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1、第九章第九章 維生素生素類藥物的分析物的分析 Chapter 9 Analysis of VitaminesVitamine A AVitamine B B1 1Vitamine C CVitamine E E 概述q維生素：生素：維持機(jī)體正常代謝必需的一類活性物質(zhì)維持機(jī)體正常代謝必需的一類活性物質(zhì)q均為人體必須且不能自身合成，結(jié)構(gòu)和生理功能均為人體必須且不能自身合成，結(jié)構(gòu)和生理功能各異各異q目前共目前共3030余種，以大寫拉丁字母命名余種，以大寫拉丁字母命名q通常按溶解性分為通常按溶解性分為脂溶性脂溶性維生素生素（A、D、E等）等）和和水溶性水溶性維生素生素（B族、族、C族等）族等）第一節(jié)第

2、一節(jié) 維生素維生素Av2-Cis Neovitamin Aav4-Cis Neovitamin Abv2,4-dicis Neovitamin Acv6-Cis Isovitamin Aav 2,6-dicis Isovitamin Ab維生素維生素A醇醇Retinol(Vit A alcohol)維生素維生素A 醋酸酯醋酸酯（VA acetate）維生素維生素A 棕櫚酸酯棕櫚酸酯(VA polmitate)912345678V it A3V it A1H2O-vit A:具有共具有共軛多多烯醇醇側(cè)鏈的的環(huán)己己烯具有多種異構(gòu)體具有多種異構(gòu)體（新新VA、異異VA）,其生物其生物效價和光譜各有不同

3、效價和光譜各有不同易發(fā)生脫氫、脫水、聚合易發(fā)生脫氫、脫水、聚合,得到脫氫維生素得到脫氫維生素A（vit A2)、去水維生素去水維生素A（vitA3）、）、鯨醇鯨醇性性質(zhì)不溶于水，溶于有機(jī)溶劑不溶于水，溶于有機(jī)溶劑強(qiáng)紫外吸收強(qiáng)紫外吸收，max 325328nm不穩(wěn)定：易被紫外光裂解，氧、氧化不穩(wěn)定：易被紫外光裂解，氧、氧化劑等氧化劑等氧化可與可與SbCl3顯色顯色鑒別1）三氯化銻反應(yīng)三氯化銻反應(yīng)條件：無水、無醇條件：無水、無醇2）UVvit A max：326nm加熱后加熱后（vit A3）max:348、367、389nm3）TLC無醇氯仿無醇氯仿含量表示含量表示I.U.(Internatio

4、nal Unit)效價效價(I.U./g)維生素A的含量用生物效價即國際單位（IU/g）來表示1g pure VA acetate 2.907106 I.U.WHOVA acetateVA alcohol Potency (I.U./g)2.9071063.331064.效價效價測定定UV（三點(diǎn)校正法）、三三點(diǎn)校正法）、三氯化銻比色法氯化銻比色法、HPLC法法UV（三點(diǎn)校正法）三點(diǎn)校正法）1）前提條件：）前提條件：雜質(zhì)的吸收在雜質(zhì)的吸收在310340nm波波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減小；長的增大吸收度減小；物質(zhì)對光的吸收具有加和性：物質(zhì)對光的吸收具有加

5、和性：各波長處的吸收度是維生素各波長處的吸收度是維生素A與雜質(zhì)吸收度的代數(shù)和與雜質(zhì)吸收度的代數(shù)和4.效價測定效價測定UV（三點(diǎn)校正法）、三氯化銻比色法三點(diǎn)校正法）、三氯化銻比色法、HPLC法法UV（三點(diǎn)校正法）三點(diǎn)校正法）第一步：第一步：A的的選擇直接用測得的吸收度直接用測得的吸收度A還是校正后的還是校正后的A校？校？選擇依據(jù)：依據(jù)：所選所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除值中雜質(zhì)的干擾已基本消除第二步：求第二步：求注意注意：C為混合樣品濃度為混合樣品濃度2 2）計算步驟：）計算步驟：第三步：求效價第三步：求效價 參數(shù)參數(shù) Vit A(醇)Vit A(醋酸酯)1 IU 0.300ug 0.344ug

