《霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ppt課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ppt課件（35頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,,,?#?,研究背景,,霍奇金淋巴瘤（,Hodgkin’s lymphoma,，,HL,，,Hodgkin’s disease,，）是,惡性淋巴瘤,的一個(gè)獨(dú)特類型。,,研究背景,其特點(diǎn)為：①臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。原發(fā)于結(jié)外淋巴組織的少見。,研究背景,②,瘤組織成分多樣，但,HL,特異性的病理改變?yōu)?——,大量反應(yīng)性增生的

2、背景淋巴細(xì)胞中可見少于,1%Reed-Sternberg,細(xì)胞（,R-S,細(xì)胞）。,,,,,這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于,B,淋巴細(xì)胞,(,鏡影細(xì)胞,),研究背景,p53,和,bcl-2,基因突變,,,,,EB,病毒感染,但證據(jù)均不足，,HL,的發(fā)病機(jī)制,尚未明確,腫瘤細(xì)胞,,,,研究背景,有研究發(fā)現(xiàn),NF-κB (RelA/P50),的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。,[1],IκBα,作為重要的,NF-κB,通路,抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。,,,研究背景,將對(duì),IκBα,激酶 （,IκBα kinase, IKK,）無(wú)反應(yīng)的,IκBα,突變體導(dǎo)入,HRS,細(xì)胞中可阻斷,NF-κ

3、B,的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說(shuō)明,IκBα,在,HL,發(fā)病機(jī)制中有重要作用。,[2],,,研究背景,Emmerich,等人的研究表明,HRS,細(xì)胞中,IκBα mRNA,高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與,HL,中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由,IκBα,蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。,[3],,研究目的,本實(shí)驗(yàn)意在：,①了解,IκBα,基因在,HL,中突變的情況；,②分析經(jīng)典型,HL HRS,中,IκBα,突變的特點(diǎn)、可能造成的蛋白結(jié)構(gòu)異常；,③以及這些異常的病理意義，即其與,HL,發(fā)病的相關(guān)性。,實(shí)驗(yàn)材料與試劑,霍奇金淋巴瘤組織樣本,CD30,單抗,（,Dako,公司，克隆號(hào),Ber,—,H

4、2,，效價(jià),1,：,20,）,Leica ASLMD,激光顯微,系統(tǒng),PCR,引物,（,北京賽百勝公司,）,PCR,儀（包括反應(yīng)體系）,DNA,測(cè)序儀,,實(shí)驗(yàn)流程,CD30,免疫組化,,激光顯微切割和,DNA,提取,,IκBα,基因擴(kuò)增,,PCR,產(chǎn)物檢測(cè),,待測(cè)基因外含子,測(cè)序,,,CD30,免疫組化,,采用,EnVision,兩步法,。,將冰凍組織切成,6,μ,m,厚連續(xù)切片，貼于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,．,05,％,NP40,的丙酮,(v,／,v),固定,10 min,，室溫下自然干燥；,,CD30,免疫組化,6,％,H2O2-,甲醇，,37,℃,10 min,，消

5、除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；,,加,1,：,20,稀釋的一抗；,,加相應(yīng)的二抗，,DAB,顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。,,,激光顯微切割和,DNA,提取,用,Leica ASLMD,系統(tǒng)逐個(gè)切割組織切片上的,CD30,陽(yáng)性細(xì)胞,（,切割參數(shù)：激光強(qiáng)度,37,，波長(zhǎng),377,，速度,5,，光束直徑,8,）,。,,將目的細(xì)胞從切片上分離，在光壓強(qiáng)作用下被收集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本,3,～,6,組，每組約,25,～,70,個(gè)細(xì)胞。,,切割周圍的正常淋巴細(xì)胞每例,2,管，,每管約,50,個(gè)細(xì)胞。,,,,,擴(kuò)增目的基因，上游引物：,5,’,-CACACTGTGCCCATCTACG-3,’，下游引物

6、：,5,’一,GGTc1-ITI,’,GCGGATGTCCAC,一,3,’,。,,（緩沖體系：,10X,反應(yīng)緩沖液,2,．,5,μ,l,，,MgCL,2,(25 mmol,／,L)1,．,5,μ,l,，,dNTP(10 mmoL,／,L)1,．,0,μ,l,，上游引物,(10~,μ,moL,／,L)0,．,5,μ,l,，下游引物,(10,μ,mol,／,L)0,．,5,μ,l,，,Taq,酶,(5 U,／ μ,L)0,．,3,μ,l,，,,模板,2,．,0,μ,l,，總體積,25,μ,l,。反應(yīng)條件：,94,℃預(yù)變性,5 min,，,94,℃變性,1 min,，,55,％退火,1 min,，,

