《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第六章病毒純化XXXX》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第六章病毒純化XXXX（33頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,*,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),第六章 病毒的純化,利用各種物理、化學(xué)方法，以,不使病毒受損傷和失活為前提,，去除宿主細(xì)胞組分等非病毒雜質(zhì)，提取出高純度濃縮的病毒樣品。,病毒微細(xì)結(jié)構(gòu)的研究,病毒抗原蛋白的分離純化,病毒化學(xué)成分及其遺傳物質(zhì)的研究,病毒感染的分子細(xì)節(jié)的研究,一、病毒純化的標(biāo)準(zhǔn),保持感染性,具有均一性：,結(jié)晶形成,檢測(cè)病毒制備物均一性的方法：,電鏡觀察：,大小、形態(tài)均一,超速離心：,沉降速率和密度一致，只出現(xiàn)一條沉降帶,電泳：,顆粒大小及表面電荷均一，只形成一條電泳帶,免疫學(xué)方法：,只與特異性抗體發(fā)生反應(yīng),大小、形態(tài)、密度、化

2、學(xué)組成、分子量、抗原性,二、病毒純化的理論依據(jù),病毒體外表面的主要化學(xué)組成是蛋白質(zhì)，可利用蛋白質(zhì)提純的方法純化病毒,病毒體具有一定大小、形狀和密度，可利用超速離心技術(shù)提純病毒,三、病毒純化前的預(yù)處理,1、病毒感染的組織、臟器或細(xì)胞,研磨勻漿,超聲波處理,反復(fù)凍融,低速離心去掉細(xì)胞碎片,2、細(xì)胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液,低速離心去掉可能含有的雜質(zhì)或直接用于病毒的分離純化,沉淀法,超速離心法,超濾法,層析法,兩相溶劑間分配系數(shù)法,吸附法,電泳法,四、病毒純化的方法,（一）沉淀法,主要從稀的病毒懸浮液中濃縮病毒。,中性鹽沉淀法（鹽析）,聚乙二醇沉淀法,有機(jī)溶劑沉淀法,等電點(diǎn)沉淀法,皂土法,魚精蛋白沉淀法,

3、1、中性鹽沉淀法（鹽析）,先用其它方法去除材料中的大量雜質(zhì)，再以高濃度的中性鹽溶液鹽析，析出的沉淀用緩沖液懸浮后再進(jìn)行鹽析，反復(fù)幾次后，懸浮沉淀，用透析法或其它方法脫鹽。,病毒一般在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀，且保持感染性。,2、聚乙二醇（PEG）沉淀法,用于病毒沉淀的分子量：2000-6000,將PEG配成50%左右的溶液，或直接將固體PEG加于病毒懸液中，使其達(dá)到所需濃度，在4攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。,3、有機(jī)溶劑沉淀法,乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物,原理：,A、降低溶液的介電常數(shù)，從而增加病毒顆粒表面不同電荷之間的引力，導(dǎo)致其溶解度降低。,B、與水作用，破壞蛋白質(zhì)分

4、子的水化膜。,優(yōu)點(diǎn)：,分辨力高，易除去,缺點(diǎn)：,易使表面蛋白質(zhì)變性，溶解脂質(zhì),4、等電點(diǎn)沉淀法（分辨力不高）,原理：,病毒粒子在等電點(diǎn)時(shí)，所攜帶的正電荷與負(fù)電荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而發(fā)生沉淀（分辨力不高）。,多數(shù)病毒的等電點(diǎn)在pH4.,5.5之間。,5,、,、,皂,皂,土,土,法,法,輪,狀,狀,病,病,毒,毒,皂,土,土,在,在,酸,酸,性,性,條,條,件,件,下,下,（,（pH4,4.5),可,可,吸,吸,附,附,輪,輪,狀,狀,病,病,毒,毒,，,，,在,在,堿,堿,性,性,條,條,件,件,下,下(pH8.5),，,，,又,又,使,使,其,其,洗,洗,脫,脫,下,下,來,來,

