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1、實 驗 十 二 血 清 肌 酸 激 酶 測 定 與 應(yīng) 用 1 實 驗 目 的 了 解 血 清 肌 酸 磷 酸 激 酶 測 定 的 方 法 。 掌 握 其 測 定 的 應(yīng) 用 與 意 義 。 2 實 驗 原 理 肌 酸 激 酶 （ Creatine phosphokinase， 簡 稱 CK）廣 泛 存 在 于 骨 骼 肌 、 心 肌 和 腦 組 織 中 ， 肝 臟 和 紅細(xì) 胞 等 不 含 此 酶 。 骨 骼 肌 中 含 量 最 豐 富 ， 占 全 身總 量 的 96%之 多 。 肌 酸 磷 酸 激 酶 在 肌 肉 收 縮 中 很 重 要 ， 它 催 化 下 列反 應(yīng) ： 上 述 反 應(yīng) 保

2、 證 肌 肉 收 縮 時 的 能 量 供 應(yīng) 和 運(yùn) 動 后 ATP和 肌 酸 磷酸 的 再 合 成 。 正 常 人 血 清 中 肌 酸 磷 酸 激 酶 主 要 由 骨 骼 肌 和心 肌 細(xì) 胞 透 過 細(xì) 胞 膜 進(jìn) 入 血 液 的 結(jié) 果 ， 其 活 力 很 小 。 正 常值 每 升 血 液 中 100活 力 單 位 以 下 。 運(yùn) 動 訓(xùn) 練 能 使 血 清 肌 酸 酸 磷 酸 活 性 升 高 。 其 原 因 一 般 認(rèn) 為運(yùn) 動 時 缺 氧 , 代 謝 產(chǎn) 物 積 累 ， 供 能 相 對 不 足 等 原 因 ， 引 起肌 細(xì) 胞 膜 通 透 性 升 高 。 或 肌 細(xì) 胞 膜 受 到

3、損 傷 ， 促 使 CK從 細(xì)胞 內(nèi) 釋 放 增 加 ， 進(jìn) 入 血 液 循 環(huán) ， 其 中 以 肌 肉 牽 拉 的 機(jī) 械 性損 傷 或 產(chǎn) 生 血 腫 等 原 因 最 為 重 要 。 滑 雪 運(yùn) 動 和 馬 拉 松 賽 跑 后 ， 血 清 CK的 活 性 較 高 ， 特 別 是 大強(qiáng) 度 的 馬 拉 松 賽 跑 最 高 。 在 運(yùn) 動 后 4小 時 升 高 ， 8-16小 時達(dá) 最 高 值 。 跳 躍 、 短 跑 等 短 時 間 激 烈 運(yùn) 動 ， 沖 擊 性 運(yùn) 動 ，也 易 引 起 CK活 性 升 高 。 大 運(yùn) 動 量 的 訓(xùn) 練 和 100m、 200m跑 比賽 后 ， 血 清 中

4、 CK活 性 都 顯 著 升 高 ， 尤 其 是 在 比 賽 時 ， 升 高更 為 顯 著 。 應(yīng) 用 肌 酸 磷 酸 激 酶 來 作 機(jī) 能 評 定 時 ， 一 般 認(rèn) 為 2-3天 取 血測 定 一 次 , 在 負(fù) 荷 后 經(jīng) 常 處 于 100-200國 際 活 力 單 位 /L。如 果 超 過 200IU/L， 就 是 運(yùn) 動 量 過 大 ， 身 體 尚 未 恢 復(fù) ， 此時 應(yīng) 調(diào) 整 運(yùn) 動 量 。 3 實 驗 器 材 與 試 劑 器 材 器 材 試 管 、 分 光 光 度 計 、 分 析 天 平 、 采 血裝 置 （ 注 射 器 ） 、 水 浴 箱 、 離 心 機(jī) 試 劑 混 合

