《動(dòng)物細(xì)胞工程制藥課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《動(dòng)物細(xì)胞工程制藥課件（108頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),,完整版課件,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),,完整版課件,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,二級(jí),三級(jí),四級(jí),五級(jí),,完整版課件,*,動(dòng)物細(xì)胞工程制藥,張忠山,,生命科學(xué)學(xué)院,,1,完整版課件,動(dòng)物細(xì)胞工程制藥張忠山1完整版課件,一、概述,二、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn),三、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得,四、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基,五、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法和操作方式,六、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器及其檢測(cè)控制系統(tǒng),七、動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景和展望

2、,,2,完整版課件,一、概述2完整版課件,第一節(jié) 概述,（1）發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和細(xì)胞學(xué)說創(chuàng)立。1665年英國(guó)物理學(xué)家Hooke通過自制的顯微鏡觀察切成薄片的軟木時(shí)看到,死細(xì)胞的細(xì)胞壁,。,,（2）組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)。1885年德國(guó)生理鹽水培養(yǎng)雞胚組織，至1907年，細(xì)胞體外培養(yǎng)宣布進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代。,,,3,完整版課件,第一節(jié) 概述（1）發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和細(xì)胞學(xué)說創(chuàng)立。1665年英國(guó)物理,（3）細(xì)胞工程學(xué)時(shí)代。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行人工改造及培養(yǎng)以使其為人類服務(wù)的時(shí)代，包括真核細(xì)胞的基因重組、導(dǎo)入、擴(kuò)增和表達(dá)的理論和技術(shù)，細(xì)胞融合的理論和技術(shù)，細(xì)胞器特別是細(xì)胞核移植的理論和技術(shù)，染色體改造的理論和技術(shù)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物的理論

3、和技術(shù)，細(xì)胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)，以及產(chǎn)物分離純化的理論和技術(shù)。,（4）細(xì)胞工程制藥成為現(xiàn)代制藥技術(shù)中常用的手段,。,,4,完整版課件,（3）細(xì)胞工程學(xué)時(shí)代。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行人工改造及培養(yǎng)以使其為人類服,應(yīng)用領(lǐng)域,生產(chǎn)藥品,：作為宿主細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)原核細(xì)胞所不能生產(chǎn)的藥用蛋白。,基礎(chǔ)研究的細(xì)胞材料,：細(xì)胞模型,種子細(xì)胞：,為組織修復(fù)與器官再生提供種子細(xì)胞。,,,5,完整版課件,應(yīng)用領(lǐng)域生產(chǎn)藥品：作為宿主細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)原核細(xì)胞所不能生產(chǎn)的藥,第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和特點(diǎn),一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài),,二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn),,6,完整版課件,第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和特點(diǎn)一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)6完整版課件,,一、動(dòng)

4、物細(xì)胞的形態(tài),細(xì)胞的分化（或特化）,形態(tài)分化在離體培養(yǎng)同樣也存在。,離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩類：,貼壁依賴型（anchorage-dependent）和,非貼壁依賴型（anchorage-independent），前者可簡(jiǎn)稱為貼壁細(xì)胞，后者可簡(jiǎn)稱為懸浮細(xì)胞。,,7,完整版課件,一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)細(xì)胞的分化（或特化）7完整版,動(dòng)物細(xì)胞,結(jié)構(gòu)圖,,8,完整版課件,動(dòng)物細(xì)胞8完整版課件,1、貼壁細(xì)胞,,,特點(diǎn)：支持物,兩種形態(tài)，即,成纖維樣,細(xì)胞型或,上皮樣,細(xì)胞型。前者主要來(lái)源于中胚層組織的細(xì)胞，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、旋渦狀或火焰狀走行；后者主要來(lái)源于外胚層和內(nèi)胚層組織的細(xì)胞，生長(zhǎng)時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞片

5、。,,9,完整版課件,1、貼壁細(xì)胞9完整版課件,,,10,完整版課件,10完整版課件,,,11,完整版課件,11完整版課件,2、懸浮細(xì)胞,,這類細(xì)胞的生長(zhǎng),不依賴支持物,表面，可在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，如血液的淋巴細(xì)胞和用以生產(chǎn)干擾素的Namalwa細(xì)胞等，細(xì)胞呈圓形。,,,,12,完整版課件,2、懸浮細(xì)胞12完整版課件,,3、兼性貼壁細(xì)胞,,兼具上述兩種生長(zhǎng)方式的細(xì)胞，稱為兼性貼壁細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞。當(dāng)它們貼附在支持物表面上生長(zhǎng)時(shí)呈上皮或成纖維細(xì)胞的形態(tài)，而當(dāng)懸浮于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)則呈圓形，但有時(shí)它們可相互支持貼附在一起生長(zhǎng)。,,,13,完整版課件,3、兼性貼壁細(xì)胞13完整

