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1、課 題 2 土 壤 中 分 解 尿 素 的 細(xì) 菌 的 分離 與 計 數(shù)專 題 2微 生 物 的 培 養(yǎng) 與 應(yīng) 用 . . . 1.分 離 微 生 物 的 原 理2.利 用 選 擇 培 養(yǎng) 基 分 離 細(xì) 菌3.統(tǒng) 計 細(xì) 菌 數(shù) 目 的 方 法 . . . 簡 要 地 介 紹 尿 素 的 發(fā) 現(xiàn) 過 程 以 及 尿 素 合 成 的 歷 史 ， 引 導(dǎo) 學(xué) 生 閱 讀 “ 課題 背 景 ” 知 識 ， 使 學(xué) 生 明 確 分 解 尿 素 的 細(xì) 菌 的 重 要 性 ， 突 出 課 題 研 究 的 重要 意 義 ， 設(shè) 計 問 題 ， 導(dǎo) 入 新 課 。 知 道 了 細(xì) 菌 分 解 尿 素 的

2、 原 因 后 ， 我 們 該 從什 么 樣 的 土 壤 中 分 離 分 解 尿 素 的 細(xì) 菌 呢 ？ 首 先 結(jié) 合 教 材 上 科 學(xué) 家 成 功 分 離Taq細(xì) 菌 的 案 例 ， 分 析 得 出 分 離 微 生 物 的 一 般 規(guī) 律 ， 再 結(jié) 合 本 節(jié) 的 目 之 一： 要 分 離 分 解 尿 素 的 細(xì) 菌 ， 進 入 選 擇 培 養(yǎng) 基 的 學(xué) 習(xí) 。 知 道 了 分 離 方 法 后 ，我 們 如 何 對 土 樣 中 分 解 尿 素 的 細(xì) 菌 進 行 計 數(shù) 呢 ？ 從 而 逐 層 深 入 依 次 討 論 統(tǒng)計 菌 落 數(shù) 目 的 方 法 及 設(shè) 置 對 照 的 作 用 。

3、 在 充 分 分 析 Taq細(xì) 菌 分 離 案 例 的 過 程 中 ， 讓 學(xué) 生 理 解 生 物 與 環(huán) 境 的 適應(yīng) 性 ， 從 而 真 正 明 白 分 離 微 生 物 的 原 理 ， 并 能 從 邏 輯 上 給 出 分 離 微 生 物 的大 致 思 路 ， 這 也 為 選 擇 培 養(yǎng) 基 的 學(xué) 習(xí) 打 好 基 礎(chǔ) ， 并 添 加 典 型 實 例 ， 讓 學(xué) 生更 好 地 理 解 選 擇 培 養(yǎng) 基 的 作 用 。 通 過 視 頻 的 直 觀 性 讓 學(xué) 生 掌 握 細(xì) 菌 計 數(shù) 的一 般 方 法 。 . . . 尿 素 的 發(fā) 現(xiàn) 歷 史 1773年 ， 伊 萊 爾 羅 埃 爾 （

4、Hilaire Rouelle） 發(fā) 現(xiàn) 尿 素 。 1828年 ， 德 國 化 學(xué) 家 弗里 德 里 希 維 勒 首 次 使 用 無 機 物 質(zhì) 氰 酸 銨 （ NH4CNO， 一 種 無 機 化 合 物 ， 可 由 氯 化 銨 和氰 酸 銀 反 應(yīng) 制 得 )與 硫 酸 銨 人 工 合 成 了 尿 素 。 本 來 他 打 算 合 成 氰 酸 銨 ， 卻 得 到 了 尿 素 。尿 素 的 合 成 揭 開 了 人 工 合 成 有 機 物 的 序 幕 ， 實 際 上 開 辟 了 有 機 化 學(xué) 。 . . . 一 、 課 題 背 景 . . . 芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、

