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1、 2019 最新新人教版生物選修 1 課題 2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò) 增 DNA片段》教案二 【課題目標(biāo)】 本課題通過(guò)嘗試 PCR（DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作 , 使學(xué)生體驗(yàn) PCR這一常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 , 理解 PCR的原理 , 討論 PCR的應(yīng)用。 【課題重點(diǎn)與難點(diǎn)】 課題重點(diǎn)： PCR的原理和 PCR的基本操作。 課題難點(diǎn)： PCR的原理。 [導(dǎo)學(xué)誘思 ] 1．PCR原理 填寫下列表格 參與的組分 在 DNA 復(fù)制中的作用 解旋酶 DNA 母

2、鏈 合成子鏈的原料 DNA 聚合酶 引物 DNA 的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械? ,通常將 DNA 的羥基末端稱為 ,而磷酸基團(tuán)的末端稱 為 。DNA 聚合酶不能 開(kāi)始合成 DNA,而只能 ,因此 ,DNA 復(fù)制需要引物。 DNA 的 合成方向總是 。 在 DNA 的復(fù)制過(guò)程中 ,復(fù)制的前提是 。在體外可通過(guò)控制 來(lái)實(shí)現(xiàn)。 在 的溫度范圍內(nèi) ,DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體 ,雙鏈分開(kāi) ,這個(gè)過(guò)程稱為 。 PCR利用 了 DNA 的 原理 ,通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于 PCR過(guò)

3、程的溫度高 ,導(dǎo)致 DNA 聚合酶失活 ,后來(lái) 的 DNA 聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用 ,大大增加了 PCR的效率。 PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供： , , , 同,時(shí)通過(guò)控制溫度使 DNA 復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。 2．PCR的反應(yīng)過(guò)程 PCR一般要經(jīng)歷 循環(huán) ,每次循環(huán)可以分為 、 和 三步。從第二輪循環(huán)開(kāi)始 ,上 一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng) ,并且由 延伸而成的 DNA 單鏈會(huì)與 結(jié)合 ,進(jìn) 行 DNA 的延伸 ,這樣 ,DNA 聚合酶只能 使,這段

4、固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。 3．實(shí)驗(yàn)操作 在實(shí)驗(yàn)室中 ,做 PCR通常使用 , 它是一種薄壁塑料管。具體操作時(shí) ,用微量移液器 , 按 PCR反應(yīng)體系的配方在 中依次加入各組分 ,,再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好 PCR儀的循環(huán) 程序即可。 4．操作提示 為避免外源 DNA 等因素的污染 ,PCR實(shí)驗(yàn)中使用的 、 、 以及蒸餾水等在使 1 / 4 用前必須進(jìn)行 。 PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小

5、份 ,并在 儲(chǔ)存。使用前 ,將所需試劑從冰箱拿出 ,放在冰塊上緩慢融化。在微量離心管中添加反應(yīng) 成分時(shí) ,移液管上的槍頭要 。 [疑難點(diǎn)撥 ] 1.PCR技術(shù)簡(jiǎn)介 PCR是一種體外迅速擴(kuò)增 DNA 片段的技術(shù) ,它能以極少量的 DNA 為模板 ,在幾小時(shí)內(nèi)復(fù) 制出上百萬(wàn)份的 DNA 拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分? DNA 含量太低而難以對(duì)樣 品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題 ,被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆 和 DNA 序列測(cè)定等各方面。

6、 2．細(xì)胞內(nèi)參與 DNA 復(fù)制的各種組 成成分及其作用 ①解旋酶：打開(kāi) DNA 雙鏈 ②DNA 母鏈：提供 DNA 復(fù)制的模板 ③ 4 種脫氧核苷酸：合成 子鏈的原料 ④ DNA 聚合酶：催化合成 DNA 子鏈 ⑤引物：使 DNA 聚合酶能夠從引物的 3, 端開(kāi)始連接脫氧核苷酸（引物是一小段 DNA 或 RNA,它能與 DNA 母鏈的一段堿基序列互補(bǔ) 配對(duì)。用于 PCR的引物長(zhǎng)度通常為 20—30 個(gè)核苷酸） 3．DNA 的合成方向

