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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,單擊此處編輯母版標題樣式,*,*,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,第六章 病毒的純化,利用各種物理、化學方法，以,不使病毒受損傷和失活為前提,，去除宿主細胞組分等非病毒雜質，提取出高純度濃縮的病毒樣品。,病毒微細結構的研究,病毒抗原蛋白的分離純化,病毒化學成分及其遺傳物質的研究,病毒感染的分子細節(jié)的研究,一、病毒純化的標準,保持感染

2、性,具有均一性：,結晶形成,檢測病毒制備物均一性的方法：,電鏡觀察：,大小、形態(tài)均一,超速離心：,沉降速率和密度一致，只出現(xiàn)一條沉降帶,電泳：,顆粒大小及表面電荷均一，只形成一條電泳帶,免疫學方法：,只與特異性抗體發(fā)生反應,大小、形態(tài)、密度、化學組成、分子量、抗原性,二、病毒純化的理論依據(jù),病毒體外表面的主要化學組成是蛋白質，可利用蛋白質提純的方法純化病毒,病毒體具有一定大小、形狀和密度，可利用超速離心技術提純病毒,三、病毒純化前的預處理,1、病毒感染的組織、臟器或細胞,研磨勻漿,超聲波處理,反復凍融,低速離心去掉細胞碎片,2、細胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液,低速離心去掉可能含有的雜質或直接用于病毒的

3、分離純化,沉淀法,超速離心法,超濾法,層析法,兩相溶劑間分配系數(shù)法,吸附法,電泳法,四、病毒純化的方法,（一）沉淀法,主要從稀的病毒懸浮液中濃縮病毒。,中性鹽沉淀法（鹽析）,聚乙二醇沉淀法,有機溶劑沉淀法,等電點沉淀法,皂土法,魚精蛋白沉淀法,1、中性鹽沉淀法（鹽析）,先用其它方法去除材料中的大量雜質，再以高濃度的中性鹽溶液鹽析，析出的沉淀用緩沖液懸浮后再進行鹽析，反復幾次后，懸浮沉淀，用透析法或其它方法脫鹽。,病毒一般在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀，且保持感染性。,2、聚乙二醇（PEG）沉淀法,用于病毒沉淀的分子量：2000-6000,將PEG配成50%左右的溶液，或直接將固體PEG加

4、于病毒懸液中，使其達到所需濃度，在4攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。,3、有機溶劑沉淀法,乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物,原理：,A、降低溶液的介電常數(shù)，從而增加病毒顆粒表面不同電荷之間的引力，導致其溶解度降低。,B、與水作用，破壞蛋白質分子的水化膜。,優(yōu)點：,分辨力高，易除去,缺點：,易使表面蛋白質變性，溶解脂質,4、等電點沉淀法（分辨力不高）,原理：,病毒粒子在等電點時，所攜帶的正電荷與負電荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而發(fā)生沉淀（分辨力不高）。,多數(shù)病毒的等電點在pH4.,5.5之間。,5、皂土法,輪狀病毒,皂土在酸性條件下（pH4,4.5)可吸附輪狀病毒，在堿性條件下(pH8.

5、5)，又使其洗脫下來。,6、魚精蛋白沉淀法（沉淀直徑大于50nm的病毒）,魚精蛋白為堿性蛋白，具有攜帶其它蛋白質（直徑大于50nm）共沉淀的作用，當向這種沉淀物加入1mol/L NaCl時，其它蛋白質又重新釋放到懸液中，而魚精蛋白仍然沉淀。,（二）層析法,葡聚糖柱層析法,凝膠層析法,離子交換柱層析法,親和層析法,（三）兩相溶劑間分配系數(shù)法,原理：,溶質在兩個互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而選擇性地分配于其中的一方。,常用的溶劑：,葡聚糖硫酸鹽（dextran sulphate,Ds),聚乙二醇（PEG）,甲基纖維素（MC）,聚乙烯醇（PVA）,分配體系：,Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-

6、MC系,（四）吸附法,原理：,利用對病毒或對雜質有選擇吸附能力的固體吸附劑吸附病毒或吸附雜質，再用一定的鹽溶液把它們洗脫下來。,作為吸附劑必須具備的特點：,有較大的表面積和吸附能力,較高的吸附選擇性,便于洗脫,性質穩(wěn)定,常用吸附劑：,白土,磷酸鈣,硅藻土,紅細胞,離子交換樹脂,羧甲基纖維素,（六）超濾法,利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮。,優(yōu)點：,可用于大容量樣品的濃縮,可以在室溫或低溫下操作,對被濃縮產(chǎn)物的損害小,濃縮的同時可達到部分純化,回收率高,可防止外來污染,（五）電泳法,（七）離心法,差速離心,速度區(qū)帶離心法,密度梯度離心,1.差速

