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1、,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,第九節(jié),基因工程在發(fā)酵工程中的應(yīng)用,以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)發(fā)展藥物的方法,獲得新型結(jié)構(gòu)和生物活,性的抗生素變得越來越難,一.自然分離,合成步驟繁多、合成產(chǎn)率低下,二.化學(xué)合成,以微生物作為“細(xì)胞工廠”，通過對代謝途徑的遺傳控制，生物合成所需要的新型藥物。,基因工程改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)體現(xiàn)在四個方面,1、抗生素生產(chǎn)：分離抗生素合成酶基因，提高產(chǎn)量、得到雜合抗生素；,2、氨基酸生產(chǎn)：基因克隆的工程菌、細(xì)胞融合育種；,3、維生素生產(chǎn)：

2、構(gòu)建制造維生素C的基因工程菌；,4、疫苗生產(chǎn)：把抗原克隆到,E.coli,中大量生產(chǎn)疫苗。,直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株。,菌種選育,突變、體內(nèi)重組、,體外重組（基因工程）,一,、基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用,往往低產(chǎn)甚至不產(chǎn)所需的產(chǎn)物，只有經(jīng)過進(jìn)一步的人工改造才能真正用于工業(yè)生產(chǎn),微生物基因工程育種,這是一種自覺的、能像工程一樣事先設(shè)計和控制的育種技術(shù)，可以完成超遠(yuǎn)緣雜交，是最新最有前途的育種方法。,獲得特定的目標(biāo)基因,載體(質(zhì)?；虿《?,目標(biāo)基因片段,質(zhì)粒DNA片段,內(nèi)切酶切割,細(xì)胞外重組,重組DNA,重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞并擴(kuò)增、表達(dá),具有目標(biāo)基因表達(dá)功能的重組體,利用遺傳標(biāo)記

3、篩選,轉(zhuǎn)化(質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染(病毒),（一）,抗生素生物合成基因的特點(diǎn)及其克隆的策略和方法,1、抗生素生物合成基因群成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),在已知的微生物所產(chǎn)生的抗生素中，約23由放線菌產(chǎn)生，而其中的80來源于鏈霉菌；鏈霉菌屬中的鏈霉菌，有約500個種。,2002年5月，Bentley S.D.等在英國 Nature 報道了鏈霉菌的模式種,天藍(lán)色鏈霉菌(,Streptomyces coelicolor,)A3(2)菌株,的基因組全序列研究結(jié)果：基因組全序 8,667,507 bp，GC含量72.12%，7825個基因，55個假基因，基因平均長度991 bp，編碼密度88.9%。,鏈霉菌抗生素生物合成

4、基因群成員的DNA組成,GC含量高達(dá)70以上；,三聯(lián)體密碼子中的第三個堿基的GC比例極高。,抗生素生物合成基因,成簇存在,：,參與每種抗生素生物合成的基因約1030個;,阿克拉霉素,每一種抗生素生物合成相關(guān)基因在染色體組中前后排列成基因簇(gene cluster)，包括抗生素的生物合成基因、耐藥基因、轉(zhuǎn)運(yùn)基因和調(diào)節(jié)基因，而耐藥、轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)節(jié)基因三者大多與抗生素生物合成基因緊密連鎖,并存在一種協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)制,。,抗性基因還參與了抗生素的生物合成與調(diào)控，以確保抗生素耐藥性的及時表達(dá)，從而免受自身抗生素的傷害。研究還發(fā)現(xiàn)，,產(chǎn)抗菌株的抗性水平與該菌株自身的抗菌素產(chǎn)量水平呈正相關(guān),。,阿克拉霉素Acla

5、cinomycin,目前用于治療急性白血病(Leukemia)與淋巴瘤(Lymphomas)有良好療效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由,Streptomyces galilaeus,合成的聚酮類化合物，其合成酶的生物合成涉及13個基因，緊密成簇排列。,返回,少數(shù)抗生素的生物合成基因簇存在于游離狀態(tài)的質(zhì)粒上,如天藍(lán)色鏈霉菌 3(2)菌株中的次甲霉素A（Methylenomycin A）的生物合成基因位于SCP1質(zhì)粒上。,抗生素生物合成基因群成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),鏈霉菌抗生素生物合成基因群成員的DNA組成：GC含量高達(dá)70以上、三聯(lián)體密碼子中的第三個堿基的GC比例極高；,抗生素生物合成

6、基因成簇存在：參與每種抗生素生物合成的基因約1030個；,少數(shù)抗生素的生物合成基因簇存在于游離狀態(tài)的質(zhì)粒上。,7個利用質(zhì)粒和噬菌體載體來克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用這些策略已經(jīng)克隆了不同類型抗生素的生物合成基因。這7個方法是：,在標(biāo)準(zhǔn)宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物,阻斷變株法,突變克隆法,直接克隆法,克隆抗生素抗性基因法,寡核苷酸探針法,同源基因雜交法,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,在標(biāo)準(zhǔn)宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物,“鳥槍法”克隆基因：能夠檢測到單酶基因的產(chǎn)物。,對氨基苯甲酸合成酶,(PABA),基因,(,pab,)是,灰色鏈霉菌,的,殺念珠菌素生物合成酶基因簇,的一個成員；

