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1、 DNA的粗提取與鑒定 [導(dǎo)學(xué)誘思 ] 1．提取 DNA 的方法 提取生物大分子的基本思路是 。 對于 DNA 的粗提取而言， 就是要利用 、 等在物理和化學(xué)性質(zhì)方 面的差異，提取 DNA，去除其他成分。 1） DNA 的溶解性 DNA 和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的 中溶解度不同， 利用這一特點，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使 充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反， 以達(dá)到分離目的。 圖 5— 1 是 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲線，請根據(jù)曲線圖，思考： ①在什么濃度下， DNA 的溶解度最?。? DNA 在 N

2、aCl 溶液中的溶解度是如何變化的？ ②如何通過控制 NaCl 溶液的濃度使 DNA 在鹽溶液中溶解或析出？ 此外， DNA 不溶于 溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原 理，可以將 DNA 與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。 2） DNA 對酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是對 沒 有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受 60— 80oC 的高溫，而 DNA 在 以上才會變性。洗滌 劑能夠瓦解 ，但對 DNA 沒有影響。 3） DNA 的鑒定 在 條件下， DNA 遇 會被染成 色，

3、因此二苯胺可以作為鑒定 DNA 的試劑。 2．實驗設(shè)計 1 ） 實 驗 材 料 的 選 取 凡 是 含 有 的 生 物 材 料 都 可 以 考 慮 ， 但 是 使 用 的生物組織，成功的可能性更大。在下面的生物材料中選取適合的實驗材料： 魚卵、豬肝、菜花（花椰菜） 、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基的大腸桿菌 思考： 哺乳動物的紅細(xì)胞的特點？ 2）破碎細(xì)胞，獲取含 DNA 的濾液 動物細(xì)胞的破碎比較容易 ，以雞血細(xì)胞為例，在雞 血細(xì)胞液中加入一定量的 ，同時用 攪拌，過

4、濾后收集濾液即可。 如果實驗材料 是植物細(xì)胞，需要先用 溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的 DNA 時，在切碎的洋蔥中 加入一定的 和 ，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。 思考： ①為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？ ②加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？ ③如果研磨不充分，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響 ? 用心 愛心 專心 ④此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？ 3）去除濾液中的雜質(zhì) 閱讀課本的三個方案， 思考： 為什么反復(fù)地溶解與析

5、出 DNA，能夠去除雜質(zhì)？ 方案二與方案三的原理有什么不同？ 4） DNA 的析出與鑒定 將處理后的溶液過濾 ，加入與濾液體積 、冷卻 的 ，靜置 ，溶液中會出現(xiàn) ，這就是粗提取的 DNA。用玻璃棒 攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。 取兩支 20ml 的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為 的 NaCl 溶液 5ml ，將絲狀物放 入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入 4ml 的 ?；旌暇鶆蚝?，將試管置于 中加熱 5min ，待試管冷卻后，比較兩支 試管溶液顏色的變化，看看溶解有

6、DNA 的溶液是否變 。 3．操作提示 以血液為實驗材料時，每 100ml 血液中需要加入 3g ，防止 。 加入洗滌劑后， 動作要 、 ，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫， 不利于后續(xù)步 驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要 ，以免 ，導(dǎo)致 DNA 分子不能形成絮狀沉淀。 二苯胺試劑要 ，否則會影響鑒定的效果。 4．結(jié)果分析與評價 [疑難點撥 ] 1． DNA 的溶解度與 NaCl 溶液濃度的關(guān)系： 當(dāng) NaCl 溶液濃度低于 0.14mol/L 時，隨濃度的升高， DNA 的溶解度降低；當(dāng) NaCl

7、溶液 濃度高于 0.14mol/L 時，隨濃度升高， DNA 的溶解度升高。 2． 制備雞血細(xì)胞液時，要在新鮮的雞血中加入檸檬酸鈉的原因 制備雞血細(xì)胞液時， 要在新鮮的雞血中加入抗凝劑——檸檬酸鈉， 防止血液凝固。 其 原理是檸檬酸鈉能與血漿中 Ca2+發(fā)生反應(yīng)， 生成檸檬酸鈣絡(luò)合物， 血漿中游離的 Ca2+大大減 少，血液便不會凝固，因為雞血紅細(xì)胞，白細(xì)胞都有細(xì)胞核， DNA 主要存在于細(xì)胞核中， 所以在離心或靜置沉淀后，要棄出上層清液——血漿。 3．提取 DNA 的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取 DNA 含量較高的生物材