6、 效價標(biāo)(IU/g)3.33106 2.907106 (E1cm)標(biāo) 1820 1530 (異丙醇，325nm)(環(huán)己烷中328nm)1830 19001%換算因數(shù)=效價標(biāo)(E1cm)標(biāo)1%第四步：第四步：計算算標(biāo)示量示量3）A值的的選擇 第一法：第一法：(直接直接測定法，適用于定法，適用于維生素生素A醋酸醋酸酯)max在在326329nm?否否第二法測定第二法測定是是A/A328-規(guī)定值規(guī)定值0.020.02是是用用A328計算計算E計算計算A校正校正3.52(2A328-A316-A340)、否否A校正校正-A328 A328f=用第二法測定用第二法測定用用A A校正計算校正計算用用A32

7、8A328計算計算用第二法測定用第二法測定-15%-3%0 3%-15%-3%0 3%第二法：（皂化法，適用于第二法：（皂化法，適用于維生素生素A醇醇）第一法無法消除雜質(zhì)干擾時用此法第一法無法消除雜質(zhì)干擾時用此法 max在在323327nm?否否分離純化后測定分離純化后測定是是A300/A3270.730.73計算計算A校正校正 6.815A325-2.555A310-4.260A334、是是A校正校正-A325 A325f=否否分離純化后測定分離純化后測定用用A A校正計算校正計算用用A325A325計算計算 -3%0 3%-3%0 3%用用A A校正計算校正計算討論v維生素A醋酸酯的吸光度

8、校正公式是用直線方程式法推導(dǎo)而來的，維生素A醇的吸光度校正公式是用相似三角形法推導(dǎo)而來的；v采用三點(diǎn)校正法，除其中一個點(diǎn)是在吸收峰波長處測得外，其它兩點(diǎn)分別在吸收峰兩側(cè)的波長處測定，因此要求儀器波長準(zhǔn)確；v中國藥典（2005年版）收載的維生素A、維生素A膠丸、維生素AD膠丸、維生素AD滴劑均采用本法測定含量。例：維生素例：維生素AD膠丸的測定膠丸的測定已知：已知：w=0.1827g，0.07985，標(biāo)示量標(biāo)示量10000IU，V=50ml，稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)D50/2251）max在在326329nm以內(nèi)，第一法計算以內(nèi)，第一法計算2）計算各波長與計算各波長與A328比值比值3）340nm、36

9、0nm處差值超過規(guī)定的處差值超過規(guī)定的0.020.02，需計需計算校正吸收度算校正吸收度A校正校正 A校正校正3.52(2A328-A316-A340)0.6374）A校正校正與與A328比較比較：A校正校正-A328 A328 應(yīng)以應(yīng)以A校正校正計算計算-3.925）計算計算 A校正校正/Cl=A校正校正/(w/VD)=61.876)計算效價及標(biāo)示量計算效價及標(biāo)示量 效價效價 1900117553IU/g 標(biāo)示量效價標(biāo)示量效價 /標(biāo)示量標(biāo)示量93.9Vit B1 鹽酸硫胺Thiamine Hydrochloride第二節(jié)第二節(jié) Vit B1氨基嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過亞甲氨基嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過亞甲

10、基連接成的季銨類化合物基連接成的季銨類化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與鑒別結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與鑒別v噻噻唑環(huán)在唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可被高鐵氰化鉀等氧化劑氧化，堿性介質(zhì)中可被高鐵氰化鉀等氧化劑氧化，然后與嘧啶環(huán)上的然后與嘧啶環(huán)上的-NH2縮合生成縮合生成具有熒光的硫色素具有熒光的硫色素，后者后者易溶于異丁醇中顯強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光易溶于異丁醇中顯強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，該反應(yīng)又稱，該反應(yīng)又稱為為硫色素?zé)晒夥磻?yīng)。為維生素硫色素?zé)晒夥磻?yīng)。為維生素B1所特有。所特有。2.性性質(zhì)1）溶解性（）溶解性（鹽酸酸鹽）：易溶于水，溶液顯酸性易溶于水，溶液顯酸性2）硫色素反）硫色素反應(yīng)（特征反（特征反應(yīng)）：）：噻唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可噻唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可被高鐵

