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1、,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,病毒感染與細(xì)胞凋亡,微生物教研組,鄭方亮,病毒感染與細(xì)胞凋亡,1,病毒學(xué)7病毒感染與細(xì)胞凋亡ppt課件,2,細(xì)胞凋亡的含義,多細(xì)胞生物的一種生理性細(xì)胞死亡的過程；,凋亡過程中，細(xì)胞的形態(tài)變化是特有的；,凋亡過程中需要基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，特別是酶的合成。,概念：是由一系列基因控制并受復(fù),雜信號調(diào)節(jié)的細(xì)胞自然死亡,的現(xiàn)象。,細(xì)胞凋亡的含義多細(xì)胞生物的一種生理性細(xì)胞死亡的過程；概念：是,3,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性死亡,從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來說，細(xì)胞程序性死亡與細(xì)胞凋亡是有很大區(qū)別的。,細(xì)胞程序性死亡的概念是個功能

2、性概念，描述在一個多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。,細(xì)胞凋亡則是一個形態(tài)學(xué)的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。,一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個概念可以交互使用，具有同等意義。,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性死亡從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來說，細(xì)胞程序性死,4,凋亡形態(tài)特征,Apoptosis,“葉子凋落”,凋亡形態(tài)特征Apoptosis,5,病毒學(xué)7病毒感染與細(xì)胞凋亡ppt課件,6,病毒學(xué)7病毒感染與細(xì)胞凋亡ppt課件,7,左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞,左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞,8,凋亡形態(tài)特征,凋亡形態(tài)特征,9

3、,壞死,細(xì)胞凋亡,受累范圍,多為連續(xù)的大片細(xì)胞,多為單個細(xì)胞,細(xì)胞膜,完整性受到破壞,仍保持完整性,細(xì)胞體積,增大、細(xì)胞腫脹,減小、固縮 固縮性壞死,核染色質(zhì),散在的小集聚，呈絮狀,積聚在核膜下，呈半月狀,細(xì)胞器,腫脹，尤以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯崩解,仍保持完整，未崩解,溶酶體,破壞，酶外溢,保持完整，酶不外溢,后期,細(xì)胞破裂、溶解、殘屑被巨噬細(xì)胞吞噬,細(xì)胞胞漿裂解成許多碎片（凋亡小體），被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬,炎癥反應(yīng),引起周圍組織炎癥反應(yīng),不引起周圍組織炎癥反應(yīng),壞死細(xì)胞凋亡受累范圍多為連續(xù)的大片細(xì)胞多為單個細(xì)胞細(xì)胞膜完整,10,分子生物學(xué)機(jī)制,細(xì)胞程序性死亡是細(xì)胞之間信號傳導(dǎo)的結(jié)果之一。環(huán)境和發(fā)育

4、的刺激通過配體和受體之間的相互作用傳遞到胞內(nèi)，即配體攜帶的信號通過與穿膜細(xì)胞受體胞外區(qū)域的結(jié)合反應(yīng)到受體的胞內(nèi)區(qū)域，完成信號由胞外到胞質(zhì)的傳遞，然后開始胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜作用，最后導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。,分子生物學(xué)機(jī)制 細(xì)胞程序性死亡是細(xì)胞之間,11,凋亡的過程,信號傳遞階段,死亡信號的探測,胞外信號（配體與受體的特異結(jié)合）,胞內(nèi)信號（毒素、射線引起的損傷或病毒感染）,下游死亡機(jī)制的傳遞,效應(yīng)階段,Caspase,的激活最終造成細(xì)胞死亡。,凋亡的過程信號傳遞階段,12,病毒學(xué)7病毒感染與細(xì)胞凋亡ppt課件,13,凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)特點(diǎn),多樣性：不同種類的細(xì)胞系統(tǒng)不同,偶聯(lián)性：與增殖分化

5、的信號系統(tǒng)交叉偶聯(lián),同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā),多途性：同一誘導(dǎo)因素啟動多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo),途徑,凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)特點(diǎn) 多樣性：不同種類的細(xì)胞系統(tǒng)不同,14,凋亡的激活途徑,Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,線粒體參與的細(xì)胞凋亡,凋亡的激活途徑Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,15,Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,富含半胱氨酸,死亡結(jié)構(gòu)域,death effector domain,Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡富含半胱氨酸死亡結(jié)構(gòu)域 death ef,16,線粒體參與的細(xì)胞凋亡,BID,線粒體參與的細(xì)胞凋亡 BID,17,Caspase 可激活名叫CAD（caspase-activated Dnase）的核酸酶，CAD能在核小體的連接

6、區(qū)將其切斷，形成約為200bp整數(shù)倍的核酸片段。正常情況下CAD存在于胞質(zhì)中，并且與抑制因子ICAD/DFF-45蛋白結(jié)合，不能進(jìn)入細(xì)胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45，釋放出CAD，使它進(jìn)入細(xì)胞核降解DNA。,Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。,Caspase可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)

7、節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除此之外，Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。,效應(yīng)階段,Caspase 可激活名叫CAD（caspase-act,18,病毒學(xué)7病毒感染與細(xì)胞凋亡ppt課件,19,吞噬,吞噬,20,凋亡相關(guān)的基因和蛋白,細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因，包括一些與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。,凋亡相關(guān)的基因和蛋白 細(xì)胞凋亡的調(diào)控,21,Caspase家族,Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦被信