5、 底 物 pH 7.4 三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷 -鹽 酸 緩 沖 液 ： 稱 取 三 羥 甲 基 氨 基甲 烷 （ Tris） 2.4g， 加 蒸 餾 水 至 100 ml， 再 加 入 0.2 N鹽 酸88.8 ml及 無 水 硫 酸 鎂 0.34g， 調(diào) 節(jié) pH至 7.4。 此 液 在 室 溫 下可 保 存 數(shù) 月 。 0.012 M磷 酸 肌 酸 溶 液 ： 稱 取 磷 酸 肌 酸 鈉 （ C4H8O5-O4PNa3 6H2O） 436 mg， 加 蒸 餾 水 至 100 ml， 調(diào) 節(jié) PH至 7.4，保 存 于 -25 或 普 通 冰 箱 上 層 冰 盒 中 ， 可 用 一

6、 個 月 左 右 。 0.001 M ADP溶 液 ： 稱 取 ADP鈉 鹽 0.233g， 加 蒸 餾 水 至 100 ml，調(diào) 節(jié) PH至 7.4， 保 存 于 -25 或 冰 箱 上 層 冰 盒 中 ， 可 用 一 個 月左 右 。 臨 用 前 ， 取 上 述 （ 1） （ 2） （ 3） 試 劑 各 10 ml混 合 。 在 此 混 合 底 物 液 30 ml中 ， 加 入 鹽 酸 半 胱 氨 酸 0.105g， 調(diào) 節(jié) PH至7.4。 此 試 劑 最 好 新 鮮 配 制 ， 也 可 以 保 存 于 冰 盒 中 。 一 般 可 放 5-7天 ， 若 空 白 管 光 密 度 太 高 ，

7、說 明 有 游 離 肌 酸 產(chǎn) 生 ， 即 不 能 再 用 。 0.3 N 氫 氧 化 鋇 溶 液 稱 取 氫 氧 化 鋇 （ Ba(OH)2 8H2O） 4.73g， 加 蒸 餾 水 使 之 溶 解（ 可 加 熱 助 溶 ） ， 并 稀 釋 到 100 ml。 5% 硫 酸 鋅 溶 液 稱 取 硫 酸 鋅 （ ZnSO4 7H2O） 8.82g， 加 蒸 餾 水 溶 解 ， 并 稀 釋 到 100 ml。 上 述 2、 3兩 種 溶 液 配 好 后 ， 需 進(jìn) 行 滴 定 ， 即 吸 取 5%硫 酸 鋅 溶 液 5 ml， 放 入 50 ml三 角 燒 瓶 中 ， 加 入 酚 酞 指 示 劑

8、 2滴 ， 用 0.3 N Ba(OH) 2溶 液 滴 定 至 出 現(xiàn) 粉 紅 色 30秒 鐘 不 褪 色 為 止 。 Ba(OH)2用 量與 ZnSO4相 等 ， 如 不 相 等 ， 可 稀 釋 較 濃 的 溶 液 。 標(biāo) 準(zhǔn) 肌 酸 溶 液 （ 1.7 M/ml） 準(zhǔn) 確 稱 取 無 水 肌 酸 22.3mg， 置 于 100ml容 量 瓶 中 ， 加 蒸餾 水 使 之 溶 解 ， 并 稀 釋 到 刻 度 ， 置 冰 箱 中 保 存 ， 可 用 數(shù) 日 。 雙 乙 酰 液 先 配 成 1%溶 液 ， 置 棕 色 瓶 中 放 冰 箱 保 存 。 臨 用 時 用 蒸 餾水 稀 釋 20倍 。

9、貯 存 堿 溶 液 稱 取 30g NaOH， 無 水 碳 酸 鈉 （ Na2CO3） 64g， 加 蒸 餾 水使 溶 解 并 稀 釋 至 500 ml， 室 溫 低 時 可 析 出 沉 淀 ， 此 時 應(yīng) 放于 37 水 浴 中 待 沉 淀 溶 解 后 再 使 用 。 -萘 酚 溶 液 稱 取 -萘 酚 1g， 用 上 述 貯 存 堿 液 使 溶 解 ， 并 稀 釋 到100 ml， 此 液 必 須 新 鮮 配 制 ， 否 則 空 白 管 光 密 度 讀 數(shù) 增 高 。 4 實 驗 方 法 與 步 驟 肌 酸 磷 酸 激 酶 顯 色 法 肌 酸 磷 酸 激 酶 顯 色 法 。 測 定 CK活

