《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗技術(shù)第六章病毒純化(XXXX)》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗技術(shù)第六章病毒純化(XXXX)（32頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,*,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,第六章,病,病毒的純,化,化,利用各種物,理,理、化學(xué)方,法,法，以不使病毒受,損,損傷和失活,為,為前提，去除宿主,細(xì),細(xì)胞組分等,非,非病毒雜質(zhì),，,，提取出高,純,純度濃縮的,病,病毒樣品。,病毒微細(xì)結(jié),構(gòu),構(gòu)的研究,病毒抗原蛋,白,白的分離純,化,化,病毒化學(xué)成,分,分及其遺傳,物,物質(zhì)的研究,病毒感染的,分,分子細(xì)節(jié)的,研,研究,一、病毒純,化,化的標(biāo)準(zhǔn),保持感染性,具有均一性,：,：,結(jié)晶形成,檢測病毒制,備,備物均一性,的,的方法：,電鏡觀察：,大小、形態(tài),均,均一,超速離心：,沉降速率和,密

2、,密度一致，,只,只出現(xiàn)一條,沉,沉降帶,電泳：,顆粒大小及,表,表面電荷均,一,一，只形成,一,一條電泳帶,免疫學(xué)方法,：,：,只與特異性,抗,抗體發(fā)生反,應(yīng),應(yīng),大小、形態(tài),、,、密度、化,學(xué),學(xué)組成、分,子,子量、抗原,性,性,二、病毒純,化,化的理論依,據(jù),據(jù),病毒體外表,面,面的主要化,學(xué),學(xué)組成是蛋,白,白質(zhì)，可利,用,用蛋白質(zhì)提,純,純的方法純,化,化病毒,病毒體具有,一,一定大小、,形,形狀和密度,，,，可利用超,速,速離心技術(shù),提,提純病毒,三、病毒純,化,化前的預(yù)處,理,理,1、病毒感,染,染的組織、,臟,臟器或細(xì)胞,研磨勻漿,超聲波處理,反復(fù)凍融,低速離心去,掉,掉細(xì)胞碎

3、片,2、細(xì)胞培,養(yǎng),養(yǎng)液、雞胚,尿,尿囊液,低速離心去,掉,掉可能含有,的,的雜質(zhì)或直,接,接用于病毒,的,的分離純化,沉淀法,超速離心法,超濾法,層析法,兩相溶劑間,分,分配系數(shù)法,吸附法,電泳法,四、病毒純,化,化的方法,（一）沉淀,法,法,主要從稀的,病,病毒懸浮液,中,中濃縮病毒,。,。,中性鹽沉淀,法,法（鹽析）,聚乙二醇沉,淀,淀法,有機(jī)溶劑沉,淀,淀法,等電點(diǎn)沉淀,法,法,皂土法,魚精蛋白沉,淀,淀法,1、中性鹽,沉,沉淀法（鹽,析,析）,先用其它方,法,法去除材料,中,中的大量雜,質(zhì),質(zhì)，再以高,濃,濃度的中性,鹽,鹽溶液鹽析,，,，析出的沉,淀,淀用緩沖液,懸,懸浮后再進(jìn),行

4、,行鹽析，反,復(fù),復(fù)幾次后，,懸,懸浮沉淀，,用,用透析法或,其,其它方法脫,鹽,鹽。,病毒一般在45%以上,飽,飽和度的硫,酸,酸銨溶液中,沉,沉淀，且保,持,持感染性。,2、聚乙二,醇,醇（PEG,）,）沉淀法,用于病毒沉,淀,淀的分子量,：,：2000-6000,將PEG配,成,成50%左,右,右的溶液，,或,或直接將固,體,體PEG加,于,于病毒懸液,中,中，使其達(dá),到,到所需濃度,，,，在4攪,拌,拌過夜，然,后,后離心使病,毒,毒沉淀。,3、有機(jī)溶,劑,劑沉淀法,乙醚、甲醇,、,、氯仿、正,丁,丁醇、氟碳,化,化合物,原理：A、降低溶,液,液的介電常,數(shù),數(shù)，從而增,加,加病毒顆粒

