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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,*,*,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),第六章 病毒的純化,利用各種物理、化學(xué)方法，以,不使病毒受損傷和失活為前提,，去除宿主細(xì)胞組分等非病毒雜質(zhì)，提取出高純度濃縮的病毒樣品。,病毒微細(xì)結(jié)構(gòu)的研究,病毒抗原蛋白的分離純化,病毒化學(xué)成分及其遺傳物質(zhì)的研究,病毒感染的分子細(xì)節(jié)的研究,一、病毒純化的標(biāo)準(zhǔn),保持感染

2、性,具有均一性：,結(jié)晶形成,檢測(cè)病毒制備物均一性的方法：,電鏡觀察：,大小、形態(tài)均一,超速離心：,沉降速率和密度一致，只出現(xiàn)一條沉降帶,電泳：,顆粒大小及表面電荷均一，只形成一條電泳帶,免疫學(xué)方法：,只與特異性抗體發(fā)生反應(yīng),大小、形態(tài)、密度、化學(xué)組成、分子量、抗原性,二、病毒純化的理論依據(jù),病毒體外表面的主要化學(xué)組成是蛋白質(zhì)，可利用蛋白質(zhì)提純的方法純化病毒,病毒體具有一定大小、形狀和密度，可利用超速離心技術(shù)提純病毒,三、病毒純化前的預(yù)處理,1、病毒感染的組織、臟器或細(xì)胞,研磨勻漿,超聲波處理,反復(fù)凍融,低速離心去掉細(xì)胞碎片,2、細(xì)胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液,低速離心去掉可能含有的雜質(zhì)或直接用于病毒的

3、分離純化,沉淀法,超速離心法,超濾法,層析法,兩相溶劑間分配系數(shù)法,吸附法,電泳法,四、病毒純化的方法,（一）沉淀法,主要從稀的病毒懸浮液中濃縮病毒。,中性鹽沉淀法（鹽析）,聚乙二醇沉淀法,有機(jī)溶劑沉淀法,等電點(diǎn)沉淀法,皂土法,魚精蛋白沉淀法,1、中性鹽沉淀法（鹽析）,先用其它方法去除材料中的大量雜質(zhì)，再以高濃度的中性鹽溶液鹽析，析出的沉淀用緩沖液懸浮后再進(jìn)行鹽析，反復(fù)幾次后，懸浮沉淀，用透析法或其它方法脫鹽。,病毒一般在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀，且保持感染性。,2、聚乙二醇（PEG）沉淀法,用于病毒沉淀的分子量：2000-6000,將PEG配成50%左右的溶液，或直接將固體PEG加

4、于病毒懸液中，使其達(dá)到所需濃度，在4攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。,3、有機(jī)溶劑沉淀法,乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物,原理：,A、降低溶液的介電常數(shù)，從而增加病毒顆粒表面不同電荷之間的引力，導(dǎo)致其溶解度降低。,B、與水作用，破壞蛋白質(zhì)分子的水化膜。,優(yōu)點(diǎn)：,分辨力高，易除去,缺點(diǎn)：,易使表面蛋白質(zhì)變性，溶解脂質(zhì),4、等電點(diǎn)沉淀法（分辨力不高）,原理：,病毒粒子在等電點(diǎn)時(shí)，所攜帶的正電荷與負(fù)電荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而發(fā)生沉淀（分辨力不高）。,多數(shù)病毒的等電點(diǎn)在pH4.,5.5之間。,5、皂土,法,法,輪狀病毒,皂土在酸,性,性條件下,（,（pH4,4.5),可,可吸附輪,狀,

5、狀病毒，,在,在堿性條,件,件下(pH8.5)，又使,其,其洗脫下,來,來。,6、魚精,蛋,蛋白沉淀,法,法（沉淀,直,直徑大于50nm,的,的病毒）,魚精蛋白,為,為堿性蛋,白,白，具有,攜,攜帶其它,蛋,蛋白質(zhì)（,直,直徑大于50nm,）,）共沉,淀,淀的作用,，,，當(dāng)向這,種,種沉淀物,加,加入1mol/LNaCl時(shí)，其,它,它蛋白質(zhì),又,又重新釋,放,放到懸液,中,中，而魚,精,精蛋白仍,然,然沉淀。,（二）層,析,析法,葡聚糖柱,層,層析法,凝膠層析,法,法,離子交換,柱,柱層析法,親和層析,法,法,（三）兩,相,相溶劑間,分,分配系數(shù),法,法,原理：溶質(zhì)在兩,個(gè),個(gè)互不相,溶,溶的