8、號途徑激活，能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆的走向死亡。它們均有以下特點(diǎn)：,活性中心富含半胱氨酸,；,對底物天冬氨酸部位有特異水解作用,，所以命名為caspase（,c,ysteine-containing,a,spartate-,s,picific,p,rote,ase,），方便起見本文稱之為凋亡酶；都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個活性亞基。,Caspase家族 Caspase屬,22,分為兩類：一類為執(zhí)行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，它們可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能

9、通過自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一類為啟動者（initiator），如caspase-8、9，收到信號后，能通過自剪接而激活，然后引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7,分為兩類：一類為執(zhí)行者（execut,23,Apaf-1,Apaf-1被稱為凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1），在線粒體參與的凋亡途徑中具有重要作用，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞過多，腦畸形發(fā)育。Apaf-1含有3個不同的結(jié)構(gòu)域：CARD（caspase recruitment domain

10、）結(jié)構(gòu)域，能召集caspase-9；ced-4 同源結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合ATP/dATP；C端結(jié)構(gòu)域，含有色氨酸/天冬氨酸重復(fù)序列，當(dāng)細(xì)胞色素c結(jié)合到這一區(qū)域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而這一過程又需要細(xì)胞色素c和caspase-9參與。Apaf-1/細(xì)胞色素c復(fù)合體與ATP/dATP結(jié)合后，Apaf-1就可以通過其CARD結(jié)構(gòu)域召集caspase-9，形成凋亡體（apoptosome），激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。,Apaf-1 Apaf-1被稱為凋亡,24,Bcl-2家族,Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白。它們

11、在線粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用，能控制線粒體中細(xì)胞色素c等凋亡因子的釋放。,Bcl-2家族成員都含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4），并且通常有一個羧端跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane region,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域，BH3是與促進(jìn)凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可將Bcl-2基因家族分為兩類，一類是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一類是促進(jìn)凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中還有一類僅含BH3結(jié)構(gòu)，如Bid、Bad。,雖然

12、Bcl-2蛋白存在于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上，但主要定位于線粒體外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。,Bcl-2家族Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白。它們,25,病毒學(xué)7病毒感染與細(xì)胞凋亡ppt課件,26,Fas,Fas又稱作APO-1/CD95，屬TNF受體家族。Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺細(xì)胞，激活的T和B淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細(xì)胞等。Fas蛋白與Fas配體結(jié)合后，會激活caspase，導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。,Fas Fas又稱作APO-1/CD9,27,p53,一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是在G期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷

13、，則抑制細(xì)胞增殖，直到DNA修復(fù)完成。如果DNA不能被修復(fù)，則誘導(dǎo)其調(diào)亡，研究發(fā)現(xiàn)喪失p53功能的小鼠胸腺細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的調(diào)亡反應(yīng)和正常細(xì)胞相同，而對輻射誘導(dǎo)的調(diào)亡不敏感。,p53 一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是在,28,C-myc,在許多人類惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有c-myc的過度表達(dá)，它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化。在凋亡細(xì)胞中c-myc也是高表達(dá)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一方面它能激活那些控制細(xì)胞增殖的基因，另一方面也激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，給細(xì)胞兩種選擇：增殖或凋亡。當(dāng)生長因子存在，Bcl-2基因表達(dá)時，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。,C-myc 在許多人類惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā),29,ATM,AT

14、M（ataxia telangiectasia-mutated gene）是與DNA損傷檢驗有關(guān)的一個重要基因。正常細(xì)胞經(jīng)放射處理后，DNA損傷會激活修復(fù)機(jī)制，如DNA不能修復(fù)則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ATM是DNA損傷檢驗點(diǎn)的一個重要的蛋白激酶,ATM ATM（ataxia tel,30,細(xì)胞凋亡的檢測方法,形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察,DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶,TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法,彗星電泳法（comet assay）,流式細(xì)胞分析,細(xì)胞凋亡的檢測方法形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察,31,DNA電泳鑒定,+,壞死,凋亡,DNA電泳鑒定+壞死凋

15、亡,32,細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖,1細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0 h,2細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1 h,3細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2 h,4細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3 h,5細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4 h,6陰性對照,7Marker,（自趙允、翟中和）,細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖,33,細(xì)胞凋亡的意義,確保正常發(fā)育生長：清除多余的細(xì)胞,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、衰老的細(xì)胞,積極防御功能：對病毒感染細(xì)胞阻止 復(fù)制,細(xì)胞凋亡的意義確保正常發(fā)育生長：清除多余的細(xì)胞,34,凋亡的重要性,正常情況下，凋亡在脊椎動物和無脊椎動物中扮演著重要的角色。凋亡使細(xì)胞死亡時仍保持細(xì)胞完整性，以此避免胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏和由此引起的炎癥反應(yīng)。因此凋亡在正常組織細(xì)胞的更換、發(fā)育及免疫系統(tǒng)中起到了重要作用。,凋亡的重要性 正常情況下，凋亡在脊椎動物和無脊,35,病毒感染與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,病毒感染促進(jìn)細(xì)胞凋亡,病毒感染抑制細(xì)胞凋亡,病毒感染與細(xì)胞凋亡的關(guān)系病毒感染促進(jìn)細(xì)胞凋亡,36,流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,NS1,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子,流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡NS1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子,37,