11、氰化鉀等氧化劑氧化，然后與嘧啶環(huán)上的被高鐵氰化鉀等氧化劑氧化，然后與嘧啶環(huán)上的-NH2縮合生成縮合生成具有熒光的硫色素具有熒光的硫色素，后者，后者易溶于異丁易溶于異丁醇中顯強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光醇中顯強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，該反應(yīng)又稱為，該反應(yīng)又稱為硫色素?zé)晒饬蛏責(zé)晒夥磻?yīng)。為維生素反應(yīng)。為維生素B1所特有所特有 NaOHH2O環(huán)化cyclization O2H硫色素硫色素 Thiochrome溶于丁醇，顯藍(lán)色熒光溶于丁醇，顯藍(lán)色熒光 be soluble in butanol and produce blue fluorescence3）生成沉淀反應(yīng)）生成沉淀反應(yīng)v分子結(jié)構(gòu)中含有雜環(huán)，易與生物堿沉淀劑分子結(jié)

12、構(gòu)中含有雜環(huán)，易與生物堿沉淀劑(碘化鉍鉀、碘化鉍鉀、碘化汞鉀、苦味酸等碘化汞鉀、苦味酸等)，硅鎢酸，雷氏鹽等作用形成組，硅鎢酸，雷氏鹽等作用形成組成恒定的沉淀。成恒定的沉淀。v 維生素維生素B1在堿性加熱條件下反應(yīng)放出在堿性加熱條件下反應(yīng)放出H2S，與，與Pb(Ac)2試液形成黑色試液形成黑色PbS4)紫外吸收特征：246nm的波長處測定吸光度，吸收系數(shù)為406436；5)氯化物特性：本品為鹽酸鹽，其水溶液呈氯化物的鑒別反應(yīng)；3.鑒別1）硫色素反硫色素反應(yīng)vit B1 醇層顯藍(lán)色熒光醇層顯藍(lán)色熒光（硫色素硫色素）熒光消失熒光消失2）沉淀反）沉淀反應(yīng) 與與K2HgI4、KI-I、硅鎢酸等硅鎢酸等

13、3）硝酸硝酸鉛反反應(yīng) vitB1+NaOH Na2S PbS4 4）氯化物反化物反應(yīng) NaOH K3Fe(CN)6O正丁醇H+OH-Pb2+1）非水滴定法）非水滴定法 Vit B1+2HClO4 Vit B12HClO4 溶劑：溶劑：HAc，加，加Hg(Ac)2 T.S.指示劑：喹哪啶紅指示劑：喹哪啶紅-亞甲藍(lán)混合指示劑亞甲藍(lán)混合指示劑 終點(diǎn)：天藍(lán)色，振搖終點(diǎn)：天藍(lán)色，振搖30s30s不褪色不褪色2）UV維生素生素B1分子具有共分子具有共軛雙雙鍵結(jié)構(gòu)，在紫外區(qū)有吸收。構(gòu)，在紫外區(qū)有吸收。中國中國藥典典維生素生素B1片片劑和注射和注射劑含量的含量的測定定含量含量測定定3 3）硫色素?zé)晒夥ǎ┝蛏?/p>

14、熒光法 原理：原理：vit B1 測定熒測定熒光光 （激發(fā)波長激發(fā)波長365nm，檢測波長檢測波長435nm）方法方法：NaOH K3Fe(CN)6O異丁醇對照液對照液+NaOH+鐵氰化鉀鐵氰化鉀+異丁醇異丁醇 S+NaOH+異丁醇異丁醇 d供試液供試液+NaOH+鐵氰化鉀鐵氰化鉀+異丁醇異丁醇 A +NaOH+異丁醇異丁醇 b計算計算：特點(diǎn)特點(diǎn)：（1）靈敏度高，專屬性強(qiáng)，代謝產(chǎn)物不干擾，）靈敏度高，專屬性強(qiáng)，代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析適用于體液分析 （2）非定量反應(yīng)，只在一定條件下形成的硫色）非定量反應(yīng)，只在一定條件下形成的硫色素與素與維生素生素B1濃度成正比，度成正比，操作繁瑣，干擾因