7、72oC,延伸,1 min,，共,40,個(gè)循環(huán)，,72,℃延伸,7min,，至,4,℃結(jié)束。,,以雙蒸水代替,DNA,模板作為陰性對(duì)照。）,,IκBα,基因擴(kuò)增,對(duì),HRS,細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的,IκBα,6,個(gè)外顯子進(jìn)行半巢式,PCR,擴(kuò)增。,,用已知,IκBα,外顯子,PCR,擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。,,,,,,,,,這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞 (鏡影細(xì)胞),IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,對(duì)HRS細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的IκBα 6個(gè)外顯子進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。,J Clin Invest, 1997, 100 (12):

8、2961-9.,將目的細(xì)胞從切片上分離，在光壓強(qiáng)作用下被收集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本3～6組，每組約25～70個(gè)細(xì)胞。,6％ H2O2-甲醇，37℃ 10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,取5 μ l PCR產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流12

9、0 mA，20 min。,如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以內(nèi)是可信的）,切割周圍的正常淋巴細(xì)胞每例2管，,PCR儀（包括反應(yīng)體系）,用Leica ASLMD系統(tǒng)逐個(gè)切割組織切片上的CD30陽(yáng)性細(xì)胞（切割參數(shù)：激光強(qiáng)度37，波長(zhǎng)377，速度5，光束直徑8）。,反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ ，5min，繼而95℃變性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。,有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB (RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。,加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，

10、蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。,反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，至4℃結(jié)束。,每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。,在這種技術(shù)中，首先用一對(duì)外引物進(jìn)行第1輪PCR，然后再使用第1對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)增，所以稱為巢式PCR。,激光顯微切割和DNA 提取,PCR,擴(kuò)增反應(yīng)體系,擴(kuò)增,IκBα,第一和第二外顯子反應(yīng)體系：,10 X PCR,緩沖液,5,．,0,μ,1,，,MgC1,：,(25mmoi,／,L)

11、5,．,0,μ,Ixl,，,dNTPs(10 mmol,／ μ,L)2,．,0,μ,l,，,DMSO2,．,0,μ,l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,／,pJ)1,．,0,μ,l,，,DNA,模板,(0,．,5 g,／,IL1)2,．,0,μ,l,，擴(kuò)增第一外顯子時(shí)加引物,1,μ,Ixl,；擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物,0,．,3,μ,l,，補(bǔ)所需,ddH2O,使反應(yīng)體系達(dá)到,50,μ,I,。反應(yīng)條件：預(yù)變性,95,℃ ，,5min,，繼而,95,℃變性,50 s,，,65,℃退火,30 s,，,72,℃延伸,90 S,，共,35,個(gè)循環(huán)，最后,72,℃延伸,10 min,。第二輪，反應(yīng)體系

12、,50,μ,l,，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物,1,．,25,μ,l,。擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加,2,μ,l DMSO(,擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加,DMSO),。反應(yīng)條件同第一輪。,,擴(kuò)增,IκBα,第三到第六外顯子反應(yīng)體系,：,,第一輪，,l0,×,PCR,緩沖液,5,．,0,μ,Ixl,，,MgCL,2,(25 mmol,／,L)4,．,0 l,，,dNTPs(10 mmol,／,L)2,．,0 l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,／ μ,L)1,．,0,μ,l,，,DNA,模板,(0,．,5,μ,g,／,,μ,L)2,．,0,μ,l,，引物,1,μ,l,。反應(yīng)條件同擴(kuò)增一、二外顯子者，但退

13、火溫度為,63,℃。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為,1,．,25,μ,L,。反應(yīng)條件為預(yù)變性,95,℃ ，,5 min,，繼而,95,℃變性,50 S,，,65,℃退火,30 S,，,72 oC,延伸,90 S,，共,35,個(gè)循環(huán)，最后,72,℃延伸,10 min,。）,,PCR,產(chǎn)物檢測(cè),取,5,μ,l PCR,產(chǎn)物，用,2,％瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流,120 mA,，,20 min,。,,紫外燈下觀察。,,IκBα,的,6,個(gè)外顯子陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為,exon1(476bp),、,exon2(433bp),、,exon3(399bp),、,exon4(184bp),、,exon

14、5(381bp),和,exon6(441bp),。,,,,,預(yù)期結(jié)果,——,電泳,電泳條帶不在同一水平線上,——,基因明顯突變。,,預(yù)期結(jié)果,——,電泳,電泳條帶在同一水平線上。,沒有突變,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,,待測(cè)基因外含子,測(cè)序,,每管,DNA,樣品都要擴(kuò)增,2,次，使用上海博亞公司,ABI377DNA,測(cè)序儀對(duì),PCR,陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。,,預(yù)期結(jié)果,——,測(cè)序,堿基序列出現(xiàn)改變,圖,A-,箭頭處為,T-A,突變（,TGA,為終止密碼）,圖,B-,反向測(cè)序證實(shí),（藍(lán)色,-C,,紅色,-T,，綠色,-A,，黑色,-G,）,預(yù)期結(jié)果,堿基序列沒有突變,C,、,D,分別為沒有