7、 3,端 ,而磷酸基團(tuán)的末端稱為 DNA 的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械? ,通常將 DNA 的羥基末端稱為 5 ,端。 DNA 聚合酶不能從頭開(kāi)始合成 DNA,而只能從 3,端延伸 DNA 鏈 ,因此 ,DNA 復(fù)制需要引 物。當(dāng)引物與 DNA 母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后 ,DNA 聚合酶就能從引物的 3,端開(kāi)始延伸 DNA 鏈,DNA 的合成方向總是從子鏈的 5,端向 3,端延伸。 4．PCR的反應(yīng)過(guò)程 90oC 以上時(shí) ,雙 PCR 一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán) ,每次循環(huán)可以

8、分為變性（當(dāng)溫度上升到 鏈 DNA 解聚為單鏈）、復(fù)性（溫度下降到 50o C 左右 , 兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單 鏈 DNA 結(jié)合）和延伸（溫度上升到 72oC 左右 ,溶液中的四種脫氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作 用下 ,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的 DNA 鏈）三步。從第二輪循環(huán)開(kāi)始 ,上一次循環(huán)的產(chǎn) 物也作為模板參與反應(yīng) ,并且由引物Ⅰ延伸而成的 DNA 單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合 ,進(jìn)行 DNA 的延 伸,這樣 ,DNA 聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的 DNA 序列 ,使這段固定長(zhǎng)度的序列 成指數(shù)擴(kuò)增。

9、 5．PCR技術(shù)與 DNA 的復(fù)制 PCR反應(yīng)是通過(guò)控制溫度使 DNA 復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。 PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是 DNA 復(fù)制 , 所以有關(guān) PCR 反應(yīng)的題目與 DNA 復(fù)制的原理相同 ,計(jì)算方法也大體相同。例如： PCR 反應(yīng) 中的目的片段一般以 2n 的方式積累 ,其中 n 為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè) DNA 片段在 30 次循環(huán)后 反應(yīng)物中大約有 10 億個(gè)這樣的片段。（ 23 0） [典例解析 ]]

10、 一個(gè)由 15N 標(biāo)記的 DNA 分子 ,放在沒(méi)有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng) ,利用 PCR循環(huán) 5 次后標(biāo)記的 DNA 分子總數(shù)的（ ） A 1/ 10 B 1/5 C /16 D1/25 答案： C 5 次后產(chǎn)生的 DNA 分子數(shù)目為 2 n。而 DNA 的復(fù)制 解析：一個(gè) DNA 分子利用 PCR技術(shù)循環(huán) 是半保留復(fù)制 ,其特點(diǎn)是：新形成的 DNA 雙鏈 ,一條是來(lái)自親代 DNA 分

11、子的母鏈 ,另一條是新 形成的子鏈。這樣最初由 15N 標(biāo)記的 DNA 分子復(fù)制后 ,其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代 DNA 分子中 ,這樣兩個(gè)子代 DNA 分子被標(biāo)記了。以后均是在沒(méi)有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng) ,不論經(jīng) 過(guò)多少次復(fù)制 ,最初標(biāo)記的兩條鏈?zhǔn)? 終存在于兩個(gè) DNA 分子中 ,這樣經(jīng)過(guò) n 次循環(huán)后 ,標(biāo)記的 DNA 分子中 2/2n,即 1/2n-1。 【課本問(wèn)題答案 和提示】 2 / 4 練習(xí) 1. 提示：

12、繪圖可參考教科書中圖 5-9 。 PCR反應(yīng)中的目的片段一般以 2n 的方式積累 , 其中 n 為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè) DNA片段在 30 次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有 10 億個(gè)這樣的片段（2n=230=1 073 741 824) 。 2. 提示： PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)的。引物的設(shè)計(jì)需要 豐富的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) , 感興趣的學(xué)生可以參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 （ 見(jiàn)本專題參 考書目） , 書中有詳盡的論述。 【參考資料】 1. 瓊脂糖凝膠濃度與 DNA分離范圍的關(guān)系 凝膠濃度要依據(jù) DNA分子

13、的大小來(lái)確定。編碼雙歧桿菌 16srRNA 的 DNA片段大小約為 1 500 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度 , 因此根據(jù)表 4-1 選用 1％（ 1 g/100 mL, 下同）的凝膠濃度。 表 4-1 瓊脂糖凝膠濃度與 DNA分離范 圍的關(guān)系 瓊脂糖凝膠濃度 (%) 線型 DNA分子的分離范圍 ( 千堿基對(duì) ,kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8 ～ 10 0.9 0.5 ～ 7 1.2 0.9 ～ 6 1.5 0.2 ～ 3 12.0 0. 1～ 2 2