15、素操作繁瑣，干擾因素多多第三第三節(jié) Vit C612345v結(jié)構(gòu)構(gòu)v 又稱又稱L-抗壞血酸抗壞血酸v 結(jié)構(gòu)與糖構(gòu)與糖類相似相似v2.性性質(zhì)和和鑒別v1）溶解性：易溶于水，水溶液酸性；乙醇中微溶；）溶解性：易溶于水，水溶液酸性；乙醇中微溶；三三氯甲甲烷或乙或乙醚中不溶中不溶v2）還原性（二原性（二烯醇基）：醇基）：可被氧化成二可被氧化成二酮基基L-抗壞血酸抗壞血酸 L-去氫抗壞血酸去氫抗壞血酸 L-二酮古羅糖酸二酮古羅糖酸L-ascorbic acid L-dehydroascorbic acid L-anhydroascorbic acid 有生物活性有生物活性 有生物活性有生物活性 無生物活

16、性無生物活性with biological activity with biological activity without biological activity 3）酸性：）酸性：C-3 pKa 4.17，C-2 pKa 11.57 通常顯一元酸，可通常顯一元酸，可與與Na2CO3成鹽成鹽4）水解性（內(nèi)）水解性（內(nèi)酯環(huán)）：）：強(qiáng)堿中水解開環(huán)強(qiáng)堿中水解開環(huán)5）旋光性：旋光性：6）糖）糖類性性質(zhì)：vit C 藍(lán)色色三氯醋酸或鹽酸吡咯H2O50blue-3H2O糠醛furfural-CO2戊糖pentaose糖的反應(yīng)糖的反應(yīng)7）紫外吸收特性共軛雙鍵，其稀鹽酸溶液243nm中性、堿性265nm

17、Fehling試劑試劑 Cu2O（紅色）紅色）（堿性酒石酸銅）（堿性酒石酸銅）AgNO3 Ag(黑色沉淀黑色沉淀)2,6-二氯靛酚二氯靛酚 酚亞胺酚亞胺(褪色褪色)KMnO4 MnO2(褪色褪色)亞甲藍(lán)亞甲藍(lán) (褪色褪色)Vit C+含量含量Assay 碘量法碘量法原理：維生素原理：維生素C在醋酸酸性條件下，可被碘定量氧化在醋酸酸性條件下，可被碘定量氧化 淀粉指示劑淀粉指示劑測定注意事項(xiàng)：測定注意事項(xiàng)：稀醋酸：酸性條件稀醋酸：酸性條件vit C被空氣中被空氣中O2氧化慢氧化慢 新沸過的冷水：減少水中氧的影響新沸過的冷水：減少水中氧的影響 立即滴定：避免被立即滴定：避免被O2氧化氧化 注射液中有

18、注射液中有NaHSO3，可加入丙酮消除其干擾，可加入丙酮消除其干擾自身指示終點(diǎn)：滴定至溶液顯紅色自身指示終點(diǎn)：滴定至溶液顯紅色 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：快速滴定：避免其他還原性物質(zhì)干擾快速滴定：避免其他還原性物質(zhì)干擾 方法專屬性比碘量法高但需經(jīng)常標(biāo)定方法專屬性比碘量法高但需經(jīng)常標(biāo)定2,6-2,6-二氯靛酚二氯靛酚高效液相色高效液相色譜法法v色譜條件：色譜柱：ODS(4.6mm200mm,5m)；流動相：5mmol/L磷酸二氫鈉溶液（磷酸調(diào)pH2.5）；流速：1.0ml/min；柱溫：20；檢測波長：254nm專屬性、線性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率與穩(wěn)定性考察 日內(nèi)RSD8.33%日間RSD 4.36

19、%第五節(jié)第五節(jié) Vit ER1R2Vit E，生育酚醋酸酯，生育酚醋酸酯(dl-Tocopheryl Acetate)R1 R2 Synthetic Product content(%)Natural Product content(%)-Tocopheryl-CH3-CH3 52.0 68.0-Tocopheryl-CH3 -H 9.3 22.0-Tocopheryl -H-CH3 28.0 5.0-Tocopheryl -H -H 10.7 5.0一、性一、性質(zhì)及及鑒別1）溶解性：微黃色或黃色透明粘稠液體，）溶解性：微黃色或黃色透明粘稠液體，溶于乙醚、石油醚等溶于乙醚、石油醚等溶劑，不溶于

