速率（min-1）v一微生物的死亡速率與理論滅菌時間 8 6無菌保障 v 若開始滅菌時（t=0），培養(yǎng)基中微生物的數量為N0， 將上式積分得：v lnN/N0=-ktv N= N0e-kt ( 對數殘留定律)v lnN/N0=-ktv t = 1/k ln N0/Ntv t = 2.303 /k lg N0/Ntv 計算時，Nt 一般可取0.001，N0 可參照一般培養(yǎng)基中活微生物數，?。?-2）X107而得。 9 6無菌保障 滅菌時間污染程度滅菌程度k值通常110-130， 5-20min 培養(yǎng)液

4、采用高溫短時間加熱的方式，可以達到徹底滅菌并且減少對培養(yǎng)液成分的破壞。 10 6無菌保障 k微生物種類加熱溫度K值越大， 微生物越容易死亡 11 6無菌保障 即: k =Ae -E/RTv式中： A-頻率因子v E-殺死微生物所需的活化能v R-氣體常數，8.314 J/（mol K）v v Lg k = - 1 E /2.303 RT +lg Av耐熱芽胞桿菌 A 取作1.34X10 36s-1vE取 2.844X105 J/molk值隨著溫度的變化遵循阿侖尼烏斯定律 12 6無菌保障 v以Lg k與1/T作圖，得一直線，從直線的斜率和截距求得 E和A。v進而根據滅菌溫度可以求出k值， 并計

5、算出滅菌時間。v一般殺滅微生物營養(yǎng)細胞的 E值約為2.09X105-2.71X105J/mol, 殺死微生物芽孢的 E值約為4.48X105 J/mol。 13 6無菌保障v 因為加熱滅菌過程中對培養(yǎng)基的破壞反應的速率常數也符合阿侖尼烏斯定律， 同理計算出了培養(yǎng)基中某營養(yǎng)成分分解的 E，值。v 一般酶和維生素等營養(yǎng)成分分解的 E，值為8.36X103- 8.36X104。 14 6無菌保障 v 由于滅菌時殺死微生物的活化能 E值大于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞的活化能 E，值， 因此隨著溫度的升高，滅菌速率常數增加的倍數大于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分分解的速率常數的增加倍數。v lnk2/k1 E v lnk2/

6、k1 E， v v 因此較高的滅菌溫度， 較短的滅菌時間能減少培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的損耗。 15 6無菌保障 v1分批滅菌，不計升溫階段所殺滅的菌數， t = 2.303 /k lg N0/Ntv 例1有一發(fā)酵罐內裝40m3 培養(yǎng)基， 在121溫度下進行實罐滅菌。 原污染程度為每1mL 有2X105 個耐熱細菌芽孢，121 時滅菌速率常數為1.8min-1v 求滅菌失敗幾率為0.001 時所需要的滅菌時間v 解：N0 = 40 X106 X 2 X105 = 8X 1012個v Nt= 0.001個v K = 1.8 min-1v 滅菌時間：t = 2.303 /1.8 lg （8X 10 12/0

7、.001） = 20.34min v二培養(yǎng)基滅菌時間的計算 16 6無菌保障 v例2.若將例1中的培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度131，此溫度下滅菌速率為15min-1。求滅菌所需的維持時間。v解：C0=2X105(個/ml)v Cs=1/40X106X1000= 2.5X10-11 (個/ml)v v 滅菌所需的時間v t = 2.303 /15 lg （2X 105/2.5X10-11）v = 2.37min 17 6無菌保障 v1分批滅菌：將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所有設備儀器滅菌的操作過程，也稱實罐滅菌。 分批滅菌優(yōu)點缺點設備投資少，滅菌效果可靠，對蒸汽要

8、求低（0.2-0.3MPa）。培養(yǎng)基破壞作用大， 操作難于自動化。v三培養(yǎng)基的滅菌： 18 6無菌保障 19 6無菌保障 20 6無菌保障 21 6無菌保障 v 將配制好的培養(yǎng)基在高溫快速的情況下，向發(fā)酵罐輸送的同時經過加溫，保溫，冷卻的過程進行滅菌。v 2. 連續(xù)滅菌 22 6無菌保障 設備利用率高蒸汽負荷均衡便于自動控制營養(yǎng)成分破壞少連續(xù) 23 6無菌保障 24 6無菌保障 25 6無菌保障 26 6無菌保障 6.3 空氣過濾除菌 一、發(fā)酵用無菌空氣的質量標準:發(fā)酵用的無菌空氣,就是將自然界的空氣經過壓縮,冷卻,減濕,過濾等過程達到: 27 6無菌保障 1 v連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。2

