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1、發(fā)酵工程在醫(yī)藥研究和生產(chǎn)中的應用 1微生物發(fā)酵工程與醫(yī)藥 1.1抗生素的微生物合成 v 抗 生 素 原 指 微 生 物 產(chǎn) 生 的 、 能 在 低 濃 度 殺 死 或 抑制 細 菌 或 真 菌 等 微 生 物 的 物 質(zhì) ， 也 包 括 天 然 產(chǎn) 生的 抗 生 素 經(jīng) 化 學 方 法 改 造 所 得 的 半 合 成 抗 生 素 ，并 且 將 能 抑 制 腫 瘤 、 原 蟲 等 微 生 物 產(chǎn) 物 也 歸 入 抗生 素 類 。 抗 生 素 的 化 學 結(jié) 構(gòu) 種 類 繁 多 ， 主 要 有 糖類 、 肽 類 、 蛋 白 質(zhì) 類 、 核 苷 類 、 多 烯 類 、 多 醚 類 、內(nèi) 酰 胺 類

2、、 大 環(huán) 內(nèi) 酯 類 、 四 環(huán) 類 、 安 莎 類 等 。 抗生 素 主 要 用 于 治 療 微 生 物 感 染 和 抗 癌 。 v目 前 ， 已 找 到 的 抗 生 素 有 數(shù) 千 種 ， 其 中 具 有臨 床 效 果 并 已 利 用 發(fā) 酵 法 大 量 生 產(chǎn) 和 廣 泛 應用 的 多 達 百 余 種 。 在 已 發(fā) 現(xiàn) 的 抗 生 素 中 ， 由真 菌 產(chǎn) 生 的 約 占 13 ， 由 地 衣 產(chǎn) 生 的 在 1 以下 ,由 細 菌 產(chǎn) 生 的 約 占 12 ， 由 放 線 菌 產(chǎn) 生 的約 占 67 。 在 放 線 菌 所 產(chǎn) 生 的 抗 生 素 中 ， 約90 是 由 鏈 霉 菌

3、 產(chǎn) 生 的 。 臨床主要應用的抗生素v頭 孢 菌 素 類 抗 生 素 已 發(fā) 展 到 第 四 代 ， 主 要 研 究 動 向 是 提 高 抗革 蘭 陽 性 菌 、 銅 綠 假 單 胞 菌 和 厭 氧 菌 活 性 。對 金 葡 菌 等 革 蘭 陽 性 球 菌 的 作 用 強 于 第 三 代 ，對 頭 孢 菌 素 酶 （ AmpC） 的 穩(wěn) 定 性 也 優(yōu) 于 第 三代 ， 因 產(chǎn) AmpC酶 而 對 第 三 代 頭 孢 菌 素 耐 藥 的腸 桿 菌 屬 、 檸 檬 酸 菌 屬 、 普 羅 菲 登 菌 屬 及 沙雷 菌 屬 仍 對 第 四 代 頭 孢 菌 素 敏 感 ； 頭孢噻吩頭孢替安拉氧頭孢

4、 v碳 青 霉 烯 類 抗 生 素 (亞 胺 培 南 /西 司 他 丁 、 美羅 培 南 和 帕 尼 培 南 /倍 他 米 隆 ) 抗 菌 譜 最 廣 的 一 類 -內(nèi) 酰 胺 類 抗 生 素 ，抗 菌 活 性 強 ， 對 -內(nèi) 酰 胺 酶 （ 包 括 產(chǎn) ESBLS和 AmpC酶 ） 高 度 穩(wěn) 定 。 對 銅 綠 假 單 胞 菌 外 膜的 透 過 性 強 ， 最 低 抑 菌 濃 度 （ MIC） 與 最 低 殺菌 濃 度 （ MBC） 非 常 接 近 ， 對 革 蘭 陰 性 菌 也 有一 定 的 抗 菌 后 效 應 （ PAE） 。 v 氨 基 糖 苷 類 抗 生 素 v 大 環(huán) 內(nèi) 酯

