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1、,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,病毒感染與細(xì)胞凋亡,微生物教研組,鄭方亮,細(xì)胞凋亡的含義,多細(xì)胞生物的一種生理性細(xì)胞死亡的過程；,凋亡過程中，細(xì)胞的形態(tài)變化是特有的；,凋亡過程中需要基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，特別是酶的合成。,概念：是由一系列基因控制并受復(fù),雜信號調(diào)節(jié)的細(xì)胞自然死亡,的現(xiàn)象。,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性死亡,從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來說，細(xì)胞程序性死亡與細(xì)胞凋亡是有很大區(qū)別的。,細(xì)胞程序性死亡的概念是個功能性概念，描述在一個多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。,細(xì)胞凋亡則是一個形態(tài)學(xué)的概

2、念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。,一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個概念可以交互使用，具有同等意義。,凋亡形態(tài)特征,Apoptosis,“,葉子凋落,”,左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞,凋亡形態(tài)特征,壞死,細(xì)胞凋亡,受累范圍,多為連續(xù)的大片細(xì)胞,多為單個細(xì)胞,細(xì)胞膜,完整性受到破壞,仍保持完整性,細(xì)胞體積,增大、細(xì)胞腫脹,減小、固縮 固縮性壞死,核染色質(zhì),散在的小集聚，呈絮狀,積聚在核膜下，呈半月狀,細(xì)胞器,腫脹，尤以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯崩解,仍保持完整，未崩解,溶酶體,破壞，酶外溢,保持完整，酶不外溢,后期,細(xì)胞破裂、溶解、殘屑被巨噬細(xì)胞吞噬,細(xì)胞胞漿裂解成許多碎片（凋亡

3、小體），被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬,炎癥反應(yīng),引起周圍組織炎癥反應(yīng),不引起周圍組織炎癥反應(yīng),分子生物學(xué)機(jī)制,細(xì)胞程序性死亡是細(xì)胞之間信號傳導(dǎo)的結(jié)果之一。環(huán)境和發(fā)育的刺激通過配體和受體之間的相互作用傳遞到胞內(nèi)，即配體攜帶的信號通過與穿膜細(xì)胞受體胞外區(qū)域的結(jié)合反應(yīng)到受體的胞內(nèi)區(qū)域，完成信號由胞外到胞質(zhì)的傳遞，然后開始胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜作用，最后導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。,凋亡的過程,信號傳遞階段,死亡信號的探測,胞外信號（配體與受體的特異結(jié)合）,胞內(nèi)信號（毒素、射線引起的損傷或病毒感染）,下游死亡機(jī)制的傳遞,效應(yīng)階段,Caspase,的激活最終造成細(xì)胞死亡。,凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)特點(diǎn),多樣性：不同

4、種類的細(xì)胞系統(tǒng)不同,偶聯(lián)性：與增殖分化的信號系統(tǒng)交叉偶聯(lián),同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā),多途性：同一誘導(dǎo)因素啟動多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo),途徑,凋亡的激活途徑,Fas,介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,線粒體參與的細(xì)胞凋亡,Fas,介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,富含半胱氨酸,死亡結(jié)構(gòu)域,death,effector,domain,線粒體參與的細(xì)胞凋亡,BID,Caspase,可激活名叫,CAD,（,caspase,-activated,Dnase,）的核酸酶，,CAD,能在核小體的連接區(qū)將其切斷，形成約為,200bp,整數(shù)倍的核酸片段。正常情況下,CAD,存在于胞質(zhì)中，并且與抑制因子,ICAD/DFF-45,蛋白結(jié)合，不能進(jìn)入細(xì)胞核

5、。,Caspase,活化后可以降解,ICAD/DFF-45,，釋放出,CAD,，使它進(jìn)入細(xì)胞核降解,DNA,。,Caspase,可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層（,Lamina,）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（,chromatin,）得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被,Caspase,在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。,Caspase,可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除此之外，,Caspase,還能滅活或下調(diào)與,DNA,修復(fù)有關(guān)的酶、,mR

6、NA,剪切蛋白和,DNA,交聯(lián)蛋白。,效應(yīng)階段,吞噬,凋亡相關(guān)的基因和蛋白,細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因，包括一些與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有,ICE,、,Apaf-1,、,Bcl-2,、,Fas/APO-1,、,c-myc,、,p53,、,ATM,等。,Caspase,家族,Caspase,屬于半胱氨酸蛋白酶，這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦被信號途徑激活，能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆的走向死亡。它們均有以下,特點(diǎn)：,活性中心富含半胱氨酸,；,對底物天冬氨酸部位有特異水解作用,，所以命名為,caspase,（,c,ysteine,-containing,a

7、,spartate-,s,picific,p,rote,ase,），方便起見本文稱之為凋亡酶；都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個活性亞基。,分為兩類：一類為執(zhí)行者（,executioner,或,effector,），如,caspase-3,、,6,、,7,，它們可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通過自催化（,autocatalytic,）或自剪接的方式激活；另一類為啟動者（,initiator,），如,caspase-8,、,9,，收到信號后，能通過自剪接而激活，然后引起,caspase,級聯(lián)反應(yīng)，如,caspase-8,可依次