6、版課件,二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn),1、細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng),一般為12~48h，細(xì)胞分裂周期=間期（G,1,期+S期+G,2,期）+分裂期（M期）,,G,1,期：凡細(xì)胞無(wú)增殖活動(dòng)時(shí)皆滯留在G,1,期,S,,期：DNA的合成，一般為6~8小時(shí),,14,完整版課件,二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)1、細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)14完整,,G,2,期：DNA量加倍，RNA合成和染色體螺旋化，持續(xù)時(shí)間短，一般為2~5h。,M期：一般持續(xù)時(shí)間很短，僅0.5~1h。相當(dāng)于有絲分裂的中后期和末期，主要是染色體的變化、分裂，并形成子細(xì)胞。,細(xì)胞分裂代數(shù)與培養(yǎng)中的代數(shù)及相互關(guān)系。,,,15,完整版課件,G2期：DNA量加倍，RNA合成和

7、染色體螺旋化，持續(xù)時(shí)間短，,,,16,完整版課件,16完整版課件,2、細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象,,大多數(shù)正常二倍體（dipoid）細(xì)胞的生長(zhǎng)都需要一定的基質(zhì)（如玻璃，塑料等）上貼附，伸展后才能生長(zhǎng)增殖，其機(jī)制可能與電荷、鈣鎂離子的作用以及許多貼附因子有關(guān)。,,17,完整版課件,2、細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象17完整版課件,,當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，細(xì)胞與其周圍細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞才停止增殖。保持一定的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加，該現(xiàn)象就稱為,接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象,。一旦細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn)象消失，細(xì)胞可多層生長(zhǎng)，細(xì)胞密度可

8、大大增加。,,,18,完整版課件,當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，細(xì)胞與其周圍細(xì)胞相互,,,19,完整版課件,19完整版課件,,,20,完整版課件,20完整版課件,3、正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的,當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)開始，稱之為,原代培養(yǎng),，經(jīng)過傳代后，即成為有限細(xì)胞系，即有限的生長(zhǎng)傳代時(shí)間，取決于細(xì)胞來(lái)源的種族和年齡，人胚成纖維細(xì)胞約可培養(yǎng)50代，雞胚的30代，小鼠的8代。但是若向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子，可使上皮細(xì)胞的壽命從原來(lái)的50代增加至150代。,當(dāng)細(xì)胞突變?yōu)?異倍體,后，該細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成無(wú)限細(xì)胞系，或稱連續(xù)細(xì)胞系。,,21,完整版課件,3、正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的21完整

9、版課件,,,22,完整版課件,22完整版課件,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一代生長(zhǎng)過程,,23,完整版課件,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一代生長(zhǎng)過程23完整版課件,,4、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境比較敏感,無(wú),細(xì)胞壁,保護(hù)，因而外界的物理化學(xué)因素很容易產(chǎn)生影響。,,5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的要求高,與細(xì)菌和植物細(xì)胞不同，其需要12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無(wú)機(jī)鹽和微量元素、作為主要碳原的葡萄糖以及多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和貼附因子，而且不同種類要求又有變化。,,24,完整版課件,4、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境比較敏感24完整版課件,6、動(dòng)物細(xì)胞蛋白合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同,場(chǎng)所：游離的核糖體以及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，前者合成的蛋白質(zhì)都用于細(xì)

10、胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)，后者上合成的蛋白質(zhì)是分泌性的和膜中的整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。,蛋白質(zhì)上的糖鏈有的在,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),上加接，有的在,高爾基體,中加接。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加接的是N-鏈寡糖，在高爾基體內(nèi)加接的是O-鏈寡糖。,,25,完整版課件,6、動(dòng)物細(xì)胞蛋白合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同25完整版課件,動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點(diǎn),,缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。,優(yōu)點(diǎn)：分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。,,26,完整版課件,動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點(diǎn)26完整版課件,第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得,一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求,二、生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞的獲得,三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性,四、基因工程細(xì)

11、胞的構(gòu)建和篩選,五、細(xì)胞庫(kù)的篩選,,27,完整版課件,第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求2,傳代細(xì)胞的要求,正常原代細(xì)胞 二倍體細(xì)胞 無(wú)限制,,癌細(xì)胞生產(chǎn)藥物,需謹(jǐn)慎,！,,28,完整版課件,傳代細(xì)胞的要求正常原代細(xì)胞 二倍體細(xì)胞,,一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求,（1）原代正常組織分離的細(xì)胞,（2）二倍體細(xì)胞，即使是傳代細(xì)胞,（3）傳代細(xì)胞用于生產(chǎn),（4）按照FDA對(duì)細(xì)胞株的要求，控制最終產(chǎn)品中DNA殘留量。,,29,完整版課件,一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求（1）原代正常組織分離,,1、原代細(xì)胞：,是直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲

12、得的細(xì)胞懸液。一般1g組織約有10,9,個(gè)細(xì)胞。,,雞胚細(xì)胞、原代兔腎或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,費(fèi)錢費(fèi)勞力,,30,完整版課件,30完整版課件,,2、二倍體細(xì)胞系：,原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。,WI-38、MRC-5、2BS等,,,31,完整版課件,2、二倍體細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì),,3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：,失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，可以無(wú)限增殖。,,自發(fā)轉(zhuǎn)化、人為轉(zhuǎn)化,,Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。,各單位細(xì)胞庫(kù)保存,,32,完整版課件,3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，可以無(wú)限增殖。