5、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。1.怎 樣 才 能 從 土 壤 中 分 離 出 分 解 尿 素 的 細(xì) 菌 呢 ？ . . . 二 、 研 究 思 路 （ 一 ） 篩 選 菌 株 水 生 耐 熱 細(xì) 菌 Taq ( Thermus aquaticus )耐 高 溫 的 Taq DNA聚 合 酶美 國 微 生 物 學(xué) 科 布 魯 克 （ T.Brock)1 9 6 6 年 發(fā) 現(xiàn) 耐 熱 細(xì) 菌a.提 出 的 問 題 如 何 尋 找 耐 高 溫 的 酶 ？b.解 決 問 題 的 思 路 尋 找 耐 高 溫 環(huán) 境 ；c.原 理 高 溫 淘 汰 其 他 菌 ， 選 出 耐 高 溫 細(xì)

6、菌 ， 耐 高 溫 菌 種 提 取 耐 高 溫 酶 。 . . . :要 分 離 某 種 微 生 物 ， 必 須 根 據(jù) 該 微 生 物 的 特點 ， 包 括 營 養(yǎng) 、 生 理 、 生 長 條 件 等 方 法 ： 抑 制 大 多 數(shù) 微 生 物 不 能 生 長 ， 造 成 有 利 于 該 菌 生 長 的 環(huán) 境 。結(jié) 果 ： 培 養(yǎng) 一 定 時 間 后 ， 該 菌 數(shù) 量 上 升 ， 再 通 過 平 板稀 釋 等 方 法 對 它 進 行 純 化 培 養(yǎng) 分 離 。二 ） 實 驗 室 中 微 生 物 的 篩 選 原 理 ： . . . 選 擇 培 養(yǎng) 基 在 微 生 物 學(xué) 中 ， 將 允 許

7、 特 定 種 類 的 微 生 物 生 長 ，同 時 抑 制 或 阻 止 其 他 種 類 微 生 物 生 長 的 培 養(yǎng) 基 。加 入 青 霉 素 的 培 養(yǎng) 基 :分 離 酵 母 菌 、 霉 菌 等 真 菌加 入 高 濃 度 食 鹽 的 培 養(yǎng) 基 :分 離 金 黃 色 葡 萄 球 菌不 加 氮 源 的 無 氮 培 養(yǎng) 基 :分 離 自 生 固 氮 菌不 加 含 碳 有 機 物 的 無 碳 培 養(yǎng) 基 :分 離 自 養(yǎng) 型 微 生 物加 入 青 霉 素 等 抗 生 素 的 培 養(yǎng) 基 :分 離 導(dǎo) 入 了 目 的 基 因 的 受 體 細(xì) 胞 . . . KH2PO4 1.4g NaHPO4 2

8、.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡 萄 糖 10.0g 尿 素 1.0g 瓊 脂 15.0g 將 上 述 物 質(zhì) 溶 解 后 ，用 蒸 餾 水 定 容 到1000mL。 （ 1） 該 培 養(yǎng) 基 的 配 方 中 ， 為 微 生 物的 生 長 提 供 碳 源 和 氮 源 的 分 別 是 什 么物 質(zhì) ？ （ 2） 此 配 方 能 否 篩 選 出 產(chǎn) 生 脲 酶 的細(xì) 菌 ？ 為 什 么 ？碳 源 ： 葡 萄 糖 、 尿 素氮 源 ： 尿 素能 。 只 有 產(chǎn) 生 脲 酶 的細(xì) 菌 能 利 用 尿 素 作 為 氮 源 而 生存 。 . . . （ 四 ） 統(tǒng) 計 菌 落 數(shù) 目1、 顯 微

9、鏡 直 接 計 數(shù) ：（ 1） 方 法 ： 利 用 血 球 計 數(shù) 板 ， 在 顯 微 鏡 下 計 算 一 定 容 積 里 樣品 中 微 生 物 的 數(shù) 量 。不 能 區(qū) 分 死 菌 與 活 菌 ；不 適 于 對 運 動 細(xì) 菌 的 計 數(shù) ；需 要 相 對 高 的 細(xì) 菌 濃 度 ；個 體 小 的 細(xì) 菌 在 顯 微 鏡 下 難 以 觀 察 ；（ 2） 缺 點 顯 微 鏡 直 接 計 數(shù) 法 . . . （ 四 ） 統(tǒng) 計 菌 落 數(shù) 目1、 顯 微 鏡 直 接 計 數(shù) ：2、 活 菌 計 數(shù) 法 （ 間 接 計 數(shù) 法 ) （ 1） 操 作 方 法 ： 稀 釋 涂 布 平 板 統(tǒng) 計 菌