10、 性 原 理 ： 利 用 上 述 反 應(yīng) 所 生 成 的 肌 酸 與 -萘 酚和 雙 乙 酸 反 應(yīng) ， 生 成 紅 色 化 合 物 。 在 一 定 范 圍 內(nèi) ， 紅 色 深淺 與 肌 酸 含 量 成 正 比 ， 與 同 樣 處 理 的 肌 酸 標(biāo) 準(zhǔn) 液 比 色 ， 求得 酶 的 活 力 。 加 入 物 （ ml） 空 白 管 標(biāo) 準(zhǔn) 管 測 定 管混 合 底 物 0.75 0.75 0.75血 清 0.1標(biāo) 準(zhǔn) 肌 酸 （ 1.7 M/ml） 0.1 蒸 餾 水 0.1 置 37 水 浴 保 溫 30 min Ba(OH)2溶 液 0.5 0.5 0.5ZnSO4溶 液 0.5 0.5

11、0.5蒸 餾 水 0.5 0.5 0.5 混 勻 ， 離 心 5-10 min 測 定 操 作 步 驟 （ 如 下 表 3-14） ： 表 3-14 單 位 ： ml 上 清 液 1. 0.5 1. 0.5 1. 0.5 -萘 酚 溶 液 1. 1 1. 1 1. 1雙 乙 酰 液 1. 0.5 1. 0.5 1. 0.5置 37 水 浴 保 溫 15 min 蒸 餾 水 1. 3 1. 3 1. 3離 心 35min， 520nm波 長 處 進(jìn) 行 比 色 讀 取 各 管 的 光 密 度 計 算 ： 肌 酸 磷 酸 激 酶 檢 測 試 劑 盒 法 ： 原 理ATP+葡 萄 糖 葡 萄 糖 -

12、6-磷 酸 +ADP 為 作 用 酶葡 萄 糖 -6-磷 酸 +NADP+ 6-磷 酸 -葡 萄 糖 +NADPH+H+ 為 作 用 酶 器 材 與 試 劑 ： 試 管 、 可 見 光 分 光 光 度 計 、 電 子 分 析 天平 、 采 血 裝 置 （ 注 射 器 ） 、 水 浴 鍋 、 離 心 機(jī) 、 試 劑 盒 測定 法 。 如 ： 采 用 中 生 北 控 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 生 產(chǎn) 的 肌 酸 磷酸 激 酶 檢 測 試 劑 盒 ， 該 試 劑 盒 適 用 于 全 自 動 ， 半 自 動 生化 分 析 儀 及 分 光 光 度 計 測 定 人 血 清 中 CK的 酶 活

13、 濃 度 。 基 本 參 數(shù) ： 波 長 ： 340 nm， 溫 度 ： 25 ,30 ,37 ， 比色 杯 光 徑 ： 1cm。 試 劑 主 要 成 分 實 驗 濃 度R1 己 糖 激 酶 (HK) 3000 U/L葡 萄 糖 -6-磷 酸 脫 氫 酶 ( G6PDH) 2000 U/LADP 2 mmol/LAMP 5 mmol/LAp5A 10 mol/LNADP 2 mmol/LNAC 20 mmol/L磷 酸 肌 酸 30 mmol/LR2 咪 唑 緩 沖 液 (pH 6.7， 25 ) 100mmol/L葡 萄 糖 20mmol/L 原 裝 試 劑 雜 2-8 避 光 保 存 ，