5、,表,表面不同電,荷,荷之間的引,力,力，導(dǎo)致其,溶,溶解度降低,。,。,B、與水作,用,用，破壞蛋,白,白質(zhì)分子的,水,水化膜。,優(yōu)點(diǎn)：分辨力高，,易,易除去,缺點(diǎn)：易使表面蛋,白,白質(zhì)變性，,溶,溶解脂質(zhì),4、等電點(diǎn),沉,沉淀法（分,辨,辨力不高）,原理：病毒粒子,在,在等電點(diǎn),時,時，所攜,帶,帶的正電,荷,荷與負(fù)電,荷,荷相互中,和,和，因而,失,失去相互,排,排斥的作,用,用而發(fā)生,沉,沉淀（分,辨,辨力不高,）,）。,多數(shù)病毒,的,的等電點(diǎn),在,在pH4.,5.5之,間,間。,5、皂土,法,法,輪狀病毒,皂土在酸,性,性條件下,（,（pH4,4.5),可,可吸附輪,狀,狀病毒，,在

6、,在堿性條,件,件下(pH8.5)，又使,其,其洗脫下,來,來。,6、魚精,蛋,蛋白沉淀,法,法（沉淀,直,直徑大于50nm,的,的病毒）,魚精蛋白,為,為堿性蛋,白,白，具有,攜,攜帶其它,蛋,蛋白質(zhì)（,直,直徑大于50nm,）,）共沉,淀,淀的作用,，,，當(dāng)向這,種,種沉淀物,加,加入1mol/LNaCl時，其,它,它蛋白質(zhì),又,又重新釋,放,放到懸液,中,中，而魚,精,精蛋白仍,然,然沉淀。,（二）層,析,析法,葡聚糖柱,層,層析法,凝膠層析,法,法,離子交換,柱,柱層析法,親和層析,法,法,（三）兩,相,相溶劑間,分,分配系數(shù),法,法,原理：溶質(zhì)在兩,個,個互不相,溶,溶的溶劑,中,中

7、分配系,數(shù),數(shù)的不同,而,而選擇性,地,地分配于,其,其中的一,方,方。,常用的溶,劑,劑：葡聚糖硫,酸,酸鹽（dextran sulphate,Ds),聚乙二醇,（,（PEG,）,）,甲基纖維,素,素（MC,）,）,聚乙烯醇,（,（PVA,）,）,分配體系,：,：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系,（四）吸,附,附法,原理：利用對病,毒,毒或?qū)﹄s,質(zhì),質(zhì)有選擇,吸,吸附能力,的,的固體吸,附,附劑吸附,病,病毒或吸,附,附雜質(zhì)，,再,再用一定,的,的鹽溶液,把,把它們洗,脫,脫下來。,作為吸附,劑,劑必須具,備,備的特點(diǎn),：,：,有較大的,表,表面積和,吸,吸附能力,較高的吸,附,

8、附選擇性,便于洗脫,性質(zhì)穩(wěn)定,常用吸附,劑,劑：,白土,磷酸鈣,硅藻土,紅細(xì)胞,離子交換,樹,樹脂,羧甲基纖,維,維素,（六）超,濾,濾法,利用超濾,膜,膜將水、,鹽,鹽及小分,子,子濾過，,將,將一定大,小,小的大分,子,子或病毒,等,等顆粒截,住,住從而使,后,后者得到,濃,濃縮。,優(yōu)點(diǎn)：,可用于大,容,容量樣品,的,的濃縮,可以在室,溫,溫或低溫,下,下操作,對被濃縮,產(chǎn),產(chǎn)物的損,害,害小,濃縮的同,時,時可達(dá)到,部,部分純化,回收率高,可防止外,來,來污染,（五）電,泳,泳法,（七）離,心,心法,差速離心,速度區(qū)帶,離,離心法,密度梯度,離,離心,1.差速,離,離心法,原理：不同大小