10、落 數(shù) （ 2） 原 理 ： 1個 菌 落 1個 活 菌 （ 3） 統(tǒng) 計 結(jié) 果 ： 統(tǒng) 計 的 菌 落 數(shù) 往 往 比 活 菌 的 實際 數(shù) 目 低 ， 因 此 統(tǒng) 計 結(jié) 果 一 般 用 菌 落 數(shù) 表 示 。 每 克 樣 品 中 的 菌 株 數(shù) =（ C/V)* M 其 中 C:某 一 稀 釋 度 下 平 板 上 生 長 的 平 均 菌 落 數(shù) ； V:所 用 稀 釋 液 的 體 積 ； M:稀 釋 倍 數(shù) 。 當(dāng) 樣 品 的 稀 釋 度足 夠 高 時 ， 固 體 培 養(yǎng)基 表 面 生 長 的 一 個 菌落 ， 來 源 于 樣 品 稀 釋液 中 的 一 個 活 菌 。 . . . 例

11、： 兩 位 同 學(xué) 用 稀 釋 涂 布 平 板 法 測 定 同 一 土 壤 樣 品 中 的 細(xì) 菌 數(shù) 。從 對 應(yīng) 稀 釋 倍 數(shù) 為 106的 培 養(yǎng) 基 中 ， 得 到 以 下 兩 種 統(tǒng) 計 結(jié) 果 。 1、 甲 同 學(xué) 在 該 濃 度 下 涂 布 了 一 個 平 板 ， 統(tǒng) 計 的 菌 落 數(shù) 為 230。 2、 乙 同 學(xué) 在 該 濃 度 下 涂 布 了 A、 B、 C三 個 平 板 ， 統(tǒng) 計 的 菌 落 數(shù)分 別 為 21、 212、 256， 該 同 學(xué) 以 這 三 個 平 板 上 菌 落 數(shù) 的 平 均 值 163作 為 統(tǒng) 計 結(jié) 果 。 甲 ： 沒 有 重 復(fù) 實 驗

12、（ 至 少 涂 布 3個 平 板 ） 乙 ： A組 結(jié) 果 誤 差 過 大 ， 不 應(yīng) 用 于 計 算 平 均 值你 認(rèn) 為 這 兩 位 同 學(xué) 的 作 法 正 確 嗎 ？如 果 有 問 題 ， 錯 在 哪 ？ . . . （ 四 ） 統(tǒng) 計 菌 落 數(shù) 目2、 活 體 計 數(shù) 法 （ 間 接 計 數(shù) 法 ) . . . （ 四 ） 統(tǒng) 計 菌 落 數(shù) 目 . . . 在 做 本 課 題 實 驗 時 ， 利 用 選 擇 培 養(yǎng) 基 進 行 尿 素 分 解 菌 的 分 離過 程 中 ， 從 對 應(yīng) 稀 釋 倍 數(shù) 為 106的 培 養(yǎng) 基 中 ， A、 B兩 同 學(xué) 分 別 得 到以 下 兩 種

13、 統(tǒng) 計 結(jié) 果 。 1、 A同 學(xué) 篩 選 出 150個 菌 落 。 2、 B同 學(xué) 篩 選 出 50個 菌 落 。 B認(rèn) 為 A的 培 養(yǎng) 基 被 雜 菌 污 染 了 ， 或 培 養(yǎng) 基 中 混 入 了 其 他 含 氮 物質(zhì) ， 因 而 導(dǎo) 致 不 能 分 解 尿 素 的 細(xì) 菌 也 能 在 該 培 養(yǎng) 基 中 生 長 。 A確 認(rèn)自 己 的 操 作 無 誤 ， 只 是 自 己 所 用 的 土 壤 樣 品 不 同 ， 但 此 時 也 拿 不 出能 令 人 信 服 的 證 據(jù) 。 請 你 幫 助 A同 學(xué) 改 進 實 驗 ， 提 供 具 有 說 服 力 的 證 據(jù) 。分 析 ： 一 是 由