6、溶劑,中,中分配系,數(shù),數(shù)的不同,而,而選擇性,地,地分配于,其,其中的一,方,方。,常用的溶,劑,劑：葡聚糖硫,酸,酸鹽（dextran sulphate,Ds),聚乙二醇,（,（PEG,）,）,甲基纖維,素,素（MC,）,）,聚乙烯醇,（,（PVA,）,）,分配體系,：,：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系,（四）吸,附,附法,原理：利用對(duì)病,毒,毒或?qū)﹄s,質(zhì),質(zhì)有選擇,吸,吸附能力,的,的固體吸,附,附劑吸附,病,病毒或吸,附,附雜質(zhì)，,再,再用一定,的,的鹽溶液,把,把它們洗,脫,脫下來。,作為吸附,劑,劑必須具,備,備的特點(diǎn),：,：,有較大的,表,表面積和,吸,吸附能力,較

7、高的吸,附,附選擇性,便于洗脫,性質(zhì)穩(wěn)定,常用吸附,劑,劑：,白土,磷酸鈣,硅藻土,紅細(xì)胞,離子交換,樹,樹脂,羧甲基纖,維,維素,（六）超,濾,濾法,利用超濾,膜,膜將水、,鹽,鹽及小分,子,子濾過，,將,將一定大,小,小的大分,子,子或病毒,等,等顆粒截,住,住從而使,后,后者得到,濃,濃縮。,優(yōu)點(diǎn)：,可用于大,容,容量樣品,的,的濃縮,可以在室,溫,溫或低溫,下,下操作,對(duì)被濃縮,產(chǎn),產(chǎn)物的損,害,害小,濃縮的同,時(shí),時(shí)可達(dá)到,部,部分純化,回收率高,可防止外,來,來污染,（五）電,泳,泳法,（七）離,心,心法,差速離心,速度區(qū)帶,離,離心法,密度梯度,離,離心,1.差速,離,離心法,原

8、理：不同大小,和,和比重的,粒,粒子沉降,速,速度不同,。,。,用途：從組織培,養(yǎng),養(yǎng)液、雞,胚,胚尿囊液,或,或經(jīng)過紅,細(xì),細(xì)胞吸附,釋,釋放的病,毒,毒懸液中,提,提純病毒,。,。,優(yōu)點(diǎn)：可快速處,理,理大量樣,品,品,步驟：低速（2000-3000r/min,20-30min),、,、中速（10000min,20-30min)去,除,除較大的,宿,宿主細(xì)胞,碎,碎片、污,染,染的細(xì)菌,及,及其它較,大,大的雜質(zhì),。,。再選擇,較,較高速度,離,離心1-2h使病,毒,毒沉淀。,速度梯度離心法,密度梯度離心法,原理,沉降與顆粒質(zhì)量成正比，以物質(zhì)沉降速度的不同進(jìn)行分離,沉降與顆粒密度成正比，以

9、物質(zhì)浮密度的不同進(jìn)行分離,介質(zhì),密度小，1-1.3286，預(yù)制梯度，不連續(xù),密度大，1-1.9025，連續(xù)梯度,離心力場(chǎng),強(qiáng)，離心速度高，使被分離物質(zhì)易沉降,稍強(qiáng)，速度相對(duì)低，使CsCl形成梯度，建立沉降擴(kuò)散平衡,離心過程,樣品向離心管底沉降,樣品停留于介質(zhì)的等密度部位,離心時(shí)間,較短，幾小時(shí)到幾十小時(shí),較長(zhǎng)，十幾小時(shí)到數(shù)天,2.速,度,度梯度離,心,心法與密,度,度梯度離,心,心法,速度梯度,離,離心,密度梯度,離,離心,A,B,五、病毒,純,純化應(yīng)注,意,意的問題,1、保持,病,病毒的感,染,染性,嚴(yán)格控制,溫,溫度、pH及試劑,的,的選擇。,2、選用,適,適宜的純,化,化實(shí)驗(yàn)起,始,始材

