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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級(jí),,第三級(jí),,第四級(jí),,第五級(jí),,,,*,,,,生 物 制 藥 工 藝 學(xué),主 講 胡國(guó)勤,,,鄭 州 大 學(xué) 化 工 學(xué) 院,概 述,微生物菌種的,,選育與保藏,微生物的培養(yǎng),發(fā)酵過程的控制,第六章微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ),L-異亮氨酸生產(chǎn)工藝,維生素C生產(chǎn)工藝,思 考 題,,,微生物發(fā)酵制藥,概 述,發(fā)酵工程制藥的基本過程,,,抗生素的發(fā)現(xiàn),1928年，英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Fleming B發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)青霉素。在,,20世紀(jì)40年代，一共發(fā)現(xiàn)了14種抗生素，50年代發(fā)現(xiàn)了20余,,種，年代開始了化學(xué)結(jié)構(gòu)改造的合成和半合成抗生素

2、階段。目,,前發(fā)現(xiàn)并分離到約9000種抗生素，半合成抗生素約1000種，,,共萬種以上。但實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用的只有100余種。,微生物發(fā)酵制藥,,,發(fā)酵制藥種類,,微生物菌體發(fā)酵、微生物酶發(fā)酵、微生物代謝產(chǎn)物、發(fā)酵微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵,。,微生物發(fā)酵制藥,,,制藥微生物的種類,生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細(xì)菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），細(xì)菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacterium flarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。?? 放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多

3、。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類、四環(huán)類、放線菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類和多烯大環(huán)內(nèi)酯類。,,真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。,微生物發(fā)酵制藥,,,發(fā)酵制藥的基本過程,,發(fā)酵制藥就是利用制藥微生物，通過發(fā)酵培養(yǎng)，在一定條件下，生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)在代謝過程中產(chǎn)生藥物，然后，從發(fā)酵液中提取分離、純化精制，獲得藥品。菌株選育（mutation and selection breeding）、發(fā)酵(fermentation)和提煉(isolation and purification)是發(fā)酵制藥的三個(gè)主要工段。,工藝過程包括發(fā)酵和分離純化兩個(gè)階段。,,發(fā)酵階段,包括

4、生產(chǎn)菌、孢子制備、種子制備、發(fā)酵培養(yǎng)，是生物加工工程過程。,分離純化階段,包括發(fā)酵液處理與過濾、分離提取、精制、成品檢驗(yàn)、包裝、出廠檢驗(yàn)，是化學(xué)分離工程過程。 成品檢驗(yàn)：包括性狀及鑒別試驗(yàn)、安全試驗(yàn)、降壓試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)、無菌試驗(yàn)、酸堿度試驗(yàn)、效價(jià)測(cè)定、水分測(cè)定等。?? 成品包裝：合格成品進(jìn)行包裝，為原料藥。制劑由制劑車間或廠再分裝。,微生物發(fā)酵制藥,,,新藥生產(chǎn)菌的選育,自然分離,:,,樣品的采集與處理,,分離方法有稀釋法和濾膜法,,活性測(cè)定,,非致病菌為對(duì)象，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定活性，篩選生物活性物質(zhì)。可以使用耐藥和超敏菌種。用HPLC、LC－MS等，分析鑒定活性物質(zhì)。其他現(xiàn)代

5、的篩選技術(shù)如靶向篩選、高通量篩選、高內(nèi)涵篩選等可以結(jié)合使用。,微生物菌種的選育與保藏,,,新藥生產(chǎn)菌的選育,自然選育,:在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)突,,變而進(jìn)行菌種篩選的過程，叫自然選育或自然分離。,,,基本過程如下：,菌種→單孢子或單細(xì)胞懸液→適當(dāng)稀釋→瓊脂平板分離→挑單個(gè)菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定→選出優(yōu)良菌株。 自然選育簡(jiǎn)單易行，可達(dá)到純化菌種、防止退化、穩(wěn)定生產(chǎn)水平和提高產(chǎn)量的目的。但效率低，增產(chǎn)幅度不會(huì)很大 。,微生物菌種的選育與保藏,,,新藥生產(chǎn)菌的選育,誘變育種,:誘變育種是人為創(chuàng)造條件，使菌種發(fā)生變異，從中篩選優(yōu)良個(gè),,體，淘汰劣質(zhì)個(gè)體，是當(dāng)前菌種選