14、. 核酸電泳緩沖液 核酸電泳緩沖液有三種 , 分別是 Tris —硼酸 (TBE) 、 Tris —乙酸 (TAE) 和 Tris —磷酸 (TPE) 。在上述三種緩沖液中： TBE與 TPE緩沖液容量高 , 對(duì) DNA的分離效果好 , 但 TPE液中 含磷酸鹽的濃度偏高 , 容易使 DNA 沉淀。 TAE 液的緩沖容量低 , 價(jià)格較便宜。本實(shí)驗(yàn)選用的 是 TBE緩沖液。緩沖液中的 EDTA可螯合正價(jià)陽(yáng)離子 , 從而抑制 DNA酶的活性 , 防止 PCR產(chǎn)物被降解。 10 倍濃縮的 TBE緩沖液配方如下。 Tris 108 g ED

15、TA 9.3 g 硼酸 55 g 3 / 4 將上述物質(zhì)溶解后 , 用蒸餾水定容至 1 000 mL, 調(diào)節(jié) pH 為 8.0 ～8.2 備用 , 使用時(shí)需稀 釋 10 倍。 3. 核酸電泳的指示劑與染色劑 核酸電泳常用的指示劑是溴酚藍(lán) , 溴酚藍(lán)在堿性條件下呈藍(lán)紫色。指示劑一般與蔗 糖、甘油或聚蔗糖 400 組成載樣緩沖液。載樣緩沖液的作用是：能夠增加樣品密度 , 確保 DNA 均勻沉入加樣孔內(nèi)；能夠在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的藍(lán)紫色指示帶 , 從而幫助預(yù)測(cè)核酸電 泳的速度

16、和位置；能夠使樣品呈現(xiàn)藍(lán)紫色 , 使加樣操作更方便。 核酸電泳后 , 需要染色才能在紫外線下觀察到帶型。最常用的染色方法是溴化乙錠染 色法。溴化乙錠 (EB) 是一種熒光染料 , 有劇毒 , 因此操作時(shí)要非常小心。 EB 可嵌入 DNA雙鏈 的堿基對(duì)之間 , 在紫外線激發(fā)下 , 能發(fā)出紅色熒光。染色的方法有兩種。一種是在凝膠電泳 液中加入 EB,使其終濃度為 0.5 μ g/mL；一種是在電泳后 , 將凝膠浸入 0.5 μ g/mL 的 EB 溶 液中 , 染色 10～ 15 min 。當(dāng)凝膠染色過(guò)深時(shí) , 可以將凝

17、膠放入蒸餾水中浸泡 30 min 后再觀 察。 4.PCR 的常見(jiàn)問(wèn)題 PCR實(shí)驗(yàn)很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。出現(xiàn)假陰性結(jié)果的常見(jiàn)原因有： Taq DNA 聚合酶活力不夠或其活性受 到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過(guò)關(guān)以及 PCR系統(tǒng)的建立欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù) 不夠；等等。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性的情況時(shí) , 應(yīng)首先在原 來(lái)擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入 Taq DNA 聚合酶 , 并增加 5～ 10 次循環(huán)。為了防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn) , 在選用 Taq

18、 DNA聚合酶時(shí) , 要注意用活力高、質(zhì)量好的酶。同時(shí) , 在提取 DNA模板時(shí) , 應(yīng)特別 注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物 , 如酚、氯仿等的存在。盡管 Taq DNA 聚合酶對(duì) 模板純度的要求不高 , 但也不允許有機(jī)試劑的污染。 PCR擴(kuò)增的先決條件以及特異性的高低 , 很大程度上取決于引物與靶 DNA的互補(bǔ)情況 , 尤其需要保證引物的 3′ 端與靶基因互補(bǔ)。 PCR 技術(shù)高度靈敏 , 極其微量的靶基因污染都會(huì)造成非目標(biāo) DNA片段的大量擴(kuò)增 , 因此模板 DNA的污染是 PCR假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因。此外 , 樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成 假陽(yáng)性結(jié)果。為了避免因污染而造成的假陽(yáng)性結(jié)果 ,PCR 操作時(shí)要注意做到：隔離操作區(qū) , 分裝試劑 , 簡(jiǎn)化操作程序 , 使用一次性吸頭等 【教學(xué)反思】 4 / 4