13、32完整,4、融合細(xì)胞系,動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)----也稱動(dòng)物體細(xì)胞雜交技術(shù)，是指二個(gè)或者二個(gè)以上的動(dòng)物細(xì)胞在外力作用下，合并為一個(gè)多核細(xì)胞的過程。,,,,33,完整版課件,4、融合細(xì)胞系33完整版課件,促融因素,（1）病毒誘導(dǎo)融合,,（2）PEG誘導(dǎo)融合,,（3）電場(chǎng)誘導(dǎo)融合,,（4）其它誘導(dǎo)融合,,34,完整版課件,促融因素（1）病毒誘導(dǎo)融合34完整版課件,（1）病毒誘導(dǎo)融合,仙臺(tái)病毒、流感病毒、新城疫雞瘟病毒、皰疹病毒等,,當(dāng)二種不同的動(dòng)物細(xì)胞混合物中存在大量病毒時(shí)，病毒或其組分會(huì)在細(xì)胞間起粘連作用而使細(xì)胞聚集成團(tuán)，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生重排、進(jìn)而結(jié)合成一個(gè)整體。,,隨機(jī)的，無(wú)法

14、人為控制，同時(shí)融合率較低。,,35,完整版課件,（1）病毒誘導(dǎo)融合仙臺(tái)病毒、流感病毒、新城疫雞瘟病毒、皰疹病,（2）,PEG,誘導(dǎo)融合,當(dāng)二種不同的動(dòng)物細(xì)胞混合物中存在PEG時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞聚集作用。在除去PEG的過程中，即產(chǎn)生細(xì)胞融合現(xiàn)象。,,所用的PEG分子量在1000-6000之間，一般濃度為40-50%，在37,℃,下作用2-3分鐘，其促融效果最佳。,,PEG促融合的作用機(jī)理不清，其促融作用也具有隨機(jī)性，無(wú)法人為控制。,,36,完整版課件,（2）PEG誘導(dǎo)融合當(dāng)二種不同的動(dòng)物細(xì)胞混合物中存在PEG時(shí),（3）電場(chǎng)誘導(dǎo)融合,將二種細(xì)胞混合物經(jīng)過10-100V/cm的低強(qiáng)度非均勻交變電場(chǎng)作用

15、時(shí)，細(xì)胞之間就會(huì)發(fā)生緊密接觸，形成穩(wěn)定的串珠狀偶極子排列。在此基礎(chǔ)上再對(duì)細(xì)胞實(shí)施瞬間高強(qiáng)度電脈沖就會(huì)發(fā)生膜擊穿，不同細(xì)胞間通過膜脂質(zhì)分子重排就能實(shí)現(xiàn)融合，形成一個(gè)雙核或者多核的細(xì)胞。,,一般來(lái)說，擊穿電壓為0.5-10KV/cm，作用時(shí)間為30-50微秒。,,電場(chǎng)誘導(dǎo)融合不損傷細(xì)胞，具有可人為操作的控制的特性，,融合率較高,。,,37,完整版課件,（3）電場(chǎng)誘導(dǎo)融合將二種細(xì)胞混合物經(jīng)過10-100V/cm的,三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性,（1）WI-38：,1961年來(lái)源于女性高加索人正常胚肺組織的二倍體細(xì)胞系，核型2n=46。該細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’s b

16、asal medium）加小牛血清，pH控制在7.2，同工酶為G6PD B型。細(xì)胞的倍增時(shí)間為24h，有限壽命為50代，上世紀(jì)60年代被廣泛用于制備疫苗。,,38,完整版課件,三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性（1）WI-38：1961年來(lái)源,,（2）MRC-5：,特性和用途與WI-38相似，1966年來(lái)源于14周正常男性，對(duì)多種人的病毒敏感，用于疫苗的生產(chǎn)。,,,39,完整版課件,（2）MRC-5：特性和用途與WI-38相似，1966年來(lái)源,（3）CHO-K1：,1957年從中國(guó)地鼠卵巢中分離的一株上皮樣細(xì)胞。在培養(yǎng)時(shí)需加入脯氨酸。核型為2n=20~22。目前廣泛用于構(gòu)建工程細(xì)胞的是一株缺乏二氫葉

17、酸還原酶的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株CHO-dhfr,-,，它常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，加0.1 mol/L次黃嘌呤和0.01m mol/L胸苷，以及10%小牛血清。,,40,完整版課件,（3）CHO-K1：1957年從中國(guó)地鼠卵巢中分離的一株上皮,（4）BHK-21：,1961年從5只無(wú)性別的生長(zhǎng)1天的地鼠幼鼠的腎臟中分離的。現(xiàn)在廣泛采用的是1963年用單細(xì)胞分離的方法經(jīng)13次的克隆的細(xì)胞。成纖維細(xì)胞，2n=44。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加7%胎牛血清。過去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，現(xiàn)在已被用于構(gòu)建工程細(xì)胞。,,41,完整版課件,（4）BHK-21：1961年從