20、水溶劑，不溶于水2）水解性（）水解性（酯鍵）：苯）：苯環(huán)上乙上乙?；踊恿u基，基，酸酸/堿加熱水解成生堿加熱水解成生育酚育酚3）還原性（酚原性（酚羥基）：基）：生育酚被光、氧氧化成生育醌生育酚被光、氧氧化成生育醌 硝酸反應(yīng)：硝酸反應(yīng)：vit E 生育紅（橙紅）生育紅（橙紅）三氯化鐵反應(yīng)：三氯化鐵反應(yīng)：vit E 生育酚生育酚 生育醌生育醌+Fe2+紅色紅色4）UV：max 284nm無水乙醇HNO3OKOHFe3+聯(lián)吡啶v薄層色譜法：硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙醚（4:1）為展開劑，展開1015min，晾干，噴濃硫酸顯色，根據(jù)Rf定性鑒別。二、雜質(zhì)檢查：二、雜質(zhì)檢查：v酸度：檢查制備過程中引

21、入的游離醋酸方法：取乙醇與乙醚各15mL，置錐形瓶中，加酚酞指示液0.5mL，滴加NaOH滴定液（0.1mol/L）至微顯粉紅色，加本品1.0g溶解后，用NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定，不得過0.5mL.二、雜質(zhì)檢查：二、雜質(zhì)檢查：游離生育酚的檢查：游離生育酚的檢查：取取Vit E 0.1 g，加無水乙醇，加無水乙醇5 ml溶解后，加二苯胺溶解后，加二苯胺T.S.1滴，用硫酸鈰滴定液滴，用硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)滴定，消耗硫酸滴定，消耗硫酸鈰滴定液鈰滴定液(0.01mol/L)不得過不得過1.0 ml。利用游離酚的還原性檢查利用游離酚的還原性檢查 指示劑：二苯胺（亮黃指示劑：

22、二苯胺（亮黃灰紫）灰紫）固定液Stationary phase：5%SE30柱溫Column temperature：5510檢測器Detector：FID內(nèi)標(biāo)Internal standard：十六酸十六醇酯鈰量法(%)GC(%)97.91 83.53 97.99 82.51 98.48 85.0914.54VE24.40IS VE丸劑GC法 VE(純品)測得量the amount determined(mg)17.22 17.15加入量the amount added(mg)17.3回收率recovery(%)99.54 99.13Vit E(Chp 2005)System Suitabi

23、lity Tests SST以硅酮以硅酮(OV-17)(OV-17)為固定為固定相，涂布濃度為相，涂布濃度為2%2%；柱；柱溫為溫為265265，理論板數(shù)，理論板數(shù)按按V VE E峰計算，應(yīng)不低于峰計算，應(yīng)不低于500500，V VE E峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰與內(nèi)標(biāo)峰的分離度應(yīng)大于分離度應(yīng)大于2 2。內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)：正三十二烷：正三十二烷校正因子測定校正因子測定v 取取正三十二正三十二烷適量，加正已適量，加正已烷溶解并稀溶解并稀釋成每成每1ml中中含含1.0g的溶液，的溶液，搖勻，作勻，作為內(nèi)內(nèi)標(biāo)溶液。另取溶液。另取Vit E對照品照品約20mg，精密稱定，置棕色具塞，精密稱定，置棕色具塞錐形瓶中，精形瓶中，精密加入內(nèi)密加入內(nèi)標(biāo)溶液溶液10ml，密塞，振，密塞，振搖使溶解；取使溶解；取13l注入氣相色注入氣相色譜儀，計算校正因子算校正因子測定法測定法Assayv取本品取本品約20mg，精密稱定，精密稱定，置棕色具塞置棕色具塞錐形瓶形瓶中，精密加入內(nèi)中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液溶液10ml，密塞，振，密塞，振搖使溶使溶解；取解；取13l注入氣相色注入氣相色譜儀，測定，定，計算，即算，即得。得。