7、離心法,原理：,不同大小和比重的粒子沉降速度不同。,用途：,從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細胞吸附釋放的病毒懸液中提純病毒。,優(yōu)點：,可快速處理大量樣品,步驟：,低速（2000-3000r/min,20-30min)、中速（10000min,20-30min)去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其它較大的雜質。再選擇較高速度離心1-2h使病毒沉淀。,速度梯度離心法,密度梯度離心法,原理,沉降與顆粒質量成正比，以物質沉降速度的不同進行分離,沉降與顆粒密度成正比，以物質浮密度的不同進行分離,介質,密度小，1-1.3286，預制梯度，不連續(xù),密度大，1-1.9025，連續(xù)梯度,離心力場,強，離心速

8、度高，使被分離物質易沉降,稍強，速度相對低，使CsCl形成梯度，建立沉降擴散平衡,離心過程,樣品向離心管底沉降,樣品停留于介質的等密度部位,離心時間,較短，幾小時到幾十小時,較長，十幾小時到數(shù)天,2.速度梯度離心法與密度梯度離心法,速度梯度離心,密度梯度離心,A,B,五、病毒純化應注意的問題,1、保持病毒的感染性,嚴格控制溫度、pH及試劑的選擇。,2、選用適宜的純化實驗起始材料,無其它病毒或毒株的污染,病毒體的含量高,雜質含量少并易于處理,3、根據(jù)具體情況選擇提純方法,根據(jù)需要純化的病毒的性質、起始材料的特點、研究的目的以及實驗室的條件等，選擇適宜的純化方法。,4、建立靈敏的病毒鑒定和測定方法

9、,六、偽狂犬病毒的濃縮提純,1、病毒材料,將偽狂犬病病毒接種于PK-15細胞，病變后收集細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次，即為樣品材料。,2病毒提純濃縮,去細胞碎片及雜質：,將細胞培養(yǎng)物4 3000r/min離心30min，收集上清液。,硫酸銨沉淀：,按100ml病毒液42.5g硫酸銨的量加入硫酸銨，攪勻后置4冰箱攪拌沉淀過夜，4 5000r/min離心40min，去上清，沉淀用適量的滅菌ddH,2,O懸浮。,透析：,將懸浮的病毒液裝于透析袋中，于ddH,2,O或PBS中攪拌透析，每半個小時換一次液，共換5次，第5次透析過夜。,濃縮：,透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖將病毒濃縮至合適的體積。,超離純

10、化：,在離心管中加入不同濃度的甘油墊層，即先加入45%甘油，再加入5%甘油。,加入病毒懸液（應不超過離心管總容積的10%）。,20000-25000r/min離心2h。,棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸（渦旋或超聲波處理，使沉淀分散）。,速度區(qū)帶離心,密度梯度離心,在離心管中加入不同濃度的CsCl或蔗糖墊層，再加入病毒懸液，超高速離心。,蔗糖密度梯度離心,：在離心管中加入20%60%不連續(xù)蔗糖密度梯度,20000-25000r/min離心2h3h，收集蔗糖濃度為35%處的病毒帶，加入適量緩沖液稀釋后，再次20000-25000r/min離心2h，沉淀用適量TEN重懸。,P,rV,鄂,A,株電鏡

11、觀察,左圖：上帶中的P,rV,粒子,右圖：下帶中的P,rV,粒子,濃縮（方法二）,將經(jīng)低速離心去掉細胞碎片及雜質的病毒懸液直接20000-25000r/min離心2h。,棄上層液體，沉淀用適量TEN重懸。,將重懸的病毒液再經(jīng)梯度離心純化。,如何利用純化的病毒進行下一步的研究,研究病毒的結構,研究病毒感染的分子細節(jié),病毒粒子的標記,研究與受體的結合,研究病毒的侵入,研究病毒在體內的移行,病毒純化,質譜分析,靶蛋白驗證,純化的病毒是不是只含有病毒的蛋白？,PRV如何侵入細胞,免疫金標記,確定病毒的細胞受體,解析病毒侵入細胞的分子細節(jié),是當前病毒感染研究的重點,Internalization of

12、IHNV particles through clathrin-mediated endocytosis,利用量子點(quantum dots)標記研究病毒的侵入,謝謝觀看,/,歡迎下載,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH,內容總結,第六章 病毒的純化。病毒感染的分子細節(jié)的研究。超速離心：沉降速率和密度一致，只出現(xiàn)一條沉降帶。電泳：顆

13、粒大小及表面電荷均一，只形成一條電泳帶。病毒體外表面的主要化學組成是蛋白質，可利用蛋白質提純的方法純化病毒。低速離心去掉可能含有的雜質或直接用于病毒的分離純化。主要從稀的病毒懸浮液中濃縮病毒。原理：病毒粒子在等電點時，所攜帶的正電荷與負電荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而發(fā)生沉淀（分辨力不高）。原理：溶質在兩個互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而選擇性地分配于其中的一方。常用的溶劑：葡聚糖硫酸鹽（dextran sulphate,Ds)。利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮。原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。用途：從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細胞吸附釋放的病毒懸液中提純病毒。沉降與顆粒密度成正比，以物質浮密度的不同進行分離。謝謝觀看/歡迎下載,