18、5只無(wú)性別的生長(zhǎng)1天的地鼠幼,（5）Vero：,1962年來(lái)源于正常的成年非洲綠猴腎。是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，2n=60，高倍體率為1.7%，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)。通常用的培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細(xì)胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被批準(zhǔn)用于人體。,,42,完整版課件,（5）Vero：1962年來(lái)源于正常的成年非洲綠猴腎。是貼壁,（6）Namalwa：,1972年來(lái)源于肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的病人體中，后在瑞典構(gòu)建的一株人的類淋巴母細(xì)胞，高細(xì)胞有2.8%的高倍體率，多數(shù)細(xì)胞有12~14條標(biāo)記染色體，單條X染色體，無(wú)Y染色體。通常用的培養(yǎng)基為RPMI 1

19、640，添加7%胎牛血清。用于大規(guī)模生產(chǎn),?-,干擾素。,,,43,完整版課件,（6）Namalwa：1972年來(lái)源于肯尼亞患有Burkit,（7）SP2/0-Ag14：,該細(xì)胞是1978年中通過融合的方法，從有抗羊紅細(xì)胞活性的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8融合的雜交瘤SP2/HL-Ag亞克隆中分離得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗體鏈，能耐受8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine）20,?g/ml，但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清。,,44,完整版課件,（7）SP2/0-Ag14：該細(xì)胞是1978年中通過融合的方,（8）

20、Sf-9：,1983年從親代IPLB-SF21 AE中克隆形成。親代細(xì)胞則在1977年從秋粘蟲（Spodoptera frugiperda)的蛹卵組織中分離獲得。它對(duì)苜宿尺蠖核型多角體病毒（Autographa california MNPV）和其他桿狀病毒（Baculovirus）高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及10%胎牛血清。目前已經(jīng)被廣泛用于高效表達(dá)外來(lái)蛋白制品。,,45,完整版課件,（8）Sf-9：1983年從親代IPLB-SF21 AE中克,四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選,原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系三者在生產(chǎn)中

21、都有使用，但在生產(chǎn)中采用更多的、更有前景的是融合細(xì)胞及采用基因工程手段構(gòu)建的各種工程細(xì)胞。當(dāng)前被用以構(gòu)建工程細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞有CHO-dhfr,-,、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0和Sf-9等細(xì)胞。,那么如何獲得動(dòng)物工程細(xì)胞呢？,,46,完整版課件,四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞,,1、真核細(xì)胞基因表達(dá) 載體的構(gòu)建,目前一般使用的載體有兩類：一是,病毒載體,，如牛痘病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒等。,牛痘病毒,已被廣泛地用來(lái)構(gòu)建成多價(jià)疫苗，腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體正被試用用于基因治療中，而桿狀病毒載體-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)已被成功地用于

22、300多種外源基因的高效表達(dá)。,,47,完整版課件,1、真核細(xì)胞基因表達(dá) 載體的,用,桿狀病毒,做載體有許多優(yōu)點(diǎn)：,（1）該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進(jìn)行重組。,（2）插入7~8kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成。,（3）,多角體蛋白,和病毒粒子的形成無(wú)直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子。,,48,完整版課件,用桿狀病毒做載體有許多優(yōu)點(diǎn)：48完整版課件,（4）多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20~30%。,（5）用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，容易以此為標(biāo)記物來(lái)挑選陽(yáng)性克隆。,（6）如果用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體直接

23、表達(dá)外源基因。,,,,49,完整版課件,（4）多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋,另一類是,質(zhì)粒載體,，而且常常是穿梭質(zhì)粒載體，即在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞兩者體內(nèi)都能擴(kuò)增。構(gòu)建此類載體一般含有如下基本成分： （1）允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的,質(zhì)粒序列,。多數(shù)含有質(zhì)粒pBR322或其衍生載體pAT153的序列，包括能使質(zhì)粒在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制的起始位點(diǎn)和抗生素標(biāo)記基因。,,50,完整版課件,另一類是質(zhì)粒載體，而且常常是穿梭質(zhì)粒載體，即在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物,（2）含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的,調(diào)控元件,，在5’端轉(zhuǎn)錄起動(dòng)需要有,啟動(dòng)子,，包括帽狀位點(diǎn)（RNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)）上游約30堿基處的TATA框和

24、上游70~90堿基處的CAAT框序列和增強(qiáng)子。當(dāng)前構(gòu)建載體的許多啟動(dòng)子序列都來(lái)自病毒。也有其它來(lái)源的啟動(dòng)子。此外，在基因3’端應(yīng)有,終止序列,、RNA 3’端的切割序列和poly A序列等。近來(lái)有人在載體里加入顯性活動(dòng)調(diào)控區(qū)（DCR）序列，以此來(lái)克服因載體整合在宿主基因組位點(diǎn)而產(chǎn)生的表達(dá)水平降低。,,51,完整版課件,（2）含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控元件，在5’端轉(zhuǎn)錄起動(dòng)需要有,（3）能用以篩選出外源基因已整合的,選擇標(biāo)記,。一般有兩類標(biāo)記：一類僅適合用于密切相關(guān)的突變細(xì)胞株，如采用標(biāo)記基因,hgprt,、,tk,和,aprt,等基因，它們僅適用于,hgprt,-,、,tk,--,和,aprt