5、類 抗 生 素 近 年 來 開 發(fā) 的 新 品 種 有 羅 紅 霉 素 、 克 拉 霉 素 、 阿奇 霉 素 、 乙 酰 麥 迪 霉 素 、 羅 他 霉 素 等 ， 在 藥 效 學 、藥 動 學 特 性 以 及 不 良 反 應 等 方 面 較 沿 用 品 種 均 有 所改 進 。 對 胃 酸 的 穩(wěn) 定 性 增 加 ， 生 物 利 用 度 高 ， 血 藥濃 度 和 組 織 濃 度 增 高 ， 半 衰 期 延 長 ， 每 日 的 給 藥 劑量 及 給 藥 次 數(shù) 減 少 ， 胃 腸 道 等 不 良 反 應 也 明 顯 減 輕 ，臨 床 適 應 證 有 所 擴 大 。 v 四 環(huán) 素 類 抗 生

6、素v 糖 肽 類 抗 生 素 萬 古 霉 素 、 去 甲 萬 古 霉 素 與 替 考 拉 寧 是 控 制 MRSA等革 蘭 陽 性 菌 重 癥 感 染 “ 王 牌 ” 藥 物 。 新 糖 肽 類 抗 生素 (1)Oritauancin AUC比 萬 古 霉 素 大 10倍 ， 對 耐 萬古 霉 素 腸 球 菌 （ VRE） MRS與 耐 青 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌（ PRSP） 有 較 強 活 性 ； （ 2） 雷 莫 拉 寧 ： 能 抑 制 細胞 壁 肽 聚 糖 合 成 ， 但 作 用 位 點 不 同 于 萬 古 霉 素 。 對需 氧 性 與 厭 氧 性 革 蘭 陽 性 細 菌 有 強

7、大 殺 菌 作 用 ， 對耐 萬 古 霉 素 的 屎 腸 球 菌 也 有 作 用 。 抗生素作用機理 v尋 找 新 的 抗 生 素 仍 然 是 很 重 要 的 任 務 。 以 抗腫 瘤 、 抗 病 毒 、 抗 真 菌 、 抗 原 蟲 、 廣 譜 和 抗耐 藥 菌 的 抗 生 素 為 主 要 研 究 方 向 。 1.2維生素類藥物的微生物生產(chǎn) v -胡 蘿 卜 素v維 生 素 Cv維 生 素 E v 國 內(nèi) 用 真 菌 三 孢 布 拉 霉 生 產(chǎn) -胡 蘿 卜 素 的 產(chǎn) 量 達2.0 g/L， 國 外 已 達 到 (3 3.5) g/L.粘 紅 酵 母 、 布拉 克 須 霉 、 叢 霉 等 真

8、 菌 也 具 有 生 產(chǎn) -胡 蘿 卜 素 的能 力 。 除 真 菌 外 ， 如 球 型 紅 桿 菌 、 瑞 士 乳 桿 菌 等 某些 細 菌 也 具 有 發(fā) 酵 生 產(chǎn) 類 胡 蘿 卜 素 的 能 力 。v Vc的 微 生 物 發(fā) 酵 法 早 已 取 得 重 要 突 破 ， 利 用 “ 大 小菌 落 ” 菌 株 混 合 培 養(yǎng) 生 產(chǎn) VC的 工 藝 已 經(jīng) 成 熟 ， 進 入產(chǎn) 業(yè) 化 。 v 目 前 利 用 氧 化 葡 萄 糖 桿 菌 與 一 種 蠟 狀 芽 孢 桿 菌 混 合菌 共 固 定 化 發(fā) 酵 技 術(shù) ， 可 將 Vc的 收 率 提 高 到 80%以上 ， 生 產(chǎn) 周 期 比