5、。,。,6,、,、,魚,魚,精,精,蛋,蛋,白,白,沉,沉,淀,淀,法,法,（,（,沉,沉,淀,淀,直,直,徑,徑,大,大,于,于50nm,的,的,病,病,毒,毒,）,）,魚,精,精,蛋,蛋,白,白,為,為,堿,堿,性,性,蛋,蛋,白,白,，,，,具,具,有,有,攜,攜,帶,帶,其,其,它,它,蛋,蛋,白,白,質(zhì),質(zhì),（,（,直,直,徑,徑,大,大,于,于50nm,）,）,共,共,沉,沉,淀,淀,的,的,作,作,用,用,，,，,當(dāng),當(dāng),向,向,這,這,種,種,沉,沉,淀,淀,物,物,加,加,入,入1mol/LNaCl,時(shí),時(shí),，,，,其,其,它,它,蛋,蛋,白,白,質(zhì),質(zhì),又,又,重,重,新,

6、新,釋,釋,放,放,到,到,懸,懸,液,液,中,中,，,，,而,而,魚,魚,精,精,蛋,蛋,白,白,仍,仍,然,然,沉,沉,淀,淀,。,。,（,二,二,）,）,層,層,析,析,法,法,葡,聚,聚,糖,糖,柱,柱,層,層,析,析,法,法,凝,膠,膠,層,層,析,析,法,法,離,子,子,交,交,換,換,柱,柱,層,層,析,析,法,法,親,和,和,層,層,析,析,法,法,（,三,三,）,）,兩,兩,相,相,溶,溶,劑,劑,間,間,分,分,配,配,系,系,數(shù),數(shù),法,法,原,理,理,：,：溶,質(zhì),質(zhì),在,在,兩,兩,個(gè),個(gè),互,互,不,不,相,相,溶,溶,的,的,溶,溶,劑,劑,中,中,分,分,配,配

7、,系,系,數(shù),數(shù),的,的,不,不,同,同,而,而,選,選,擇,擇,性,性,地,地,分,分,配,配,于,于,其,其,中,中,的,的,一,一,方,方,。,。,常,用,用,的,的,溶,溶,劑,劑,：,：葡,聚,聚,糖,糖,硫,硫,酸,酸,鹽,鹽,（,（dextransulphate,Ds),聚,乙,乙,二,二,醇,醇,（,（PEG,）,）,甲,基,基,纖,纖,維,維,素,素,（,（MC,）,）,聚,乙,乙,烯,烯,醇,醇,（,（PVA,）,）,分,配,配,體,體,系,系,：,：Ds-PEG,系,系,、,、Ds-PVA,系,系,、,、Ds-MC,系,系,（,四,四,）,）,吸,吸,附,附,法,法,原,

8、理,理,：,：利,用,用,對(duì),對(duì),病,病,毒,毒,或,或,對(duì),對(duì),雜,雜,質(zhì),質(zhì),有,有,選,選,擇,擇,吸,吸,附,附,能,能,力,力,的,的,固,固,體,體,吸,吸,附,附,劑,劑,吸,吸,附,附,病,病,毒,毒,或,或,吸,吸,附,附,雜,雜,質(zhì),質(zhì),，,，,再,再,用,用,一,一,定,定,的,的,鹽,鹽,溶,溶,液,液,把,把,它,它,們,們,洗,洗,脫,脫,下,下,來,來,。,。,作,為,為,吸,吸,附,附,劑,劑,必,必,須,須,具,具,備,備,的,的,特,特,點(diǎn),點(diǎn),：,：,有較,大,大的,表,表面,積,積和,吸,吸附,能,能力,較高,的,的吸,附,附選,擇,擇性,便于,洗,洗脫