8、料，否 則會由于實驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是 DNA 的釋放和溶解，這 一步是實驗成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的 DNA 全部溶解；第三步是 DNA 的純化， 即根據(jù) DNA 的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將 DNA 與雜質(zhì)分 開；最后一步是對 DNA 進(jìn)行鑒定，這是對整個實驗的結(jié)果的檢測。 4．在 DNA 的析出的步驟中用到玻璃棒攪拌時，注意動作要輕緩，以免加劇 DNA 分子的斷 裂，導(dǎo)致 DNA 分子不能形成絮狀沉淀。 5．盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的

9、DNA，容易被玻 璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi) DNA 的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到 的 DNA 就會更少。因此，實驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程 用心 愛心 專心 的 DNA 的損失。 [典例解析 ] 本實驗中有三次過濾： ⑴過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液 ⑵過濾含粘稠物的 0.14mol/LNaCl 溶液 ⑶過濾溶解有 DNA 的 2mol/LNaCl 溶液 以上三次過濾分別為了獲得（ ） A 含核物質(zhì)的濾

10、液、紗布上的粘稠物、含 DNA 的濾液 B 含核物質(zhì)的濾液、濾液中 DNA 粘稠物、含 DNA 的濾液 C 含核物質(zhì)的濾液、濾液中 DNA 粘稠物、紗布上的 DNA D 含較純的 DNA 濾液、紗布上的粘稠物、含 DNA 的濾液 答案： A 解析 :用蒸餾水稀釋雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜破裂，釋放出核物質(zhì)，此時過濾只能得到含 DNA 和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液，這種濾液必須經(jīng)過實驗中其他步驟得相繼處 理，方能得到較純的 DNA。DNA 在 0.13mol/LNaCl 溶液中溶解度最低，成絲狀粘稠物，可經(jīng)過濾留在紗布上。 【課本問題

11、答案和提示】 （一）旁欄思考題 1．為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？ 答：蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體， 水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)， 使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用， 就加速了雞血細(xì)胞的破裂 (細(xì)胞膜和核膜的破裂 )，從而釋放出 DNA。2．加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？ 答：洗滌劑是一些離子去污劑， 能溶解細(xì)胞膜， 有利于 DNA 的釋放；食鹽的主要成分是 NaCl， 有利于 DNA 的溶解。 3．如果研磨不充分，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？ 答：研磨不充分會使細(xì)胞核內(nèi)的 DNA 釋放不完全，提取的 DNA 量變少，影響實驗結(jié)果

12、，導(dǎo) 致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。 4．此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和 RNA 等雜質(zhì)。 5．為什么反復(fù)地溶解與析出 DNA，能夠去除雜質(zhì)？ 答：用高鹽濃度的溶液溶解 DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使 DNA 析 出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。 因此，通過反復(fù)溶解與析出 DNA，就能夠除去與 DNA 溶解度不同的多種雜質(zhì)。 6．方案二與方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的 DNA 與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的 是 D

13、NA 和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與 DNA 分離。 （二）練習(xí) 1．答：提取 DNA 的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取 DNA 含量較高的生物材料， 否則會由于實驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是 DNA 的釋放和溶解， 這一步是實驗成功與否的關(guān)鍵， 要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的 DNA 全部溶解； 第三步是 DNA 的純化， 用心 愛心 專心 即根據(jù) DNA 的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將 DNA 與雜質(zhì)分 開；最后一步是對 DNA 進(jìn)行鑒定，

14、這是對整個實驗的結(jié)果的檢測。 2．答：提取蛋白質(zhì)比提取 DNA 的難度大。這是因為，與 DNA 相比，蛋白質(zhì)對溫度、鹽濃 度、 pH 等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不 相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一的方法， 只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件， 設(shè)計特定的方法。 【知識拓展 】 1.二苯胺鑒定 DNA 的化學(xué)原理 DNA 中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成 ω-羥基 -γ 酮基戊醛， 它再和二苯胺作用而呈現(xiàn)藍(lán) 色(溶液呈淺藍(lán)色 )。鑒定時溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中 DNA 含量的多少有關(guān)。 2.研

15、磨液中幾種藥品的作用 Tris/HCl:提供緩沖體系， DNA 在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)（ Tris 為三羥甲基氨基甲烷） 。 EDTA（乙二胺四乙酸二鈉） ：是 DNA 酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后 DNA 酶降解 DNA。 SDS（十二烷基磺酸鈉） ：可以使蛋白質(zhì)變性，與 DNA 分離。 【教學(xué)反思】 用心 愛心 專心