9、傳 統(tǒng) 工 藝 縮 短 1/3。v 日 本 研 究 人 員 發(fā) 現(xiàn) 一 種 纖 細 裸 藻 能 同 時 生 產(chǎn) Vc、 VE和 -胡 蘿 卜 素 ,藻 體 生 物 量 產(chǎn) 量 可 達 每 升 培 養(yǎng) 液20 g， 從 中 提 取 Vc和 VE量 為 60 mg/L, -胡 蘿 卜 素40 mg/L. 1.3多烯脂肪酸的微生物生產(chǎn)v -亞 麻 酸 (GLA) :人 體 不 能 合 成 而 又 必 需 的 多 烯 脂肪 酸 ， 缺 乏 時 會 導 致 機 體 代 謝 的 紊 亂 而 引 起 多 種 疾病 ， 如 高 血 壓 、 糖 尿 病 、 癌 癥 、 病 毒 感 染 以 及 皮 膚老 化 等

10、。 因 此 ， 體 內(nèi) 補 充 GLA已 成 為 治 療 疾 病 和 抗衰 老 的 重 要 手 段 。v GLA在 體 內(nèi) 轉(zhuǎn) 化 為 二 高 -亞 麻 酸 (DGLA)和 花 生 四 烯酸 (AA)， 兩 者 再 分 別 合 成 前 列 腺 素 類 物 質(zhì) 而 發(fā) 揮 對人 體 生 理 功 能 的 重 要 調(diào) 節(jié) 作 用 。v 深 黃 被 孢 霉 可 用 于 生 產(chǎn) -亞 麻 酸 。 v 二 十 碳 五 烯 酸 (EPA)和 二 十 二 碳 六 烯 酸 (DHA) 是 很有 價 值 的 醫(yī) 藥 保 健 產(chǎn) 品 ， 在 海 洋 冷 水 魚 中 含 量 頗 豐 ，也 可 用 發(fā) 酵 工 程 的

11、方 法 生 產(chǎn) 。v 細 小 球 藻 中 EPA含 量 高 達 總 油 量 的 99%， 等 鞭 藻 的DHA含 量 為 5.4 mg/g干 藻 體 。v 網(wǎng) 粘 菌 SR21， DHA含 量 為 其 干 菌 體 脂 質(zhì) 含 量 的 30%40%， 通 過 發(fā) 酵 生 產(chǎn) ， 每 升 培 養(yǎng) 液 產(chǎn) 量 為 4.5 。 1.4醫(yī)用酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn) v 心 腦 血 管 病 醫(yī) 用 酶 (鏈 激 酶 、 葡 萄 糖 激 酶 、 金 葡 激酶 )： 上 海 醫(yī) 科 大 學 獲 高 表 達 鏈 激 酶 , 這 種 重 組 鏈激 酶 一 進 入 中 試 生 產(chǎn) 后 , 在 我 國 作 為 第 一 個 擁

12、 有 自主 知 識 產(chǎn) 權(quán) 的 一 類 生 物 技 術(shù) 新 藥 進 人 商 品 化 , 成 為挽 救 急 性 心 肌 梗 塞 和 腦 血 栓 形 成 等 疾 病 的 特 效 藥 。v 心 腦 血 管 病 保 健 用 酶 ： 中 國 根 霉 產(chǎn) 新 的 溶 血 栓 酶 ，納 豆 激 酶 和 天 酷 激 酶 。 v酶 與 帕 金 森 氏 癥 ( 酪 氨 酸 酶 )： 一 種 假 單 胞菌 具 有 高 產(chǎn) 酪 氨 酸 酶 的 能 力 ， 為 微 生 物 酶 法生 產(chǎn) 多 巴 創(chuàng) 造 了 先 決 條 件 。 弗 氏 檸 檬 桿 菌 在一 酪 氨 酸 誘 導 下 具 有 高 效 表 達 酪 氨 酸 酶