9、,性質(zhì),穩(wěn),穩(wěn)定,常用,吸,吸附,劑,劑：,白土,磷酸,鈣,鈣,硅藻,土,土,紅細(xì),胞,胞,離子,交,交換,樹,樹脂,羧甲,基,基纖,維,維素,（六,）,）超,濾,濾法,利用,超,超濾,膜,膜將,水,水、,鹽,鹽及,小,小分,子,子濾,過,過，,將,將一,定,定大,小,小的,大,大分,子,子或,病,病毒,等,等顆,粒,粒截,住,住從,而,而使,后,后者,得,得到,濃,濃縮,。,。,優(yōu)點(diǎn),：,：,可用,于,于大,容,容量,樣,樣品,的,的濃,縮,縮,可以,在,在室,溫,溫或,低,低溫,下,下操,作,作,對(duì)被,濃,濃縮,產(chǎn),產(chǎn)物,的,的損,害,害小,濃縮,的,的同,時(shí),時(shí)可,達(dá),達(dá)到,部,部分,純

10、,純化,回收,率,率高,可防,止,止外,來,來污,染,染,（五,）,）電,泳,泳法,（七,）,）離,心,心法,差速,離,離心,速度,區(qū),區(qū)帶,離,離心,法,法,密度,梯,梯度,離,離心,1.,差,差速,離,離心,法,法,原理,：,：不同,大,大小,和,和比,重,重的,粒,粒子,沉,沉降,速,速度,不,不同,。,。,用途,：,：從組,織,織培,養(yǎng),養(yǎng)液,、,、雞,胚,胚尿,囊,囊液,或,或經(jīng),過,過紅,細(xì),細(xì)胞,吸,吸附,釋,釋放,的,的病,毒,毒懸,液,液中,提,提純,病,病毒,。,。,優(yōu)點(diǎn),：,：可快,速,速處,理,理大,量,量樣,品,品,步驟,：,：低速,（,（2000-3000r/min

11、,20-30min),、,、中,速,速（10000min,20-30min)去,除,除較,大,大的,宿,宿主,細(xì),細(xì)胞,碎,碎片,、,、污,染,染的,細(xì),細(xì)菌,及,及其,它,它較,大,大的,雜,雜質(zhì),。,。再,選,選擇,較,較高,速,速度,離,離心1-2h,使,使病,毒,毒沉,淀,淀。,速度梯度離心法,密度梯度離心法,原理,沉降與顆粒質(zhì)量成正比，以物質(zhì)沉降速度的不同進(jìn)行分離,沉降與顆粒密度成正比，以物質(zhì)浮密度的不同進(jìn)行分離,介質(zhì),密度小，1-1.3286，預(yù)制梯度，不連續(xù),密度大，1-1.9025，連續(xù)梯度,離心力場,強(qiáng)，離心速度高，使被分離物質(zhì)易沉降,稍強(qiáng)，速度相對(duì)低，使CsCl形成梯度，建

12、立沉降擴(kuò)散平衡,離心過程,樣品向離心管底沉降,樣品停留于介質(zhì)的等密度部位,離心時(shí)間,較短，幾小時(shí)到幾十小時(shí),較長，十幾小時(shí)到數(shù)天,2.,速,速,度,度梯,度,度離,心,心法,與,與密,度,度梯,度,度離,心,心法,速度,梯,梯度,離,離心,密度,梯,梯度,離,離心,A,B,五、,病,病毒,純,純化,應(yīng),應(yīng)注,意,意的,問,問題,1、,保,保持,病,病毒,的,的感,染,染性,嚴(yán)格,控,控制,溫,溫度,、,、pH及,試,試劑,的,的選,擇,擇。,2、,選,選用,適,適宜,的,的純,化,化實(shí),驗(yàn),驗(yàn)起,始,始材,料,料,無其,它,它病,毒,毒或,毒,毒株,的,的污,染,染,病毒,體,體的,含,含量,