9、,和,和比重的,粒,粒子沉降,速,速度不同,。,。,用途：從組織培,養(yǎng),養(yǎng)液、雞,胚,胚尿囊液,或,或經(jīng)過紅,細(xì),細(xì)胞吸附,釋,釋放的病,毒,毒懸液中,提,提純病毒,。,。,優(yōu)點(diǎn)：可快速處,理,理大量樣,品,品,步驟：低速（2000-3000r/min,20-30min),、,、中速（10000min,20-30min)去,除,除較大的,宿,宿主細(xì)胞,碎,碎片、污,染,染的細(xì)菌,及,及其它較,大,大的雜質(zhì),。,。再選擇,較,較高速度,離,離心1-2h使病,毒,毒沉淀。,速度梯度離心法,密度梯度離心法,原理,沉降與顆粒質(zhì)量成正比，以物質(zhì)沉降速度的不同進(jìn)行分離,沉降與顆粒密度成正比，以物質(zhì)浮密度的

10、不同進(jìn)行分離,介質(zhì),密度小，1-1.3286，預(yù)制梯度，不連續(xù),密度大，1-1.9025，連續(xù)梯度,離心力場,強(qiáng)，離心速度高，使被分離物質(zhì)易沉降,稍強(qiáng)，速度相對低，使CsCl形成梯度，建立沉降擴(kuò)散平衡,離心過程,樣品向離心管底沉降,樣品停留于介質(zhì)的等密度部位,離心時間,較短，幾小時到幾十小時,較長，十幾小時到數(shù)天,2.速,度,度梯度離,心,心法與密,度,度梯度離,心,心法,速度梯度,離,離心,密度梯度,離,離心,A,B,五、病毒,純,純化應(yīng)注,意,意的問題,1、保持,病,病毒的感,染,染性,嚴(yán)格控制,溫,溫度、pH及試劑,的,的選擇。,2、選用,適,適宜的純,化,化實(shí)驗起,始,始材料,無其它病

11、,毒,毒或毒株,的,的污染,病毒體的,含,含量高,雜質(zhì)含量,少,少并易于,處,處理,3、根據(jù),具,具體情況,選,選擇提純,方,方法,根據(jù)需要,純,純化的病,毒,毒的性質(zhì),、,、起始材,料,料的特點(diǎn),、,、研究的,目,目的以及,實(shí),實(shí)驗室的,條,條件等，,選,選擇適宜,的,的純化方,法,法。,4、建立,靈,靈敏的病,毒,毒鑒定和,測,測定方法,六、偽狂,犬,犬病毒的,濃,濃縮提純,1、病毒,材,材料,將偽狂犬,病,病病毒接,種,種于PK-15細(xì),胞,胞，病變,后,后收集細(xì),胞,胞培養(yǎng)物,，,，反復(fù)凍,融,融3次，,即,即為樣品,材,材料。,2病毒,提,提純濃縮,去細(xì)胞碎,片,片及雜質(zhì),：,：將細(xì)

12、胞培,養(yǎng),養(yǎng)物43000r/min離心30min，收集,上,上清液。,硫酸銨沉,淀,淀：按100ml病毒,液,液42.5g硫酸,銨,銨的量加,入,入硫酸銨,，,，攪勻后,置,置4冰,箱,箱攪拌沉,淀,淀過夜，4 5000r/min,離,離心40min，,去,去上清，,沉,沉淀用適,量,量的滅菌ddH,2,O懸浮。,透析：將懸浮的,病,病毒液裝,于,于透析袋,中,中，于ddH,2,O或PBS中攪拌,透,透析，每,半,半個小時,換,換一次液,，,，共換5,次,次，第5,次,次透析過,夜,夜。,濃縮：透析完成,后,后，取出,，,，用聚乙,二,二醇或蔗,糖,糖將病毒,濃,濃縮至合,適,適的體積,。,。