13、的 催化 活 性 , 可 獲 得 多 巴 產(chǎn) 量 9.5克 /升 , 其 他 技術(shù) 如 ， 固 定 化 包 埋 假 單 胞 菌 、 術(shù) 建 構(gòu) 含 有 酪氨 酸 酶 基 因 的 蘇 云 金 芽 胞 桿 菌 等 。 v酶 與 高 歇 氏 病 (葡 萄 糖 腦 苷 脂 酶 )： 利 用 轉(zhuǎn) 基因 技 術(shù) 將 編 碼 葡 萄 糖 腦 苷 脂 酶 的 基 因 轉(zhuǎn) 入 煙草 植 物 取 得 成 功 , 含 有 基 因 的 轉(zhuǎn) 基 因 煙 草 植物 獲 得 有 效 表 達 , 即 可 從 該 “ 工 程 煙 草 植 物 ” 煙 葉 中 提 取 這 種 酶 蛋 白 。 1.5紫杉醇的微生物合成 v 真 菌

14、安 德 烈 紫 杉 菌 v 小 孢 盤 多 毛 孢 菌 v 將 紫 杉 醇 合 成 酶 基 因 轉(zhuǎn) 入 紫 杉醇 產(chǎn) 生 菌 中 ， 有 可 能 建 構(gòu) 高 產(chǎn)紫 杉 醇 的 “ 工 程 菌 ” 。 1.6基因工程制藥工業(yè)v 促 紅 細 胞 生 成 素 （ EPO） ， 集 落 刺 激 因 子 （ CSF） ，表 皮 生 長 因 子 （ EGF） ， 人 生 長 激 素 ， 干 擾 素 ， 白 介素 ， 各 種 疫 苗 ， 單 克 隆 抗 體 等 。v 免 疫 抑 制 劑 ， 免 疫 激 活 劑 ， 糖 苷 酶 抑 制 劑 ， 脂 酶 抑制 劑 ， 類 固 醇 激 素 等 。 2細胞組織培養(yǎng)與

15、藥物 2.1細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)中藥有效成份v 中 藥 的 有 效 成 份 主 要 是 細 胞 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 ， 因 此 利用 培 養(yǎng) 細 胞 代 謝 產(chǎn) 物 的 研 究 是 生 物 技 術(shù) 在 中 藥 生 產(chǎn)中 應 用 較 早 的 一 個 方 面 .目 前 已 經(jīng) 從 400多 種 植 物 建立 了 組 織 和 細 胞 培 養(yǎng) 物 ， 從 中 分 離 出 600多 種 代 謝產(chǎn) 物 ， 其 中 40多 種 化 合 物 在 產(chǎn) 量 上 超 過 或 等 于 原 植物 ， 為 利 用 細 胞 培 養(yǎng) 技 術(shù) 工 業(yè) 化 生 產(chǎn) 醫(yī) 藥 奠 定 了 基礎(chǔ) 。 v 通 過 篩 選 高 產(chǎn) 細 胞

16、 系 ， 改 進 培 養(yǎng) 條 件 和 技 術(shù) ， 設 計適 合 植 物 培 養(yǎng) 細 胞 的 發(fā) 酵 罐 等 手 段 ， 對 煙 草 、 紫 草 、長 春 花 、 丹 參 、 紅 豆 杉 、 三 尖 杉 、 洋 地 黃 、 人 參 、三 七 、 西 洋 參 、 毛 地 黃 、 茜 草 、 黃 連 和 彩 葉 紫 蘇 的多 種 植 物 細 胞 進 行 了 大 規(guī) 模 懸 浮 培 養(yǎng) 的 試 驗 ， 以 生產(chǎn) 煙 堿 、 紫 草 寧 、 長 春 藤 堿 、 丹 參 酮 、 紫 杉 醇 、 三尖 杉 酯 堿 、 洋 地 黃 堿 、 人 參 皂 、 毛 地 黃 堿 、 茜 草 素 、黃 連 素 和 紫