15、突變的正、反向測(cè)序,預(yù)期結(jié)果,腫瘤細(xì)胞,I,κ,B,α,基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞,I,κ,B,α,基因沒有突變。,,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的,I,κ,B,α,基因都沒有突變。,,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的,I,κ,B,α,的突變率都增加,,IκBα,基因參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化有關(guān),,IκBα,基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,,,,,,,,估計(jì)不會(huì)發(fā)生這種情況，如若發(fā)生則需要進(jìn)一步研究,,參考文獻(xiàn),[1] Bargou R.C,,et al,. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is req

16、uired for proliferation and survival of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,J Clin Invest,, 1997, 100 (12): 2961-9.,[2] Dejardin E,,et al,. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Oncogene,, 1999, 18(16):2567-77.,[3] Emmerich F,,et al,. Overexpression

17、 of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,Blood,, 1999, 94(9): 3129-34.,……,Thank you,！,,J Clin Invest, 1997, 100 (12): 2961-9.,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的IκBα的突變率都增加,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related prot

18、eins in adenocarcinoma cells [J].,IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,采用EnVision兩步法。,激光顯微切割和DNA 提取,每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。,電泳條帶在同一水平線上。,EnVision兩步法,IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,C、D分別為沒有突變的正、反向測(cè)序,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcin

19、oma cells [J].,[1] Bargou R.,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,第二輪，反應(yīng)體系50 μ l，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物1．25 μ l。,電泳條帶在同一水平線上。,激光顯微切割和DNA 提取,這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞 (鏡影細(xì)胞),點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,巢式,PCR,巢式聚合酶鏈反應(yīng),(n

20、ested polymearse chain reaction, nPCR),也稱套式,PCR,。,在這種技術(shù)中，首先用一對(duì)外引物進(jìn)行第,1,輪,PCR,，然后再使用第,1,對(duì)引物擴(kuò)增的,DNA,序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)增，所以稱為巢式,PCR,。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第,2,輪擴(kuò)增時(shí)采用,半巢式，,設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第,1,輪擴(kuò)增共用，。,反向測(cè)序,一個(gè)是,正向引物（上游引物），,用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序,(,從上游往下測(cè)序,),，也就是,5',到,3',另外一個(gè)就是,反向引物（下游引物,），用它來(lái)測(cè)序就是反向測(cè)序（從下游往上測(cè)序），也就是,3',到,5',如果片段在,800,以內(nèi)，那么隨

21、便進(jìn)行一個(gè)方向就能測(cè)出你全部的序列了,如果在,800-1600,之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證,800bp,以內(nèi)是可信的）,,EnVision,兩步法,,DAKO EnVision,顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即,EnVision,）直接放大信號(hào),40-50,倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點(diǎn)：敏感、省時(shí)、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生物素干擾）。,,CD30,免疫組化,,采用,EnVision,兩步法,。,將冰凍組織切成,6,μ,m,厚連續(xù)切片，貼于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,

22、0,．,05,％,NP40,的丙酮,(v,／,v),固定,10 min,，室溫下自然干燥；,,CD30,免疫組化,6,％,H2O2-,甲醇，,37,℃,10 min,，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；,,加,1,：,20,稀釋的一抗；,,加相應(yīng)的二抗，,DAB,顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。,,,預(yù)期結(jié)果,——,電泳,電泳條帶在同一水平線上。,沒有突變,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,,參考文獻(xiàn),[1] Bargou R.C,,et al,. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for prolife

23、ration and survival of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,J Clin Invest,, 1997, 100 (12): 2961-9.,[2] Dejardin E,,et al,. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Oncogene,, 1999, 18(16):2567-77.,[3] Emmerich F,,et al,. Overexpression of I kappa B alp

24、ha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells [J].,Blood,, 1999, 94(9): 3129-34.,……,Thank you,！,,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,PCR儀（包括反應(yīng)體系）,[1] Bargou R.,擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2 μ l DMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,[3] Emmerich F, et al.,擴(kuò)增I

25、κBα第一和第二外顯子反應(yīng)體系：,第二輪，反應(yīng)體系50 μ l，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物1．25 μ l。,切割周圍的正常淋巴細(xì)胞每例2管，,PCR儀（包括反應(yīng)體系）,（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5 μ l，MgCL2(25 mmol／L)1．5 μ l，dNTP(10 mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,對(duì)HRS細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的IκBα 6個(gè)外顯子進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。,（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5 μ l，MgCL2(25 mm