7、,以,pab,(野生型)灰色鏈霉菌菌株為供體，提取總DNA、,Bam,H,切割、與質(zhì)粒 pIJ41重組、轉(zhuǎn)化,pab,(PABA營養(yǎng)缺陷型)菌株，選擇,pab,(PABA營養(yǎng)原養(yǎng)型)菌株；,過量表達(dá)PABA的灰色鏈霉菌具有磺胺抗性，以其為供體、鳥槍法轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌66，在轉(zhuǎn)化子中篩選PABA原養(yǎng)型或磺胺抗性菌株；,二者篩選出來的陽性轉(zhuǎn)化子都攜帶一個45 kb的,Bam,H,片段，意味著,pab,基因與磺胺抗性基因可能是同一個基因。,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。,鳥槍法

8、適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,阻斷變株法,檢測一系列有關(guān)某種抗生素生物合成的阻斷變異株之間的遺傳互補(bǔ)關(guān)系，確定被克隆的DNA片段的性質(zhì)。,放線紫紅素,(actinorhodin),是由天藍(lán)鏈霉菌合成的多酮肽抗菌素,大約通過16個步驟合成；,對76個阻斷突變體(,act,-,)進(jìn)行互補(bǔ)測驗(yàn)研究，Rudd和Hopwood將它們分成7個組，每組代表在不同的生物合成步驟發(fā)生損傷。,Act,和,act,不能與其它突變株互補(bǔ)，說明這兩個突變發(fā)生在放線紫紅素生物合成的最早期的步驟中；,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,阻斷變株法,檢測一系列有關(guān)某種抗生素生

9、物合成的阻斷變異株之間的遺傳互補(bǔ)關(guān)系，確定被克隆的DNA片段的性質(zhì)。,用pIJ922質(zhì)粒從,act,+,菌株中克隆了一個,Bam,H25 bp片段，可以與除,act,外的其它阻斷株互補(bǔ)；,用基因克隆的方法，將act,+,菌株中相當(dāng)大的DNA片段(1530 kb)克隆到載體pJJ922上，組建成重組質(zhì)粒pJJ2303，它能互補(bǔ)所有7組,act,-,突變株，并能使不產(chǎn)生任何一類多酮肽抗菌素的小小鏈霉菌合成放線紫紅素。這個片段顯然是放線紫紅素生物合成全部基因組成的基因簇。,放線紫紅素阻斷突變株之間的互補(bǔ)測驗(yàn),前體,中間產(chǎn)物2,中間產(chǎn)物14,中間產(chǎn)物15,中間產(chǎn)物1,放線紫紅素,act,act,act

10、,act,act,act,無中間產(chǎn)物 2,act,act,act,act,act,act,無15,無紫紅素,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,突變克隆法,如果生物合成基因簇DNA的酶切片段通過同源重組插入誘發(fā)基因簇相關(guān)合成步驟的阻斷突變，這個酶切片段一定含有這個合成步驟的相關(guān)基因。,小小鏈霉菌,(,S.parvullus,),菌株,ATCC12434,的質(zhì)粒,SCP1,(含次甲霉素A生物合成基因簇)的,DNA,的,Pst,片段插入到,C31KC400(,attP,),中，形成質(zhì)粒,SCP1,的,gDNA,文庫；,轉(zhuǎn)染變青鏈霉菌66(,S.lividans,)，把噬菌斑影印到變青鏈霉菌(S

11、CP1,+,)的菌膜上，用,C31KC400的,紫霉素抗性選擇溶源菌；,從溶源菌中選擇次甲霉素生物合成阻斷突變株，分析表明這些阻斷突變株都含有來自,C31KC400的,Pst,DNA片段;,突變分析結(jié)果：SCP1上至少有17 kb DNA參與次甲霉素生物合成，其中兩個轉(zhuǎn)錄單位分別至少有兩個次甲霉素生物合成基因簇成員；,【,突變克隆法原理圖解,】,1 2 3 4 5 6,1 2 3 4 5 6,片段克隆到噬菌體或整合性質(zhì)粒中，以同源性重組方式插入相應(yīng)的基因中。,2,2,5,5,無阻斷?,阻斷,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,直接克隆法,抗生素生物合成基因成簇存在，總長度30 kb，成套克