25、,--,等基因缺失的細(xì)胞株。另一類是顯性作用基因，如neo基因，它能使氨基糖苷抗生素—新霉素磷酸化而失活，從而使原來(lái)對(duì)新霉素敏感的哺乳動(dòng)物細(xì)胞一旦獲得含該基因的載體后，就能在含該抗生素的培養(yǎng)基中存活。,,52,完整版課件,（3）能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。一般有兩類標(biāo)記：,,（4）有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。最常用的是編碼二氫葉酸還原酶的基因。該酶的擴(kuò)增可防止氨甲喋呤（MTX）對(duì)細(xì)胞的毒害作用。利用該原理，在構(gòu)建載體時(shí)可有意識(shí)地將它與目的基因重組在一起，當(dāng)在培養(yǎng)基內(nèi)增加MTX濃度時(shí)，就會(huì)促使,dhfr,基因的擴(kuò)增，同時(shí)也會(huì)使其毗鄰的目的基因隨之?dāng)U增，從而大大提高表達(dá)量。類似

26、的擴(kuò)增系統(tǒng)還有谷氨酰胺合成酶和腺苷脫氫酶等系統(tǒng)。,,,53,完整版課件,（4）有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。最常用的是編碼二,2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá) 工程細(xì)胞株的篩選,（1）DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞方法：,,融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法,,（2）篩選：,,篩選系統(tǒng)、克隆純化,,54,完整版課件,2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá),,五、細(xì)胞庫(kù)的建立,除原代細(xì)胞外，其它的細(xì)胞株、細(xì)胞系都需要建細(xì)胞庫(kù)加以保存。按照我國(guó)和美國(guó)FDA的規(guī)定，用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)：,原始細(xì)胞庫(kù),（master cell bank， MCB）和,生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù),（ma

27、nugacture’s working cell bank，MWCB）或稱工作細(xì)胞庫(kù)（working cell bank， WCB）。,,55,完整版課件,五、細(xì)胞庫(kù)的建立除原代細(xì)胞外，其它的細(xì)胞株、細(xì),儲(chǔ)存于MCB的細(xì)胞應(yīng)該是單一來(lái)源的均質(zhì)的細(xì)胞，對(duì)于二倍體細(xì)胞應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞。儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)具有該細(xì)胞詳細(xì)檔案，包括：,（1）該細(xì)胞系的歷史：,（2）該細(xì)胞的特性：,（3）對(duì)各種有害因子的檢查結(jié)果：,,56,完整版課件,儲(chǔ)存于MCB的細(xì)胞應(yīng)該是單一來(lái)源的均質(zhì)的細(xì)胞，對(duì)于二倍體細(xì)胞,儲(chǔ)存于MWCB的細(xì)胞應(yīng)該是從MCB來(lái)的，或從單一安瓿來(lái)，或從多個(gè)安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)

28、增到一定數(shù)量后，再分裝儲(chǔ)存形成的細(xì)胞庫(kù)。同樣該細(xì)胞庫(kù)也必須建立檔案，而且需要進(jìn)行無(wú)菌性和無(wú)細(xì)胞交叉污染的檢查。生產(chǎn)時(shí)需確定其最高使用的傳代數(shù)。,,57,完整版課件,儲(chǔ)存于MWCB的細(xì)胞應(yīng)該是從MCB來(lái)的，或從單一安瓿來(lái)，或從,第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基,為了使細(xì)胞培養(yǎng)在體外培養(yǎng)成功，需要一些基本條件：,（1）絕對(duì)無(wú)菌操作；,（2）足夠的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，排除有害物質(zhì)包括極其微量的離子摻入；,（3）適量氧氣供應(yīng)；,,58,完整版課件,第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基為了使細(xì)胞培養(yǎng)在體外培養(yǎng),,（4）隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物；,（5）有良好的適于生存外界環(huán)境，包括pH、滲透壓和離子濃

29、度等；,（6）及時(shí)分種，保持合適的細(xì)胞密度。,,,59,完整版課件,（4）隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物；59完整版課件,,一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件,,1、器材的清洗和消毒,器材的清洗：一般來(lái)說，需經(jīng),浸泡、刷洗、泡酸和沖洗,四個(gè)步驟，用過的器材最好盡快地浸泡在3%的磷酸三鈉溶液內(nèi)過夜，以除去蛋白質(zhì)和殘余細(xì)胞等污垢。,,,60,完整版課件,一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件60完整版課件,,器材的消毒滅菌：主要通過物理方法和化學(xué)方法來(lái)達(dá)到嚴(yán)格無(wú)菌的操作過程。書中表3-4是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的消毒劑、濃度和使用場(chǎng)合的列表。盡量避免使用抗生素，但在工業(yè)生產(chǎn)中還是經(jīng)常使用的。常用抗生素及其濃度見表3-5。,,61,