26、ol／L)1．5 μ l，dNTP(10 mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,IκBα的6個(gè)外顯子陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為exon1(476bp)、 exon2(433bp)、 exon3(399bp)、 exon4(184bp)、 exon5(381bp)和 exon6(441bp)。,取5 μ l PCR產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流120 mA，20 min。,取5 μ l PCR產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流120 mA，20 min。,反

27、應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ ，5 min，繼而95℃變性50 S，65℃退火30 S，72 oC延伸90 S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。,反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ ，5min，繼而95℃變性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。,C、D分別為沒有突變的正、反向測(cè)序,C、D分別為沒有突變的正、反向測(cè)序,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,②分析經(jīng)典型HL HRS中IκBα突變的特點(diǎn)、可能造成的蛋白結(jié)構(gòu)異常；,對(duì)HRS細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的IκBα 6個(gè)外顯子進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。,如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向

28、測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以內(nèi)是可信的）,DAKO EnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。,PCR儀（包括反應(yīng)體系）,取5 μ l PCR產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流120 mA，20 min。,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha ge

29、ne in Reed-Sternberg cells [J].,一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來(lái)測(cè)序就是正向測(cè)序(從上游往下測(cè)序)，也就是5'到3',點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,第一輪，l0×PCR緩沖液5．0 μ Ixl，MgCL2(25 mmol／L)4．0 l，dNTPs(10 mmol／L)2．0 l，Taq DNA聚合酶(5 U／ μL)1．0 μ l，DNA模板(0．5 μ g／ μL)2．0 μ l，引物1 μ l。,有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB (RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。,采用EnVision兩步法。,EnVision兩步法,EnVision兩步

30、法,CD30單抗（Dako公司，克隆號(hào)Ber—H2，效價(jià)1：20）,反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ ，5min，繼而95℃變性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。,第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25 μ L。,PCR儀（包括反應(yīng)體系）,反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ ，5min，繼而95℃變性50 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 S，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。,加1：20稀釋的一抗；,采用EnVision兩步法。,切割周圍的正常淋巴細(xì)胞每例2管，,用Leica ASLMD系統(tǒng)逐個(gè)切割組織切片上的CD30陽(yáng)性細(xì)胞（切割參

31、數(shù)：激光強(qiáng)度37，波長(zhǎng)377，速度5，光束直徑8）。,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,如果在800-1600之間，那么就要同時(shí)進(jìn)行正反向測(cè)序才能測(cè)出你的片段（因?yàn)橐粋€(gè)方向上的測(cè)序結(jié)果最好也只能保證800bp以內(nèi)是可信的）,腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞IκBα基因沒有突變。,[3] Emmerich F, et al.,（緩沖體系：10X反應(yīng)緩沖液2．5 μ l，MgCL2(25 mmol／L)1．5 μ l，dNTP(10

32、mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l，,第二輪，反應(yīng)體系50 μ l，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物1．25 μ l。,EnVision兩步法,采用EnVision兩步法。,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells [J].,Leica ASLMD激光顯微系統(tǒng),將冰凍組織切成6μm厚連續(xù)切片，貼于Leica PEN膜空白切片上，用含0．0

33、5％ NP40的丙酮(v／v)固定10 min，室溫下自然干燥；,Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IκBα mRNA高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由IκBα蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。,（藍(lán)色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G）,這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞 (鏡影細(xì)胞),巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nested polymearse chain reaction, nPCR)也稱套式PCR。,反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，至4℃結(jié)束。,反應(yīng)條

34、件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，至4℃結(jié)束。,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的IκBα的突變率都增加,每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。,切割周圍的正常淋巴細(xì)胞每例2管，,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,電泳條帶不在同一水平線上——基因明顯突變。,Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival

35、of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,用Leica ASLMD系統(tǒng)逐個(gè)切割組織切片上的CD30陽(yáng)性細(xì)胞（切割參數(shù)：激光強(qiáng)度37，波長(zhǎng)377，速度5，光束直徑8）。,IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB (RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。,IκBα基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,Leica ASLMD激光顯微系統(tǒng),Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival

36、of Hodgkin’s disease tumor cells [J].,第二輪，反應(yīng)體系50 μ l，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物1．25 μ l。,腫瘤細(xì)胞IκBα基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞IκBα基因沒有突變。,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的IκBα的突變率都增加,EnVision兩步法,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,[1] Bargou R.,第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為1．25 μ L。,,EnVision,兩步法,,DAKO EnVision,顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即,EnVision,）直接放大信號(hào),40-50,倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點(diǎn)：敏感、省時(shí)、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生物素干擾）。,,