13、,超,離,離,純,純,化,化,：,：,在,離,離,心,心,管,管,中,中,加,加,入,入,不,不,同,同,濃,濃,度,度,的,的,甘,甘,油,油,墊,墊,層,層,，,，,即,即,先,先,加,加,入,入45%,甘,甘,油,油,，,，,再,再,加,加,入,入5%,甘,甘,油,油,。,。,加,入,入,病,病,毒,毒,懸,懸,液,液,（,（,應(yīng),應(yīng),不,不,超,超,過,過,離,離,心,心,管,管,總,總,容,容,積,積,的,的10%,）,）,。,。,20000-25000r/min,離,離,心,心2h,。,。,棄,上,上,層,層,液,液,體,體,，,，,沉,沉,淀,淀,用,用,適,適,量,量TEN,重

14、,重,懸,懸,（,（,渦,渦,旋,旋,或,或,超,超,聲,聲,波,波,處,處,理,理,，,，,使,使,沉,沉,淀,淀,分,分,散,散,）,）,。,。,速,度,度,區(qū),區(qū),帶,帶,離,離,心,心,密,度,度,梯,梯,度,度,離,離,心,心,在,離,離,心,心,管,管,中,中,加,加,入,入,不,不,同,同,濃,濃,度,度,的,的CsCl,或,或,蔗,蔗,糖,糖,墊,墊,層,層,，,，,再,再,加,加,入,入,病,病,毒,毒,懸,懸,液,液,，,，,超,超,高,高,速,速,離,離,心,心,。,。,蔗,糖,糖,密,密,度,度,梯,梯,度,度,離,離,心,心：,在,在,離,離,心,心,管,管,中,中,

15、加,加,入,入20%,60%,不,不,連,連,續(xù),續(xù),蔗,蔗,糖,糖,密,密,度,度,梯,梯,度,度,20000-25000r/min,離,離,心,心2h,3h,，,，,收,收,集,集,蔗,蔗,糖,糖,濃,濃,度,度,為,為35%,處,處,的,的,病,病,毒,毒,帶,帶,，,，,加,加,入,入,適,適,量,量,緩,緩,沖,沖,液,液,稀,稀,釋,釋,后,后,，,，,再,再,次,次20000-25000r/min,離,離,心,心2h,，,，,沉,沉,淀,淀,用,用,適,適,量,量TEN,重,重,懸,懸,。,。,P,rV,鄂,A,株,電,電,鏡,鏡,觀,觀,察,察,左,圖,圖,：,：,上,上,帶,

16、帶,中,中,的,的P,rV,粒,子,子,右,圖,圖,：,：,下,下,帶,帶,中,中,的,的P,rV,粒,子,子,濃,縮,縮,（,（,方,方,法,法,二,二,）,）,將,經(jīng),經(jīng),低,低,速,速,離,離,心,心,去,去,掉,掉,細(xì),細(xì),胞,胞,碎,碎,片,片,及,及,雜,雜,質(zhì),質(zhì),的,的,病,病,毒,毒,懸,懸,液,液,直,直,接,接20000-25000r/min,離,離,心,心2h,。,。,棄,上,上,層,層,液,液,體,體,，,，,沉,沉,淀,淀,用,用,適,適,量,量TEN,重,重,懸,懸,。,。,將,重,重,懸,懸,的,的,病,病,毒,毒,液,液,再,再,經(jīng),經(jīng),梯,梯,度,度,離,離,心,心,純,純,化,化,。,。,如,何,何,利,利,用,用,純,純,化,化,的,的,病,病,毒,毒,進(jìn),進(jìn),行,行,下,下,一,一,步,步,的,的,研,研,究,究,研究病毒的,結(jié),結(jié)構(gòu),研究病毒感,染,染的分子細(xì),節(jié),節(jié),病毒粒子的,標(biāo),標(biāo)記,研究與受體,的,的結(jié)合,研究病毒的,侵,侵入,研究病毒在,體,體內(nèi)的移行,病毒純化,質(zhì)譜分析,靶蛋白驗證,純化的病毒,是,是不是只含,有,有病毒的蛋,白,