6、育的一種主要方法。其特點(diǎn)是速度快、收效大、方法相對(duì)簡(jiǎn)單。但缺乏定向性，要配合大規(guī)模的篩選工作。,,,誘發(fā)突變的因素有物理、化學(xué)和生物三類。,,,誘變育種方案的設(shè)計(jì),誘變育種整個(gè)過程涉及誘變和篩選兩個(gè)階段，甚至是不斷多輪重復(fù)。,微生物菌種的選育與保藏,,,新藥生產(chǎn)菌的選育,雜交育種 :,是兩個(gè)不同基因型的菌株通過接合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再?gòu)闹蟹蛛x和篩選具有新性狀的菌株。帶有定向育種的性質(zhì)。 接合、原生質(zhì)體融合兩種方法 。,,基因工程技術(shù)育種,：采用基因工程技術(shù)即基因克隆與表達(dá)技術(shù)，過量表達(dá)或抑制表達(dá)某一個(gè)或一組基因，調(diào)控代謝過程，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效表達(dá)。,微生物菌種的選育與保藏,,

7、,新藥生產(chǎn)菌的保藏,,目的：,保持長(zhǎng)期存活、不退化、不喪失生產(chǎn)能力。,保存原理：,使其代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)，可保持原有特性，延長(zhǎng)生命時(shí)限。,,保存方法：,斜面低溫保存、液體石蠟密封保藏、砂土管保藏、冷凍干燥保藏、液氮低溫保藏。,微生物菌種的選育與保藏,,,新藥生產(chǎn)菌的保藏,保存機(jī)構(gòu)：,中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)）,,中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心、,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC,北京),、抗生素菌種保藏管理中心、中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心。,,美國(guó)典型菌種保藏中心 （American Type Culture Coll

8、ection）,,,日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中心 (NITE Biological Resource Center),,英國(guó)國(guó)家菌種保藏中心 (The United Kingdom National Culture Collection ),微生物菌種的選育與保藏,,,微生物生長(zhǎng)的六大營(yíng)養(yǎng)要素,碳源,凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均稱為碳源。 包括糖類、醇類、脂肪、有機(jī)酸等。,微生物的培養(yǎng),氮源,凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均稱為氮源?？煞譃橛袡C(jī)氮源和無機(jī)氮源兩類。,生長(zhǎng)因子,指微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物，包括氨基酸、維生,,素、核苷酸、脂肪酸等。,無機(jī)鹽和

9、,,微量元素,生理活性物質(zhì)的組成成分或具有生理調(diào)節(jié)作用，磷、硫、鐵、,,鎂、鈣、錳、銅、鋅、鈷、鉀、鈉、氯。一般低濃度起促進(jìn)作,,用，高濃度起抑制作用。,水和能源,,,微生物培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（medium）是人工配制的供微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)生各種代謝產(chǎn),,物所需要的多種營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。,微生物的培養(yǎng),種類：,按其組成的來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基；,,按其狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；,,按其用途可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。,,影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素：,原料質(zhì)量、水質(zhì)、滅菌的影響,,以及培養(yǎng)基的黏度。,,,微生物培養(yǎng)基,——,發(fā)酵培養(yǎng)基,,配制一般原則（1）生物學(xué)原則：

10、根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)和反應(yīng)需求，設(shè)計(jì)培養(yǎng)基。各種成分之間比例恰當(dāng)，特別是有機(jī)氮和無機(jī)氮源，C/N比。一定條件下，各種原材料之間不能產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。具有適宜的pH和滲透壓。（2）工藝原則：不影響通氣和攪拌，又不影響產(chǎn)物的分離精制和廢物處理，過程容易控制。（3）低成本原則：原材料要因地制宜，來源方便，豐富，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，成本低。（4）高效經(jīng)濟(jì)原則：生產(chǎn)安全，環(huán)境保護(hù)，高質(zhì)量，最高得率，最小副產(chǎn)物。,微生物的培養(yǎng),,,微生物培養(yǎng)基,——,發(fā)酵培養(yǎng)基,設(shè)計(jì)基本思路（1）根據(jù)他人的經(jīng)驗(yàn)和成分，初步確定培養(yǎng)基的成分，作為研究的起始培養(yǎng)基。（2）單因素實(shí)驗(yàn)，確定最適宜的培養(yǎng)基成分。（3）多因