14、于 土 樣 不 同 ， 二 是 由 于 培 養(yǎng) 基 污 染 或 操 作 失誤 (或 者 是 混 入 了 其 他 的 含 氮 物 質(zhì) )。 究 竟 是 哪 個 原 因 ， 可以 通 過 實 驗 來 證 明 。 實 驗 方 案 有 兩 種 。一 種 方 案 是 可 以 由 其 他 同 學(xué) 用 與 A同 學(xué) 一 樣 的 土 樣 進 行 實 驗 ，如 果 結(jié) 果 與 A同 學(xué) 一 致 ， 則 證 明 A無 誤 ； 如 果 結(jié) 果 不 同 ， 則證 明 A同 學(xué) 存 在 操 作 失 誤 或 培 養(yǎng) 基 的 配 制 有 問 題 。另 一 種 方 案 是 將 A同 學(xué) 配 制 的 培 養(yǎng) 基 在 不 加 土

15、 樣 的 情 況 下 進行 培 養(yǎng) ， 作 為 空 白 對 照 ， 以 證 明 培 養(yǎng) 基 是 否 受 到 污 染 。通 過 這 個 事 例 可 以 看 出 ， 實 驗 結(jié) 果 要 有 說服 力 ， 對 照 的 設(shè) 置 是 必 不 可 少 的 。 . . . 1、 設(shè) 置 對 照 的 目 的 ： 排 除 實 驗 組 中 非 測 試 因 素 對 實 驗 結(jié) 果 的 影 響 ，提 高 實 驗 結(jié) 果 的 可 信 度 。 對 照 實 驗 是 指 除 了 被 測 試 的 條 件 外 ， 其 他 條件 都 相 同 的 實 驗 。 滿 足 該 條 件 的 稱 為 對 照 組 ， 未滿 足 該 條 件 的

16、稱 為 實 驗 組 。（ 五 ） 設(shè) 置 對 照 . . . 研 究 思 路 菌 種 篩 選統(tǒng) 計 菌 落 菌 數(shù) 目設(shè) 置 對 照土 壤 中 分 解 尿 素 的 分 離 與 計 數(shù) (1) . . . 1.能 合 成 脲 酶 的 微 生 物 所 需 要 的 碳 源 和 氮 源 分 別 是 ( ) A.CO2和 N2 B.葡 萄 糖 和 NH3 C.CO2和 尿 素 D.葡 萄 糖 和 尿 素2.使 用 選 擇 培 養(yǎng) 基 的 目 的 是 （ ） A.培 養(yǎng) 細(xì) 菌 B.培 養(yǎng) 真 菌 C.使 需 要 的 微 生 物 大 量 繁 殖 D.表 現(xiàn) 某 微 生 物 的 特 定 性 狀 與 其 他

17、微 生 物 加 以 區(qū) 別 DC3.統(tǒng) 計 菌 落 數(shù) 目 的 方 法 有 （ ） 涂 布 平 板 法 重 量 法 直 接 計 數(shù) 法 比 濁 法 生 理 指 標(biāo) 法 膜 過 濾 法 A. B. C. D. D . . . 5 通 過 配 置 特 殊 的 培 養(yǎng) 基 可 以 從 混 雜 的 微 生 物 群 體 中 分 離出 所 需 的 微 生 物 。 下 列 哪 項 操 作 最 終 不 能 達(dá) 到 分 離 出 相 應(yīng)微 生 物 的 目 的 ( )A 在 無 氮 培 養(yǎng) 基 上 可 從 多 種 細(xì) 菌 中 分 離 出 圓 褐 固 氮 菌B 在 缺 乏 有 機 碳 源 的 培 養(yǎng) 基 上 可 以 從 多 種 細(xì) 菌 中 分 離 得 到硝 化 細(xì) 菌C 在 培 養(yǎng) 基 中 加 青 霉 素 可 從 混 雜 的 真 菌 中 分 離 到 酵 母 菌D 在 培 養(yǎng) 基 中 加 高 濃 度 食 鹽 可 分 離 得 到 金 黃 色 葡 萄 球 菌4.為 培 養(yǎng) 和 分 離 出 酵 母 菌 并 淘 汰 雜 菌 ， 常 在 培 養(yǎng) 基 中 加 入（ ） A.較 多 的 氮 源 物 質(zhì) B.較 多 的 碳 源 物 質(zhì) C.青 霉 素 類 藥 物 D.高 濃 度 食 鹽C C