Immunolabeling techniqueImmunolabeling technique1優(yōu)秀課件 第一節(jié)第一節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念一、免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫的概念二、常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)2優(yōu)秀課件 免疫標(biāo)記與免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫標(biāo)記免疫免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)：標(biāo)記物與免疫活性物質(zhì)的聯(lián)接技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)：以標(biāo)記免疫物質(zhì)檢測相應(yīng)靶物質(zhì)的技術(shù)3優(yōu)秀課件免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記示蹤物標(biāo)記靈敏性靈敏性靈敏性靈敏性特異性特異性特異性特異性免疫標(biāo)記技術(shù)的主要特點(diǎn)：免疫標(biāo)記技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性高特異性、高靈敏性高靈敏性免疫技術(shù)免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù)酶酶酶酶熒光素?zé)晒馑責(zé)晒馑責(zé)晒馑赝凰赝凰赝凰赝凰仄渌渌渌渌?優(yōu)秀課件常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別 標(biāo)記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定 5優(yōu)秀課件 第二節(jié)第二節(jié) 標(biāo)記免疫技術(shù)的分類標(biāo)記免疫技術(shù)的分類一、按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型二、按測定方式劃分的類型三、按測定用途劃分的類型6優(yōu)秀課件1、酶免疫技術(shù)2、熒光免疫技術(shù)3、放射免疫技術(shù)4、金免疫技術(shù)按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型7優(yōu)秀課件1、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按測定方式劃分的類型按測定方式劃分的類型8優(yōu)秀課件均相型（均相型（homogenous）非均相型非均相型（heterogeneous）9優(yōu)秀課件1、免疫測定技術(shù)2、免疫組化技術(shù)按測定用途劃分的類型按測定用途劃分的類型10優(yōu)秀課件 第三節(jié)第三節(jié) 酶標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與鑒定11優(yōu)秀課件常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、常用酶 辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）2、標(biāo)記方法 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法12優(yōu)秀課件戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法(一步法）一步法）抗體-NH2 +COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-抗體酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶13優(yōu)秀課件戊二醛交聯(lián)法（二步法）戊二醛交聯(lián)法（二步法）COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗體-NH2 +CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶14優(yōu)秀課件過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)15優(yōu)秀課件標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析2、鑒定 抗體活性 酶活性 標(biāo)記物純度16優(yōu)秀課件 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）17優(yōu)秀課件ELISAELISA基本的實(shí)驗(yàn)過程基本的實(shí)驗(yàn)過程18優(yōu)秀課件ELISA技術(shù)的原理與方法技術(shù)的原理與方法間接法 夾心法 競爭法19優(yōu)秀課件間接法間接法20優(yōu)秀課件夾心法夾心法21優(yōu)秀課件競爭法競爭法22優(yōu)秀課件 第四節(jié)第四節(jié) 熒光標(biāo)記技術(shù)熒光標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化23優(yōu)秀課件常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、熒光素的概念2、生物標(biāo)記熒光素的要求3、常用熒光素標(biāo)記原理與方法 24優(yōu)秀課件生物標(biāo)記熒光素的要求生物標(biāo)記熒光素的要求1、具有與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的能力2、熒光效率高3、能與背景物質(zhì)形成鮮明對比4、不影響蛋白質(zhì)的生物、免疫活性5、標(biāo)記方法安全、簡便6、標(biāo)記物穩(wěn)定，易保存25優(yōu)秀課件熒光抗體技術(shù)的原理與方法熒光抗體技術(shù)的原理與方法直接法間接法補(bǔ)體法雙標(biāo)記法 26優(yōu)秀課件直接法間接法補(bǔ)體法雙標(biāo)記法27優(yōu)秀課件標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離熒光素 方法：柱層析2、鑒定 抗體活性 標(biāo)記物結(jié)合度 F/P比值的應(yīng)用意義28優(yōu)秀課件 第五節(jié)第五節(jié) 放射性核素標(biāo)記技術(shù)放射性核素標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化29優(yōu)秀課件直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T30優(yōu)秀課件間接法（連接法）間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP31優(yōu)秀課件結(jié)合相游離相放射免疫分析法的原理與方法放射免疫分析法的原理與方法32優(yōu)秀課件常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、常用放射性核素2、125I 的標(biāo)記方法 直接法（氯胺T法）間接法（連接法）33優(yōu)秀課件標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離放射性核素 方法：柱層析2、鑒定 游離放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）應(yīng)用意義34優(yōu)秀課件第六節(jié)第六節(jié) 膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)(金標(biāo)法金標(biāo)法)膠體金是由氯化金與還原劑反應(yīng)形成的一種膠體顆粒，具有吸附蛋白質(zhì)的特性(可以標(biāo)記Ag或Ab)；膠體金顆粒具有呈色性，中等大小的膠體金顆粒呈現(xiàn)酒紅色。膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)是將金顆粒光學(xué)檢測的靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。35優(yōu)秀課件膠體金免疫法與膠體金免疫法與RIA、ELISA等方等方法相比法相比,有許多優(yōu)點(diǎn)：有許多優(yōu)點(diǎn)：1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和顯色劑，使操作更簡便;2.膠體金法無污染，不含危害操作者即污染環(huán)境;3.膠體金標(biāo)抗體在凍干狀態(tài)下室溫儲存較穩(wěn)定,有效期長;4.靈敏度高。36優(yōu)秀課件免疫標(biāo)記技術(shù)的比較免疫標(biāo)記技術(shù)的比較 FIA ELISA RIA敏感性 較低 高 高特異性 高 高 高重復(fù)性 差 好 好檢測對象 Ag/Ab Ag/Ab Ag37優(yōu)秀課件