30、完整版課件,器材的消毒滅菌：主要通過物理方法和化學(xué)方法來(lái)達(dá)到嚴(yán)格無(wú)菌的操,2、水質(zhì),蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過濾等單獨(dú)使用或配合使用，制備純水，一般要求金屬離子含量很低，電阻值在18M,?以上。動(dòng)物細(xì)胞制藥用水，要求去熱源。,,62,完整版課件,2、水質(zhì)62完整版課件,3、pH,pH的高低對(duì)細(xì)胞各種酶的活性、細(xì)胞壁的通透性以及許多蛋白的功能都有重要的影響。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH為,7.2~7.4,，低于6.8或高于7.6時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起細(xì)胞退變甚至死亡。,,63,完整版課件,3、pH63完整版課件,4、滲透壓,在細(xì)胞培養(yǎng)的所有操作中，為了使與細(xì)胞接觸的所有液

31、體都保持有較合適的滲透壓和pH，一般都需要使用平衡鹽溶液（balanced salt solution, BSS），它由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成。表3-6列出了幾種常用平衡鹽溶液（BSS）組成。,,64,完整版課件,4、滲透壓64完整版課件,,5、溫度,,哺乳動(dòng)物 ：（37±0.5）℃,昆蟲：27 ℃,,6、空氣,,65,完整版課件,5、溫度65完整版課件,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成,細(xì)胞種系不同對(duì)培養(yǎng)基的要求亦有差異，主要有三類：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基。,1、天然培養(yǎng)基,：在細(xì)胞培養(yǎng)的早期階段使用的培養(yǎng)基，主要為來(lái)自天然的材料如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。

32、,,66,完整版課件,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成細(xì)胞種系不同對(duì)培養(yǎng)基的要求亦,,優(yōu)點(diǎn),：營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,缺點(diǎn),：成分復(fù)雜、來(lái)源有限、成本較高,,血清,（serum）：纖維蛋白已被除去(如通過血凝或去纖維蛋白法)的血漿。,,,67,完整版課件,優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高67完整版課件,,2、合成培養(yǎng)基：,優(yōu)點(diǎn)是成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常用的有BME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及ISOCOV、199和McCoy等。,,缺點(diǎn),：無(wú)法替代一些未知成分。,解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補(bǔ),,,68,完整版課件,2、合成培養(yǎng)基：優(yōu)點(diǎn)是成分明確，組分穩(wěn)

33、定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)。動(dòng),上述合成培養(yǎng)基中主要有：,氨基酸：12種必需+谷氨酰胺,維生素：脂溶性和水溶性,糖類：葡萄糖、谷氨酰胺,無(wú)機(jī)鹽：保持滲透壓,其它一些特定成分如核酸的前體腺苷、鳥苷等。,,69,完整版課件,上述合成培養(yǎng)基中主要有：69完整版課件,,為了給細(xì)胞培養(yǎng)以更大的方便，以便于其增殖或貼附生長(zhǎng)，長(zhǎng)向培養(yǎng)基中加入一定量的動(dòng)物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清,。,,70,完整版課件,為了給細(xì)胞培養(yǎng)以更大的方便，以便于其增殖或貼附生長(zhǎng)，長(zhǎng)向培養(yǎng),,血清的作用機(jī)制可能為：（1）提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需要的各種,生長(zhǎng)

34、因子和激素,；（2）提供有利于細(xì)胞貼壁所需要的,貼附因子和伸展因子,；（3）提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；（4）提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的脂肪酸和微量元素。,,,71,完整版課件,血清的作用機(jī)制可能為：（1）提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需要的各,3、無(wú)血清培養(yǎng)基,無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)如下：,①提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免，避免了由于血清批之間差異的影響；②減少了由血清帶來(lái)的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；③供應(yīng)充足、穩(wěn)定；,,72,完整版課件,3、無(wú)血清培養(yǎng)基72完整版課件,,④細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；⑤避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性；⑥減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾，便于實(shí)

35、驗(yàn)結(jié)果的分析。,,,,73,完整版課件,④細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；⑤避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性；,,目前已經(jīng)有市售無(wú)血清培養(yǎng)基（書中表5-8所示）。無(wú)血清培養(yǎng)基中都是在合成培養(yǎng)基內(nèi)加入不同種類的添加劑所構(gòu)成，大致有以下幾類：,,74,完整版課件,目前已經(jīng)有市售無(wú)血清培養(yǎng)基（書中表5-8所示）。無(wú)血清培養(yǎng)基,（1）激素和生長(zhǎng)因子：使用最多的是胰島素，促進(jìn)糖原和脂肪酸的合成，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有刺激作用。（2）結(jié)合蛋白：最經(jīng)常被補(bǔ)充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時(shí)可用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白。,,75,完整版課件,（1）激素和生長(zhǎng)因子：使用最多的是胰島素，促進(jìn)糖原和脂

36、肪酸的,（3）貼附和伸展因子：目前多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細(xì)胞，真正能用以培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子，除這些因子外，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細(xì)胞的受體結(jié)合。（4）其它有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。,,76,完整版課件,（3）貼附和伸展因子：目前多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細(xì)胞，,三、,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需儀器設(shè)備,實(shí)驗(yàn)室要求,（A）和緩沖間相連，緩沖間內(nèi)備消毒服裝和鞋，口罩等，入內(nèi)換上。,（B）室內(nèi)空氣不流通，有適當(dāng)?shù)墓饩€，清潔，干燥,。,（C）側(cè)部可設(shè)傳遞窗，用于物品傳遞。,（