10、料,無其它病,毒,毒或毒株,的,的污染,病毒體的,含,含量高,雜質(zhì)含量,少,少并易于,處,處理,3、根據(jù),具,具體情況,選,選擇提純,方,方法,根據(jù)需要,純,純化的病,毒,毒的性質(zhì),、,、起始材,料,料的特點(diǎn),、,、研究的,目,目的以及,實(shí),實(shí)驗(yàn)室的,條,條件等，,選,選擇適宜,的,的純化方,法,法。,4、建立,靈,靈敏的病,毒,毒鑒定和,測(cè),測(cè)定方法,六、偽狂,犬,犬病毒的,濃,濃縮提純,1、病毒,材,材料,將偽狂犬,病,病病毒接,種,種于PK-15細(xì),胞,胞，病變,后,后收集細(xì),胞,胞培養(yǎng)物,，,，反復(fù)凍,融,融3次，,即,即為樣品,材,材料。,2病毒,提,提純濃縮,去細(xì)胞碎,片,片及雜質(zhì)

11、,：,：將細(xì)胞培,養(yǎng),養(yǎng)物43000r/min離心30min，收集,上,上清液。,硫酸銨沉,淀,淀：按100ml病毒,液,液42.5g硫酸,銨,銨的量加,入,入硫酸銨,，,，攪勻后,置,置4冰,箱,箱攪拌沉,淀,淀過夜，4 5000r/min,離,離心40min，,去,去上清，,沉,沉淀用適,量,量的滅菌ddH,2,O懸浮。,透析：將懸浮的,病,病毒液裝,于,于透析袋,中,中，于ddH,2,O或PBS中攪拌,透,透析，每,半,半個(gè)小時(shí),換,換一次液,，,，共換5,次,次，第5,次,次透析過,夜,夜。,濃縮：透析完成,后,后，取出,，,，用聚乙,二,二醇或蔗,糖,糖將病毒,濃,濃縮至合,適,適的

12、體積,。,。,超離純化,：,：,在離心管,中,中加入不,同,同濃度的,甘,甘油墊層,，,，即先加,入,入45%,甘,甘油，再,加,加入5%,甘,甘油。,加入病毒,懸,懸液（應(yīng),不,不超過離,心,心管總?cè)?積,積的10%）。,20000-25000r/min,離,離心2h,。,。,棄上層液,體,體，沉淀,用,用適量TEN重懸,（,（渦旋或,超,超聲波處,理,理，使沉,淀,淀分散）,。,。,速度區(qū)帶,離,離心,密度梯度,離,離心,在離心管,中,中加入不,同,同濃度的CsCl,或,或蔗糖墊,層,層，再加,入,入病毒懸,液,液，超高,速,速離心。,蔗糖密度,梯,梯度離心：在離心,管,管中加入20%60

13、%不,連,連續(xù)蔗糖,密,密度梯度,20000-25000r/min離心2h3h，收,集,集蔗糖濃,度,度為35%處的病,毒,毒帶，加,入,入適量緩,沖,沖液稀釋,后,后，再次20000-25000r/min,離,離心2h,，,，沉淀用,適,適量TEN重懸。,P,rV,鄂,A,株電鏡觀,察,察,左圖：上,帶,帶中的P,rV,粒子,右圖：下,帶,帶中的P,rV,粒子,濃縮（方,法,法二）,將經(jīng)低速,離,離心去掉,細(xì),細(xì)胞碎片,及,及雜質(zhì)的,病,病毒懸液,直,直接20000-25000r/min離心2h。,棄上層液,體,體，沉淀,用,用適量TEN重懸,。,。,將重懸的,病,病毒液再,經(jīng),經(jīng)梯度離,心

14、,心純化。,如何利用,純,純化的病,毒,毒進(jìn)行下,一,一步的研,究,究,研究病毒,的,的結(jié)構(gòu),研究病毒,感,感染的分,子,子細(xì)節(jié),病毒粒子,的,的標(biāo)記,研究與受,體,體的結(jié)合,研究病毒,的,的侵入,研究病毒,在,在體內(nèi)的,移,移行,病毒純化,質(zhì)譜分析,靶蛋白驗(yàn),證,證,純化的病,毒,毒是不是,只,只含有病,毒,毒的蛋白,？,？,PRV如,何,何侵入細(xì),胞,胞,免疫金標(biāo),記,記,確定病毒,的,的細(xì)胞受,體,體,解析病毒,侵,侵入細(xì)胞,的,的分子細(xì),節(jié),節(jié),是當(dāng)前病,毒,毒感染研,究,究的重點(diǎn),Internalizationof IHNVparticles through clathrin-mediatedendocytosis,利用量子,點(diǎn),點(diǎn)(quantum dots)標(biāo),記,記研究病,毒,毒的侵入,謝謝觀看,/,歡迎下載,BY FAITHI MEANA VISIONOFGOODONECHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TOSEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESSOFOBSTACLES.BY FAITHI BYFAITH,