11、素實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行各成分之間濃度優(yōu)化和最佳配比。如均勻設(shè)計(jì)、正交實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。（4）從搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。（5）綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個(gè)適宜的生產(chǎn)配方。,微生物的培養(yǎng),,,基本概念,雜菌（contaminated microbe）：,對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)過程，除生產(chǎn)菌以外的,,任何生物微生物。,滅菌工藝,污染（contamination）：,感染雜菌的發(fā)酵體系。,消毒(disinfection)：,指用物理或化學(xué)方法殺滅或清除病原微生物（pathogen），達(dá)到無害化程度的過程，只能殺死營(yíng)養(yǎng)體，而不能殺滅芽孢體，殺滅率99.9%以上。,殺菌

12、：,殺滅或清除病所有微生物的過程，殺滅率99.9999%以上。,滅菌（sterilization）：,是指用物理或化學(xué)方法殺滅或清除物料或設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過程，達(dá)到無活微生物存在的過程，微生物殺滅率99.999999%以上。,,,常用滅菌方法與原理,化學(xué)滅菌是指用化學(xué)物質(zhì)殺滅生物細(xì)胞的滅菌操作。其原理是使蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。常用化學(xué)滅菌劑如高錳酸鉀、漂白粉、氯氣，有機(jī)化合物如70％～75％乙醇、甲醛、戊二醛、環(huán)氧乙烷、2％新潔爾滅、3%～5％石炭酸等。主要適合用于皮膚表面、器具、實(shí)驗(yàn)室和工廠的無菌區(qū)域的臺(tái)面、地面、墻壁及局部空間或某些器械的消毒。,滅菌工

13、藝,輻射滅菌是指利用紫外線、高能量電磁波或粒子輻射滅菌，其中以紫外線最常用。其原理在于核酸和蛋白質(zhì)在紫外區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，DNA吸收紫外線后，會(huì)形成嘧啶二聚體，如胸腺嘧啶二聚體，分子之間的交聯(lián)改變了DNA的功能，從而導(dǎo)致生物細(xì)胞死亡。只適宜于表面滅菌，常用于一定空間的空氣滅菌，如無菌室、超凈工作臺(tái)等的滅菌。,,,常用滅菌方法與原理,加熱滅菌分為蒸汽濕熱法和干熱法。對(duì)于干熱滅菌，是實(shí)驗(yàn)室常用的器皿的方法。工業(yè)采用160℃、2h，或170℃、1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時(shí)間相應(yīng)縮短。濕熱滅菌效果優(yōu)于干熱滅菌，常用條件為115℃～121℃，壓力1×105Pa，維持15～3

14、0分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有厚膜包裹，耐熱性很強(qiáng)，不易殺滅。因此在設(shè)計(jì)滅菌操作時(shí)，經(jīng)常以殺死芽孢的溫度和時(shí)間為指標(biāo)。為了確保徹底滅菌，實(shí)際操作中往往增加50％的保險(xiǎn)系數(shù)。,滅菌工藝,,,發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)與檢測(cè),物理參數(shù)：溫度、壓力、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、通氣量、黏度、料液流量等。,發(fā)酵過程的控制,溫度：保證酶活性的重要條件，不同的微生物菌種的最適生長(zhǎng)溫度和產(chǎn)物形成的最適溫度都是不同的。,,,發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)與檢測(cè),發(fā)酵過程的控制,化學(xué)參數(shù)：酸堿度、基質(zhì)濃度、溶解氧濃度、氧化還原電位、產(chǎn)物濃度等。,pH值：對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響很明顯；發(fā)酵液的pH變化是菌體產(chǎn)酸和產(chǎn)堿的代謝反應(yīng)的綜合結(jié)果；控制方法：改變培養(yǎng)基配方、酸堿調(diào)節(jié)、補(bǔ)料流加控制、控制通氣量。,溶解氧（dissolved oxygen, DO）：是指溶解于培養(yǎng)液中的氧，常用絕對(duì)含量表示，也可用飽和氧濃度的百分?jǐn)?shù)表示，用溶氧電極來檢測(cè)。不同菌種對(duì)溶解氧量的需求是不同的，有一個(gè)適宜的范圍 。,,,發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)與檢測(cè),發(fā)酵過程的控制,生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌絲濃度。,發(fā)酵終點(diǎn)與控制,經(jīng)濟(jì)因素、下游工序、其他因素。,,,思 考 題,,,