17、蘇 素 等 藥 物 .發(fā) 酵 罐 規(guī) 模 已 達 到 (1075) L， 其 中 紫 草 寧 、 茜 草 素 和 人 參 皂 已 商 業(yè) 化 .近年 來 ， 紫 杉 醇 含 量 已 經(jīng) 比 原 植 物 提 高 了 100多 倍 ，達 到 153 mg/L。 2.2遺傳轉(zhuǎn)化器官的培養(yǎng)與藥物生產(chǎn)v 由 農(nóng) 桿 菌 感 染 植 物 組 織 形 成 的 “ 畸 形 芽 ” 和 “ 毛 狀根 ” 是 繼 細 胞 培 養(yǎng) 后 又 一 重 要 培 養(yǎng) 系 統(tǒng) 。 中 藥 許 多有 效 成 分 的 形 成 與 器 官 分 化 過 程 密 切 相 關(guān) ， 而 在 培養(yǎng) 細 胞 中 有 效 成 分 不 存 在 或

18、 含 量 極 少 .與 細 胞 培 養(yǎng)相 比 ， 毛 狀 根 培 養(yǎng) 有 明 顯 優(yōu) 點 ： 生 長 速 度 快 、 分 枝多 ， 弱 向 地 性 ； 毛 狀 根 處 于 器 官 化 水 平 ， 其 生 理 生化 、 遺 傳 特 性 穩(wěn) 定 ， 具 有 穩(wěn) 定 的 次 生 代 謝 物 合 成 能力 ， 毛 狀 根 培 養(yǎng) 系 統(tǒng) 對 根 類 中 藥 材 中 有 效 成 分 的 生產(chǎn) 更 為 重 要 。 v 毛 狀 根 (hairy roots)是 發(fā) 根 農(nóng) 桿 菌（ Agrobacterium rhizogenes） 感 染 雙 子 葉植 物 后 ， 其 Ri質(zhì) 粒 上 的 TDNA片 斷

19、整 合 進 植物 細 胞 核 基 因 組 中 誘 導 產(chǎn) 生 的 一 種 特 殊 表 現(xiàn)型 ， 近 10年 來 已 發(fā) 展 成 一 種 新 的 培 養(yǎng) 系 統(tǒng) 。 v上 海 中 醫(yī) 藥 大 學 對 黃 芪 毛 狀 根 的 大 規(guī) 模 培 養(yǎng)技 術(shù) 和 化 學 成 分 與 藥 理 活 性 進 行 了 深 入 研 究 ，在 3 L、 5 L、 10 L培 養(yǎng) 器 中 經(jīng) 21d培 養(yǎng) ， 有 效成 分 產(chǎn) 量 可 達 10 g/L (干 重 )， 而 且 黃 芪 毛 狀根 中 皂 甙 、 黃 酮 、 多 糖 、 氨 基 酸 等 含 量 近 似于 藥 用 黃 芪 ， 其 作 用 效 價 也 與 藥

20、用 黃 芪 基 本一 致 。 v 我 國 從 黃 花 蒿 中 分 離 鑒 定 出 的 青 蒿 素 是 抗 瘧 有 效 單體 ， 對 腦 型 和 抗 氯 喹 性 瘧 疾 有 特 效 ， 成 為 WHO推 薦產(chǎn) 品 .劉 春 朝 等 利 用 Ri1601質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 化 青 蒿 葉 片 篩 選的 高 產(chǎn) 系 ， 進 行 了 青 蒿 毛 狀 根 合 成 青 蒿 素 的 培 養(yǎng) 工藝 條 件 研 究 ， 取 得 較 好 結(jié) 果 ： 在 優(yōu) 化 條 件 下 ， 經(jīng)25 d培 養(yǎng) ， 青 蒿 素 產(chǎn) 量 達 223.3 mg/L。 目 前 毛 狀 根培 養(yǎng) 系 統(tǒng) 的 中 試 裝 置 已 達 500 L的