12、隆基因簇是可能的。,頭霉素C,(Cephamycin C)是牲畜鏈霉菌表達(dá)的,-內(nèi)酰胺類,抗生素；,Panlabs公司,將牲畜鏈霉菌總DNA的2040 kb的,Bgl,部分消化片段克隆到質(zhì)粒 pIJ943中，轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌1326；,以不產(chǎn)黑色素、有硫鏈絲菌素(Thiostrepton)抗性(,ts,r,為pIJ943的選擇標(biāo)記)確定轉(zhuǎn)化子；,直接克隆法,抗生素生物合成基因成簇存在，總長度30 kb，成套克隆基因簇是可能的。,在固體培養(yǎng)基上用,Comamonas terrigena,(土生叢毛單胞菌)直接篩選抗菌活性(頭霉素C表達(dá))；,從30,000多個轉(zhuǎn)化子中得到一個有抗菌活性的轉(zhuǎn)化子PF1

13、5-1，多項(xiàng)分析表明：抗菌活性來自頭霉素C；,把PF15-1中的29.3 kb片段插入質(zhì)粒pIF900，轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌1326，轉(zhuǎn)化子同樣產(chǎn)生了頭霉素C：29.3 kb含有頭霉素C生物合成基因簇。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,抗生素抗性基因克隆法,抗性基因常常是抗生素生物合成基因簇的成員，可以做為一個標(biāo)記基因用于克隆基因簇。,抗生素抗性基因可能是抗生素合成基因簇的一部分。,在吸水鏈霉菌(,SHydroscopicus,)中，與雙丙氨磷(bialaphos)合成基因緊密連鎖的抗性基因,bar,所編碼的產(chǎn)物與bialaphos生物合成途徑第10步所需的乙酸基轉(zhuǎn)移酶相同，,bar,可能是

14、bialaphos生物合成途徑的一部分。,在非抗生素產(chǎn)生菌中，抗生素耐藥基因的表達(dá)主要是為了應(yīng)對環(huán)境的抗生素壓力，可以存在于質(zhì)粒上。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,抗生素抗性基因克隆法,抗性基因常常是抗生素生物合成基因簇的成員，可以做為一個標(biāo)記基因用于克隆基因簇。,紅霉素,是紅色糖多孢菌(,Saccharopolyspora erythraea,)產(chǎn)生的抗生素；,用,Mbo,處理紅色糖多孢菌NRRLC2338菌株DNA，與穿梭往復(fù)粘粒pKC462a重組，轉(zhuǎn)導(dǎo),E.coli,SF8；,以含有,ery,r,的質(zhì)粒pIJ43為探針，與轉(zhuǎn)導(dǎo)子原位雜交；,分析表明：陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)子的pKC462a中

15、攜帶35 kb的插入片段；,用這個片段轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌，轉(zhuǎn)化子產(chǎn)紅霉素。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,寡核苷酸探針法,鏈霉菌編碼抗生素生物合成基因ORF順序的密碼子的第3位堿基多達(dá)90為G或C，是探針設(shè)計的根據(jù)。,泰樂星(tylosin)是由弗氏鏈霉菌(,Streptomyces fradiae,)產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，臨床上主要作為治療雞慢性呼吸道感染和雞霍亂等常見病，對由病毒引起的豬氣喘和豬肺炎有特效。,Eli Lilly公司首先根據(jù)催化泰樂星生物合成的最后一個步驟的 大環(huán)菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Macrocin-0-methyltransferase)氨基端35個氨基酸順序

16、，按照密碼子偏愛原則合成了44 bp的寡核苷酸探針；,用,Charon4構(gòu)建弗氏鏈霉菌的gDNA文庫，與探針逐一雜交，10個重疊克隆共涉及27 kb DNA；,與用粘粒pKC462a構(gòu)建的,弗氏鏈霉菌的gDNA,文庫雜交，有4個重疊克隆共包含58 kb片段，其中包括前面的27 kb片段；,進(jìn)一步分析表明，58 kb DNA中編碼Tylosin生物合成全部基因。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,寡核苷酸探針法,鏈霉菌編碼抗生素生物合成基因ORF順序的密碼子的第3位堿基多達(dá)90為G或C，是探針設(shè)計的根據(jù),。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,同源基因雜交法,以已克隆的抗生素生物合成基因片段順序?yàn)樘结?，探察同源性基因?-內(nèi)酰胺類,：分子結(jié)構(gòu)中含有-內(nèi)酰胺，包括青霉素類和頭孢菌素類。,氨基糖甙類,：由氨基己糖的衍生物組成，包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、小諾霉素等。,四環(huán)類,：都具有四個縮合苯環(huán)，包括四環(huán)素、土霉素、金霉素及強(qiáng)力霉素等。,氯霉素類,：含二氯乙酰胺，包括氯霉素、甲砜霉素等。,大環(huán)內(nèi)脂類,：由一個或多個單糖組成并與碳鏈一起形成一個巨大的芳香內(nèi)酯環(huán)化合物，有紅