《【病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)】第三次課3.4流感病毒的收獲及血凝效價(jià)測(cè)定》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《【病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)】第三次課3.4流感病毒的收獲及血凝效價(jià)測(cè)定（20頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,實(shí)驗(yàn)二 流感病毒的收獲及血凝效價(jià)測(cè)定,第一部分 流感病毒的收獲,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握從雞胚尿囊腔收獲流感病毒的方法，獲得大量的病毒抗原。,實(shí)驗(yàn)原理,將流感病毒接,種于雞胚尿囊腔后，,病毒就在尿囊的內(nèi),胚層細(xì)胞繁殖，繁,殖,12,天后，病毒顆,粒釋放至尿囊液中，,從而使尿囊腔中含,有大量病毒，通過(guò)收獲尿囊液，,可以得到較大量的流感病毒。,實(shí)驗(yàn)材料及器械,1.,已接種流感病毒的十日齡雞胚,2.,無(wú)菌鑷子、眼科剪刀、玻璃吸管、無(wú)菌,EP,管（,1.5,和,10mL,各一個(gè)）,3.75,酒精棉球,實(shí)驗(yàn)方法與步驟,收獲時(shí)

2、間根據(jù)不同的病毒而異，流感病毒一般培養(yǎng),36,48,小時(shí)即可進(jìn)行收獲。收獲前一天晚上，將雞胚于,4,冰箱過(guò)夜（如果急于收獲亦可于,20,放置,1,小時(shí)左右），將雞胚凍死，使紅血球凝固，這樣可避免在收獲時(shí)流出的血細(xì)胞，同尿液或羊水里的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度的下降。,4,冷藏時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)易造成散黃，影響收獲?？焖倮鋬鰰r(shí)間也不易過(guò)長(zhǎng)，一旦雞胚凍成冰塊就無(wú)法收獲。,2.,經(jīng)過(guò)冰凍的雞胚用碘酒、,75,酒精消毒雞胚氣室部卵殼,3.,用無(wú)菌鑷子將消毒過(guò)的殼打碎，輕輕揭去氣室部位卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，并將雞胚輕輕推向一側(cè)，壓住。,4.,用無(wú)菌吸管通過(guò)絨毛尿囊膜進(jìn)入尿囊腔吸出尿囊液（無(wú)大血管處

3、輕輕吸取清亮的黃色液體）。收取的尿囊液可無(wú)菌小瓶,第二部分 血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)測(cè)定流感病毒效價(jià),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握血凝試驗(yàn)的方法和原理，了解流感病毒具有凝集雞紅細(xì)胞的能力，掌握病毒類(lèi)型的測(cè)定的一種方法。,血凝原理,血凝抑制原理,實(shí)驗(yàn)材料及器械,1.,收獲的尿囊液（即流感病毒）,2.1%,雞紅血球、,0.85,生理鹽水,3.,血凝板、吸管、三角瓶,實(shí)驗(yàn)方法及步驟,1.,第,1,孔加入,0.4ml,尿囊液，第,2,孔加入,0.1ml,尿囊液。,2.,吸取,0.9ml,生理鹽水于血凝板第,2,孔，從第,3,孔至第,10,孔每孔各加生理鹽水,0.4ml,。,3.,反復(fù)吹打,3,4,次第,2,孔，從混勻的第,2

4、,孔中丟棄,0.2ml,，吸取,0.4ml,至第,3,孔混勻，再吸,0.4ml,至第,4,孔，依次稀釋到第,9,孔，第,9,孔經(jīng)稀釋吹打后吸出,0.4ml,，,棄去，第,10,孔為血球?qū)φ?，即不加尿囊液?以上各孔（從第,1,孔到第,10,孔）的病毒的稀釋度分別為：,孔數(shù),1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,稀釋度,病毒原液,1,：,10,1,：,20,1,：,40,1,：,80,1,：,160,1,：,320,1,：,640,1,：,1280,空白對(duì)照,注意：各孔內(nèi)液體量應(yīng)為,0.4ml,4.,從第,10,孔開(kāi)始，按,10-1,的方向，向每孔加,0.4ml 1,雞紅血球，輕輕振蕩均勻，

5、置室溫,45,分鐘后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄，各孔的總體積應(yīng)為,0.8ml,。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,病毒原液 紅細(xì)胞對(duì)照,依次加入,0.4ml 1,雞紅血球,實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷,血凝結(jié)果以,+,、,+,、,+,、,+,、,表示。,紅細(xì)胞均勻分布于孔底者為,+,；,紅細(xì)胞均勻分布于孔底，但有卷邊現(xiàn)象為,+,，即不完全凝集；,紅細(xì)胞在孔底形成一個(gè)中等大小環(huán)狀，四周和中心有凝集以兩個(gè)加號(hào),+,表示。,紅細(xì)胞在孔底形成一個(gè)小團(tuán)，邊緣光滑圓潤(rùn)者為,，紅細(xì)胞完全未被凝集；,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的一些問(wèn)題,1.,實(shí)驗(yàn)所使用的玻璃器材及有機(jī)玻璃板均應(yīng)干凈，血凝板使用完畢及時(shí)處理，避免殘留的酸、堿和沉著的紅細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,2.,流感病毒是對(duì)溫度比較敏感的病毒，標(biāo)本置于,20,時(shí)在一兩個(gè)星期內(nèi)會(huì)出現(xiàn)病毒效價(jià)減少的現(xiàn)象，一般需要在,70,存放。,3.,一般采取公雞的紅細(xì)胞，而且存放時(shí)間超過(guò)一周就不可再用。紅細(xì)胞采來(lái)后用,PBS,洗,3,到,4,遍，直到上清很清亮，放置后如果上清變紅，說(shuō)明有溶血，則不可再用。,4.,溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體系對(duì)血凝試驗(yàn)的結(jié)果影響都很大。溫度過(guò)高病毒毒力過(guò)強(qiáng)會(huì)出現(xiàn)溶血，不利于判定。反應(yīng)的時(shí)間不能太長(zhǎng)，對(duì)照孔出現(xiàn)沉淀就可以判定。,思考問(wèn)題,加病毒液和紅細(xì)胞懸液時(shí)為什么要反向加？,血凝試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照的意義？,病毒懸液為什么采取倍比稀釋而不是更高倍數(shù)如十倍比稀釋?zhuān)?