21、規(guī) 模 ， 利 用 20 t發(fā)酵 罐 生 產(chǎn) 的 人 參 毛 狀 根 已 開 發(fā) 成 商 品 投 入 市 場 。 2.3藥用植物組織的離體培養(yǎng) v自 1960年 利 用 組 織 培 養(yǎng) 技 術(shù) 將 蘭 花 莖 尖 分 生組 織 進 行 離 體 培 養(yǎng) ， 建 立 無 性 繁 殖 系 并 誘 導分 化 成 植 株 以 來 ， 已 發(fā) 現(xiàn) 能 進 行 離 體 分 化 的植 物 有 千 余 種 ， 能 進 行 快 速 繁 殖 的 有 數(shù) 百 種 ，能 進 行 規(guī) 模 化 和 商 品 化 生 產(chǎn) 的 有 近 百 種 .其 中有 100多 種 藥 用 植 物 經(jīng) 離 體 培 養(yǎng) 分 化 成 植 株 ，對

22、 稀 有 珍 貴 中 藥 品 種 的 保 存 、 繁 育 和 純 化 具有 重 要 意 義 。 v 甜 菊 莖 500 L大 規(guī) 模 培 養(yǎng) 結(jié) 果 表 明 ， 在 25 、2000 lux光 照 、 15 L/min通 氣 量 的 培 養(yǎng) 條 件 下 ， 每批 培 養(yǎng) 小 植 物 數(shù) 量 可 達 20萬 株 。v 通 過 不 斷 過 篩 、 密 度 梯 度 離 心 以 及 培 養(yǎng) 的 方 法 基 本上 解 決 了 胡 蘿 卜 體 細 胞 胚 胎 同 步 發(fā) 育 的 難 題 ， 實 現(xiàn)了 從 單 細 胞 到 完 整 植 物 發(fā) 育 的 同 步 化 ， 為 胡 蘿 卜 素的 生 產(chǎn) 開 辟 新

23、途 徑 。v 最 近 進 行 的 從 生 物 反 應 器 中 培 養(yǎng) 青 蒿 小 植 物 生 產(chǎn) 萜類 化 合 物 的 嘗 試 ， 為 傳 統(tǒng) 中 藥 的 大 規(guī) 模 培 養(yǎng) 提 供 了先 例 。 2.4生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與藥物生產(chǎn) v植 物 培 養(yǎng) 細 胞 和 微 生 物 具 有 諸 如 酯 化 、 氧 化 、乙 酰 化 、 還 原 化 、 甲 基 化 、 羥 基 化 和 羰 基 化等 多 種 生 物 轉(zhuǎn) 化 能 力 。 生 物 轉(zhuǎn) 化 實 質(zhì) 上 是 一種 酶 催 化 反 應 。 某 些 植 物 酶 能 夠 催 化 微 生 物和 化 學 合 成 很 難 進 行 的 立 體 專 一 和 區(qū) 域 專

24、 一的 反 應 ， 因 此 進 行 自 由 懸 浮 或 固 定 化 細 胞 的生 物 轉(zhuǎn) 化 研 究 就 成 為 植 物 生 物 技 術(shù) 的 一 個 重要 研 究 領(lǐng) 域 。 v熊 果 苷 是 人 類 皮 膚 中 黑 色 素 合 成 的 抑 制 劑 ，是 美 容 產(chǎn) 品 的 重 要 添 加 劑 .利 用 毛 曼 陀 羅 、 長春 花 或 蛇 根 木 的 培 養(yǎng) 細 胞 進 行 的 生 物 轉(zhuǎn) 化 取得 了 成 功 ， 其 產(chǎn) 量 分 別 達 到 7.1 g/L、 9.2 g/L和 18 g/L， 已 經(jīng) 達 到 化 學 合 成 的 產(chǎn) 量 ， 有 希望 進 行 商 業(yè) 化 生 產(chǎn) 。 最 近 將 鬼 臼 毒 轉(zhuǎn) 化 成 它的 -葡 萄 糖 甙 也 獲 得 成 功 ， 轉(zhuǎn) 化 率 達 到294 mg/L。