37、D）有消毒用紫外線燈,,,77,完整版課件,三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室要求77完整版課件,,,78,完整版課件,78完整版課件,（1）培養(yǎng)器具,,培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)板,培養(yǎng)皿,,79,完整版課件,（1）培養(yǎng)器具培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板培養(yǎng)皿79完整版課件,,,（2）超凈工作臺(tái),超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。,,,100級(jí)超凈工作臺(tái)指標(biāo)：,（≥0.5цm≤3.5粒/L）,,80,完整版課件,（2）超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過,,,（3） CO,2,培養(yǎng)箱,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃ ，5％CO,2,。,二氧化碳的作

38、用：維持PH值。,,81,完整版課件,（3） CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃ ，,,（4）倒置顯微鏡,,82,完整版課件,（4）倒置顯微鏡82完整版課件,,,（5）純化水裝置,,83,完整版課件,（5）純化水裝置83完整版課件,四、進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料,1、,胚胎組織,------如10—20日齡的雞胚、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎、人工流產(chǎn)的胎兒。胚胎組織的細(xì)胞由于互相之間粘連作用較弱、易于消化和分散、并且其細(xì)胞生命力強(qiáng)，易于培養(yǎng)和增殖。,,,84,完整版課件,四、進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料1、胚胎組織------如10—2,,2、,成體組織,------如肝臟、脾臟、心臟、腎臟、白血球等等，由

39、于其細(xì)胞之間具有較強(qiáng)的粘合作用，培養(yǎng)難度較大。,,,85,完整版課件,2、成體組織------如肝臟、脾臟、心臟、腎臟、白血球等等,,3、,腫瘤組織,-----細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和繁殖，并且可以采用微生物培養(yǎng)方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。,,,,86,完整版課件,3、腫瘤組織-----細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和繁殖,第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念 :,從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)細(xì)胞,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖．,,87,完整版課件,第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念 :87完整,,,88,完整版課件,88完整版課件,,細(xì)胞

40、系的分離與培養(yǎng),胰蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，胚胎、肝、腎及傳代細(xì)胞,膠原酶：纖維、上皮、癌組織,鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶,動(dòng)物組織或器官,洗滌 粉碎,酶解消化,離心或過濾,接種培養(yǎng),培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,洗 滌,,,,,,,,89,完整版課件,細(xì)胞系的分離與培養(yǎng)胰,細(xì)胞計(jì)數(shù),1、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),,2、血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),,3、結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù),,4、,MTT,染色計(jì)數(shù),,,90,完整版課件,細(xì)胞計(jì)數(shù)1、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)90完整版課件,,,ADAM-MC全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,,,91,完整版課件,ADAM-MC全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 91,,,,92,完整版課件,92完整版課件,細(xì)胞傳代,1、懸浮

41、細(xì)胞傳代,,2、貼壁細(xì)胞傳代：消化液消化,,93,完整版課件,細(xì)胞傳代1、懸浮細(xì)胞傳代93完整版課件,細(xì)胞凍存與復(fù)蘇,1、凍存,溫度：液氮（-196℃）,速度：1 ℃/min,,2、復(fù)蘇,,94,完整版課件,細(xì)胞凍存與復(fù)蘇1、凍存94完整版課件,屠呦呦與拉斯克獎(jiǎng),2011年9月24日，拉斯克基金會(huì)將臨床醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)授予81歲的中國(guó)中醫(yī)研究院研究員屠呦呦，以表彰其在,治療瘧疾的青蒿素研究,中的貢獻(xiàn)。,,這是“拉斯克獎(jiǎng)”設(shè)立65年來(lái),首次,頒予,中國(guó)科學(xué)家,，也是中國(guó)生物醫(yī)學(xué)界迄今獲得的世界級(jí)最高大獎(jiǎng)。,,95,完整版課件,屠呦呦與拉斯克獎(jiǎng)2011年9月24日，拉斯克基金會(huì)將臨床醫(yī)學(xué),,,,96,完

42、整版課件,96完整版課件,,,,97,完整版課件,97完整版課件,研究背景,瘧疾,（Malaria）經(jīng)按蚊叮咬而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病。,19世紀(jì)，從金雞納樹皮中分離出抗瘧成分,奎寧,。隨后，科學(xué)家人工合成了奎寧，又找到了奎寧替代物—,氯喹,。氯喹藥物一度是抗擊瘧疾的特效藥。,二戰(zhàn)后，瘧原蟲產(chǎn)生了,抗藥性,。20世紀(jì)60年代初，瘧疾再次肆瘧，疫情難以控制?？茖W(xué)家開始,尋找新藥,。,,98,完整版課件,研究背景瘧疾（Malaria）經(jīng)按蚊叮咬而感染瘧原蟲所引起的,美國(guó)投入,巨額資金,，篩選出,20多萬(wàn),種化合物，但沒有找到理想的藥物。,,國(guó)內(nèi)多個(gè)省份的科研人員已經(jīng)篩選了,4萬(wàn)多種,抗瘧疾的