9、空氣的壓強為0.2-0.4Mpa3進入過濾器之前，空氣的相對濕度 70%4 進入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高10-305 v壓縮空氣的潔凈度一般以失敗概率為10-3為指標。 28 6無菌保障 二.空氣除菌設備 29 6無菌保障 三.空氣凈化的流程v1. 空氣的預處理v1). 采風塔: 10m ,上風頭, 流速8m/s. v2). 粗過濾器:前置過濾器, 攔截空氣中較大的灰塵以保護空氣壓縮機,同時減輕總過濾器的負擔.過濾介質采用泡沫塑料或無紡布.實際流速為0.1-5 m/s.v3). 空氣壓縮機: 提供動力以克服隨后各設備的阻力.v4). 空氣貯罐: 主要為消除壓縮機空氣的脈動, 特別是對于往

10、復式空壓機. 30 6無菌保障 v5). 冷卻器: 溫度120左右,必須冷卻。降濕。v6). 氣液分離設備: 除去空氣中的水和油保護過濾介質.有利用離心力沉降的旋風分離器,和利用慣性攔截的介質分離器.v旋風分離器：利用離心力進行氣液和氣固沉降分離的設備。結構簡單，阻力小，分離效率高。可去除空氣中絕大多數的20m以上的液滴。但是10m左右的液滴，除去效率只有60-70% 。 v絲網除沫器：可除去1m以上的霧滴，去除率為98%。 v7）.空氣加熱設備v此時的壓縮空氣濕度為100% 31 6無菌保障 32 6無菌保障 33 6無菌保障 v 2空氣的過濾除菌過濾介質絕對過濾深度過濾介質的空隙小于被攔截

11、的微生物大小，如用聚四氟乙烯或纖維素酯材料做成的微孔濾膜。介質孔隙大于被攔截的微生物大小，但介質有一定厚度，機理是靜電，擴散，慣性及攔截作用。 如棉花過濾器，超細玻璃纖維紙， 金屬燒結管等。 34 6無菌保障 v1). 纖維及顆粒狀介質的過濾器 ：用于總過濾器。玻璃纖維活性炭棉花介質 35 6無菌保障 v棉花：未脫脂棉花， 纖維直徑為16-20m， 其實密度為1520Kg/m3。填充率為8.5-10%。 v玻璃纖維：用無堿的玻璃纖維介質作為過濾介質。纖維直徑為3-20m， 其實密度為2600Kg/m3。填充率為5-11%。 v活性炭：常與纖維狀介質分層堆放成過濾床。v通過過濾器的氣流速度一般為

12、0.2-0.3m/s, 相應的壓力降也較小。 36 6無菌保障 37 6無菌保障 v過濾器進行滅菌時，一般是自上而下通入0.2-0.4 Mpa的蒸汽，滅菌45min后用壓縮空氣吹干備用?？傔^濾器約每月滅菌一次。 38 6無菌保障 v介質:超細玻璃纖維紙。v孔徑:1-1.5mv厚度: 0.25-0.4mmv實密度:2600Kg/m3v填充率:14.8%。除菌效率高，阻力小，強度低。用酚醛樹脂，甲基丙烯酸樹脂等處理以提高防濕能力用多孔板夾住提高其抗沖擊能力。2). 濾紙過濾器： 39 6無菌保障 40 6無菌保障 v3）金屬燒結管空氣過濾器：v壓縮空氣進入殼程，通過金屬微孔濾管的壁除去雜菌和顆粒，

13、得到的無菌空氣由管程排出。使用壽命長，耐高熱，氣體阻力小，安裝維修方便?？諝忸A過濾器和蒸汽過濾器。 41 6無菌保障 v4）微孔膜過濾器-絕對過濾器：v 由耐高溫，疏水的，厚度為150m的聚四氟乙烯薄膜構成。能絕對濾除所有的大于0.01m 以上的微粒，能除去幾乎所有空氣中夾帶的微生物。 過濾器體積小，處理量大，壓降小，除菌效率高 42 6無菌保障 43 6無菌保障 v3空氣凈化的流程：粗過濾器一級冷卻器空 氣加熱器分過濾器無菌空氣二級冷卻器分水器空氣貯罐旋風分離器空氣壓縮機絲網除末器空氣吸氣口總過濾器 44 6無菌保障 v1）.兩級冷卻，加熱除菌流程v特點：兩次冷卻，兩次分離，適當加熱。v 適應性廣，充分分離油水，節(jié)約冷卻水。 45 6無菌保障 v2）.冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程v特點：省去第二冷卻后的分離設備和空氣再加熱設備， 流程比較簡單，冷卻水用量少。適用于中等濕度的地區(qū)。 46 6無菌保障 v3）.高效前置過濾空氣除菌流程 47 6無菌保障 v4影響介質過濾效率的因素：v 介質過濾效率指被介質層捕集的塵埃顆粒與空氣中原有顆粒數之比。v = N1-N2/ N1過濾效率纖維直徑 填充密度空氣流速濾層厚度 48 6無菌保障 如何提高過濾除菌效率設計合理預處理設備 選擇合適凈化流程保證進口空氣的潔凈度。降低空氣相對濕度保證過濾介質干燥合理空氣過濾器，除菌效率高的過濾介質