8、激活,caspase-3,、,6,、,7,Apaf-1,Apaf-1,被稱為凋亡酶激活因子,-1,（,apoptotic protease activating factor-1,），在線粒體參與的凋亡途徑中具有重要作用，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞過多，腦畸形發(fā)育。,Apaf-1,含有,3,個不同的結(jié)構(gòu)域：,CARD,（,caspase,recruitment domain,）結(jié)構(gòu)域，能召集,caspase-9,；,ced-4,同源結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合,ATP/,dATP,；,C,端結(jié)構(gòu)域，含有色氨酸,/,天冬氨酸重復(fù)序列，當(dāng)細(xì)胞色素,c,結(jié)合到這一區(qū)域后，能引起,Apaf-1,多聚化而激活。,Ap

9、af-1,具有激活,Caspase-3,的作用，而這一過程又需要細(xì)胞色素,c,和,caspase-9,參與。,Apaf-1/,細(xì)胞色素,c,復(fù)合體與,ATP/,dATP,結(jié)合后，,Apaf-1,就可以通過其,CARD,結(jié)構(gòu)域召集,caspase-9,，形成凋亡體（,apoptosome,），激活,caspase-3,，啟動,caspase,級聯(lián)反應(yīng)。,Bcl-2,家族,Bcl-2,為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白。它們在線粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用，能控制線粒體中細(xì)胞色素,c,等凋亡因子的釋放。,Bcl-2,家族成員都含有,1-4,個,Bcl-2,同源結(jié)構(gòu)域（,BH1-4,），并且通常有一個

10、羧端跨膜結(jié)構(gòu)域,(,transmembrane,region,TM),。其中,BH4,是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域，,BH3,是與促進(jìn)凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可將,Bcl-2,基因家族分為兩類，一類是抗凋亡的（,anti-apoptotic,），如：,Bcl-2,、,Bcl,-xl,、,Bcl-w,、,Mcl-1,；一類是促進(jìn)凋亡的（,pro-apoptotic,），如：,Bax,、,Bak,、,Bad,、,Bid,、,Bim,，在促凋亡蛋白中還有一類僅含,BH3,結(jié)構(gòu)，如,Bid,、,Bad,。,雖然,Bcl-2,蛋白存在于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上，但主要定位于線粒體外膜，它拮抗

11、促凋亡蛋白的功能。,Fas,Fas,又稱作,APO-1/CD95,，屬,TNF,受體家族。,Fas,基因編碼產(chǎn)物為分子量,45KD,的跨膜蛋白，分布于胸腺細(xì)胞，激活的,T,和,B,淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細(xì)胞等。,Fas,蛋白與,Fas,配體結(jié)合后，會激活,caspase,，導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。,p53,一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是在,G,期監(jiān)視,DNA,的完整性。如有損傷，則抑制細(xì)胞增殖，直到,DNA,修復(fù)完成。如果,DNA,不能被修復(fù)，則誘導(dǎo)其調(diào)亡，研究發(fā)現(xiàn)喪失,p53,功能的小鼠胸腺細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的調(diào)亡反應(yīng)和正常細(xì)胞相同，而對輻射誘導(dǎo)的調(diào)亡不敏感。,C

12、-,myc,在許多人類惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有,c-myc,的過度表達(dá)，它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化。在凋亡細(xì)胞中,c-myc,也是高表達(dá)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一方面它能激活那些控制細(xì)胞增殖的基因，另一方面也激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，給細(xì)胞兩種選擇：增殖或凋亡。當(dāng)生長因子存在，,Bcl-2,基因表達(dá)時，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。,ATM,ATM,（,ataxia,telangiectasia,-mutated gene,）是與,DNA,損傷檢驗(yàn)有關(guān)的一個重要基因。正常細(xì)胞經(jīng)放射處理后，,DNA,損傷會激活修復(fù)機(jī)制，如,DNA,不能修復(fù)則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。,ATM,是,DNA,損傷檢驗(yàn)點(diǎn)的一個重要的蛋白激

13、酶,細(xì)胞凋亡的檢測方法,形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察,DNA,電泳：,DNA,片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶,TUNEL,測定法，即,DNA,斷裂的原位末端標(biāo)記法,彗星電泳法（,comet assay,）,流式細(xì)胞分析,DNA,電泳鑒定,+,壞死,凋亡,細(xì)胞色素,c,誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞,DNA,電泳圖,1,細(xì)胞色素,c,誘導(dǎo),0 h,2,細(xì)胞色素,c,誘導(dǎo),1 h,3,細(xì)胞色素,c,誘導(dǎo),2 h,4,細(xì)胞色素,c,誘導(dǎo),3 h,5,細(xì)胞色素,c,誘導(dǎo),4 h,6,陰性對照,7,Marker,（,自趙允、翟中和）,細(xì)胞凋亡的意義,確保正常發(fā)育生長：清除多余的細(xì)胞,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、衰老的細(xì)胞,積極防御功能：對病毒感染細(xì)胞阻止 復(fù)制,凋亡的重要性,正常情況下，凋亡在脊椎動物和無脊椎動物中扮演著重要的角色。凋亡使細(xì)胞死亡時仍保持細(xì)胞完整性，以此避免胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏和由此引起的炎癥反應(yīng)。因此凋亡在正常組織細(xì)胞的更換、發(fā)育及免疫系統(tǒng)中起到了重要作用。,病毒感染與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,病毒感染促進(jìn)細(xì)胞凋亡,病毒感染抑制細(xì)胞凋亡,流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,NS1,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子,