13、高,高,雜質(zhì),含,含量,少,少并,易,易于,處,處理,3、,根,根據(jù),具,具體,情,情況,選,選擇,提,提純,方,方法,根據(jù),需,需要,純,純化,的,的病,毒,毒的,性,性質(zhì),、,、起,始,始材,料,料的,特,特點(diǎn),、,、研,究,究的,目,目的,以,以及,實(shí),實(shí)驗(yàn),室,室的,條,條件,等,等，,選,選擇,適,適宜,的,的純,化,化方,法,法。,4、,建,建立,靈,靈敏,的,的病,毒,毒鑒,定,定和,測(cè),測(cè)定,方,方法,六、,偽,偽狂,犬,犬病,毒,毒的,濃,濃縮,提,提純,1、,病,病毒,材,材料,將偽,狂,狂犬,病,病病,毒,毒接,種,種于PK-15細(xì),胞,胞，,病,病變,后,后收,集,集細(xì)

14、,胞,胞培,養(yǎng),養(yǎng)物,，,，反,復(fù),復(fù)凍,融,融3,次,次，,即,即為,樣,樣品,材,材料,。,。,2,病,病毒,提,提純,濃,濃縮,去細(xì),胞,胞碎,片,片及,雜,雜質(zhì),：,：將細(xì),胞,胞培,養(yǎng),養(yǎng)物43000r/min,離,離心30min，,收,收集,上,上清,液,液。,硫酸,銨,銨沉,淀,淀：按100ml,病,病毒,液,液42.5g,硫,硫酸,銨,銨的,量,量加,入,入硫,酸,酸銨,，,，攪,勻,勻后,置,置4,冰,箱,箱攪,拌,拌沉,淀,淀過,夜,夜，45000r/min,離,離心40min，,去,去上,清,清，,沉,沉淀,用,用適,量,量的,滅,滅菌ddH,2,O懸,浮,浮。,透析,：

15、,：將懸,浮,浮的,病,病毒,液,液裝,于,于透,析,析袋,中,中，,于,于ddH,2,O或PBS中,攪,攪拌,透,透析,，,，每,半,半個(gè),小,小時(shí),換,換一,次,次液,，,，共,換,換5,次,次，,第,第5,次,次透,析,析過,夜,夜。,濃縮,：,：透析,完,完成,后,后，,取,取出,，,，用,聚,聚乙,二,二醇,或,或蔗,糖,糖將,病,病毒,濃,濃縮,至,至合,適,適的,體,體積,。,。,超離,純,純化,：,：,在離,心,心管,中,中加,入,入不,同,同濃,度,度的,甘,甘油,墊,墊層,，,，即,先,先加,入,入45%,甘,甘油,，,，再,加,加入5%,甘,甘油,。,。,加入,病,病毒,

16、懸,懸液,（,（應(yīng),不,不超,過,過離,心,心管,總,總?cè)?積,積的10%）,。,。,20000-25000r/min,離,離心2h,。,。,棄上,層,層液,體,體，,沉,沉淀,用,用適,量,量TEN,重,重懸,（,（渦,旋,旋或,超,超聲,波,波處,理,理，,使,使沉,淀,淀分,散,散）,。,。,速度,區(qū),區(qū)帶,離,離心,密度,梯,梯度,離,離心,在離,心,心管,中,中加,入,入不,同,同濃,度,度的CsCl,或,或蔗,糖,糖墊,層,層，,再,再加,入,入病,毒,毒懸,液,液，,超,超高,速,速離,心,心。,蔗糖,密,密度,梯,梯度,離,離心：在,離,離心,管,管中,加,加入20%60%不,連,連續(xù),蔗,蔗糖,密,密度,梯,梯度,20000-25000r/min,離,離心2h,3h,，,，收,集,集蔗,糖,糖濃,度,度為35%處,的,的病,毒,毒帶,，,，加,入,入適,量,量緩,沖,沖液,稀,稀釋,后,后，,再,再次20000-25000r/min,離,離心2h,，,，沉,淀,淀用,適,適量TEN重,懸,懸。,P,rV,鄂,A,株電,鏡,鏡觀,察,察,左圖,：,：上,帶,帶中,的,的