14、有 效 期 12個 月 。 復(fù) 溶 后 在 2-8 可 穩(wěn) 定 7天 ， 在15-25 可 穩(wěn) 定 12小 時 。 試 劑 盒 主 要 成 分 與 濃 度 ， 見 表 3-15： 表 3-15 肌 酸 磷 酸 激 酶 檢 測 試 劑 盒 成 分 與 濃 度 加 入 物 （ ml） 空 白 管 樣 品 管工 作 液 2.50 0.50蒸 餾 水 2.50 樣 品 0.50混 合 均 勻 ， 在 37 溫 育 2分 鐘 后 ， 讀 取 初 始 吸 光 度 ， 然 后 在 精確 1分 鐘 ， 2分 鐘 ， 3分 鐘 時 分 別 讀 取 吸 光 度 ， 確 定 每 分 鐘 平 均吸 光 度 變 化 A

15、。表 3-16 肌 酸 磷 酸 激 酶 檢 測 試 劑 盒 的 操 作 操 作 步 驟 ： 取 一 定 量 R2（ 參 看 R1瓶 簽 ） 復(fù) 溶 1瓶 R1，溶 解 后 即 為 工 作 液 。 工 作 液 預(yù) 先 保 溫 至 測 試 溫 度 。 計 算 ： CK（ U/L） =（ A樣 品 /分 A空 白 /分 ） F F=(Vt/Vs 消 光 系 數(shù) ) 1000=8095（ 37 ） Vt=反 應(yīng) 總 體 積 Vs=樣 品 體 積 NADPH在 340 nm波 長 下 毫 克 分 子 消 光 系 數(shù) =6.3 參 考 值 ： 男 ： 24-195 U/L； 女 ： 24-170 U/L

16、線 性 上 限 ： CK活 力 可 達(dá) 1500U/L（ 37 ） 注 意 事 項 ： 當(dāng) A/分 大 于 0.0360（ F=4127） ， 0.0190（ F=8095） 時 ， 樣 品 用 生 理 鹽 水 稀 釋 后 重 新 測 定 ， 結(jié) 果乘 以 稀 釋 倍 數(shù) ； 試 劑 空 白 吸 光 度 大 于 0.6時 ,勿 用 ； 血 清 CK不 穩(wěn) 定 ， 樣 品 收 集 后 要 盡 快 分 析 ， 在 室 溫 4小 時 ， 在 4 8-12小 時 后 ， CK活 性 即 要 下 降 。 5 注 意 事 項 紅 細(xì) 胞 中 肌 酸 磷 酸 激 酶 活 力 很 低 ， 故 溶 血 標(biāo) 本

17、不 影 響 測定 結(jié) 果 。 混 合 底 物 的 pH要 求 準(zhǔn) 確 。 氧 氧 化 鋇 和 硫 酸 鋅 要 滴 定 至 恰 好 等 量 ， 否 則 離 心 后 會 出現(xiàn) 混 濁 。 特 別 是 鋇 離 子 多 時 ， 不 能 完 全 被 硫 酸 根 清 除 盡 ，使 顯 色 混 濁 而 影 響 測 定 結(jié) 果 。 肌 酸 磷 酸 激 酶 活 力 單 位 定 義 ： 以 1 ml血 清 在 37 與 底 物作 用 1小 時 ， 生 成 1 M肌 酸 為 1個 肌 酸 磷 酸 激 酶 活 力 單 位 。 酶 的 活 力 太 高 時 ， 應(yīng) 將 血 清 用 Tris-HCl緩 沖 液 稀 釋 后 再行 測 定 ， 結(jié) 果 乘 以 稀 釋 倍 數(shù) 。 因 -萘 酚 本 身 顏 色 不 恒 定 ， 試 劑 空 白 每 次 深 淺 不 同 ， 故不 能 用 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 工 作 法 。 6 思 考 題 血 清 CK活 性 是 賽 前 進(jìn) 行 機(jī) 能 評 定 的 一 項重 要 指 標(biāo) ， 試 述 其 理 由 。 采 血 時 擠 壓 組 織 對 結(jié) 果 有 何 影 響 ？