43、化合物和中草藥，沒有令人滿意的結(jié)果。,,99,完整版課件,美國(guó)投入巨額資金，篩選出20多萬(wàn)種化合物，但沒有找到理想的藥,青蒿素研發(fā)時(shí)間表,1967年 中國(guó)啟動(dòng)研發(fā)抗瘧新藥的大項(xiàng)目—“,523項(xiàng)目,”，500名科研人員組成研發(fā)大軍。,1969年 39歲的屠呦呦以,中醫(yī)研究院科研組長(zhǎng),的身份加入“523項(xiàng)目”。,1971年 經(jīng)過反復(fù)篩選、試驗(yàn)，屠呦呦領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將目光鎖定,青蒿,（一種菊科草本植物）。經(jīng)過,190,多次失敗后，用,乙醚,制取的191號(hào)樣品獲得成功。,,100,完整版課件,青蒿素研發(fā)時(shí)間表1967年 中國(guó)啟動(dòng)研發(fā)抗瘧新藥的大項(xiàng)目—“,1972年 屠呦呦在南京召開的“523項(xiàng)目”工作

44、會(huì)議上報(bào)告了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,1973年 北京中藥研究所拿到青蒿素的,結(jié)晶,。青蒿結(jié)晶的抗瘧功效在其他地區(qū)得到證實(shí)?！?23項(xiàng)目”辦公室將青蒿結(jié)晶物命名為,青蒿素,，作為新藥進(jìn)行研發(fā)。,2004年 世衛(wèi)組織正式將青蒿素復(fù)方藥物列為,治療瘧疾的首選藥物,，從此青蒿素作為“中國(guó)神藥”在世界各地顯示奇效。統(tǒng)計(jì)顯示，青蒿素復(fù)方藥物對(duì)惡性瘧疾的治愈率達(dá)到,97％,。,,101,完整版課件,1972年 屠呦呦在南京召開的“523項(xiàng)目”工作會(huì)議上報(bào)告了,搜集600多種草藥方,,從系統(tǒng)整理歷代醫(yī)籍入手，她查閱經(jīng)典醫(yī)書、地方藥志，四處走訪老中醫(yī)，做了,2000,多張資料卡片，最后整理了一個(gè),600,多種包括青蒿在內(nèi)的

45、草藥《抗瘧單驗(yàn)方集》，供研究者進(jìn)一步發(fā)掘。,李時(shí)珍的《,本草綱目,》說青蒿能“治瘧疾寒熱”。,,,102,完整版課件,搜集600多種草藥方 從系統(tǒng)整理歷代醫(yī)籍入手，她查閱經(jīng)典醫(yī)書,靈感,在眾多中草藥中，研究小組發(fā)現(xiàn)青蒿對(duì)瘧疾的抑制率相對(duì)較高，能達(dá)到,68%,。然而，之后的重復(fù)試驗(yàn)中，青蒿的抑制率反而,降低,了。,東晉《,肘后備急方,》中的幾句話引起了她的注意：,“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之。”,,103,完整版課件,靈感在眾多中草藥中，研究小組發(fā)現(xiàn)青蒿對(duì)瘧疾的抑制率相對(duì)較高，,,絞汁,使用的辦法，和中藥常用的,煎熬法,不同。這是不是為了避免青蒿的有效成分在高溫下被破壞？屠呦呦受到啟發(fā)

46、，想到用,沸點(diǎn)較低的乙醚,制取青蒿提取物。,,經(jīng)過190多次失敗后，終于，用乙醚制取的191號(hào)樣品，對(duì)鼠瘧猴瘧的抑制率達(dá)到了,100%,。,,104,完整版課件,絞汁使用的辦法，和中藥常用的煎熬法不同。這是不是為了避免青蒿,青蒿與青蒿素,,,105,完整版課件,青蒿與青蒿素 105完整版課件,題外話,拉斯克獎(jiǎng)在醫(yī)學(xué)界又被稱作,“諾貝爾獎(jiǎng)風(fēng)向標(biāo)”。,,統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，,48%,的拉斯克,基礎(chǔ),醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)獲得者隨后獲得諾貝爾獎(jiǎng)，,28%,的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)和臨床醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)獲得者已經(jīng)成為諾貝爾獎(jiǎng)得主。,,106,完整版課件,題外話拉斯克獎(jiǎng)在醫(yī)學(xué)界又被稱作“諾貝爾獎(jiǎng)風(fēng)向標(biāo)”。 106完,相關(guān)問題,1、查閱資料講講青蒿還有哪些藥理作用。,2、青蒿素具有什么毒理作用？,3、如何避免青蒿素不產(chǎn)生抗藥性？,,107,完整版課件,相關(guān)問題1、查閱資料講講青蒿還有哪些藥理作用。107完整版課,感謝親觀看此幻燈片，此課件部分內(nèi)容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，,如有侵權(quán)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系我們刪除，謝謝配合！,感謝親觀看此幻燈片，此課件部分內(nèi)容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，,