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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,第十五章基因工程Chapter15Genetic Engineering,基因重組(gene recombination)是指DNA片段在,細(xì),細(xì)胞內(nèi)、,細(xì),細(xì)胞間，,甚,甚至在不,同,同物種之,間,間進(jìn)行交,換,換，交換,后,后的片段,仍,仍然具有,復(fù),復(fù)制和表,達(dá),達(dá)的功能。,基因工程,(geneticengineering,）,是指采用,人,人工方法,將,將不同來,源,源的DNA進(jìn)行重,組,組，并將,重,重組后的DNA引,入,入宿主細(xì),胞,胞中進(jìn)行,增,增殖或表,達(dá),達(dá)的過程,，,，從而改,變,變生物

2、特,性,性或創(chuàng)造,新,新的生物,類,類型的技,術(shù),術(shù)。,整合:,外來,DNA,侵入宿主,細(xì),細(xì)胞，并,與,與宿主細(xì),胞,胞,DNA,進(jìn)行重組,，,，成為宿,主,主細(xì)胞,DNA,的一部分,，,，這一過,程,程稱為整合,。整合后的,外,外來,DNA,仍然可隨,染,染色體,DNA,一起復(fù)制,，,，并在適,當(dāng),當(dāng)?shù)臈l件,下,下進(jìn)行表,達(dá),達(dá)，但也,可,可在相當(dāng),長(zhǎng),長(zhǎng)的一段,時(shí),時(shí)間內(nèi)不,表,表達(dá)。,基因工程,的,的操作過,程,程主要由,以,以下步驟,組,組成：,載體和目,的,的基因的,分,分離；載體和目,的,的基因的,切,切斷；載體和目,的,的基因的,重,重組；重組,DNA,的轉(zhuǎn)化和,擴(kuò),擴(kuò)增；重組

3、,DNA,的篩選和,鑒,鑒定。,（一）載,體,體：,可以將目,的,的基因運(yùn),載,載進(jìn)入細(xì),胞,胞并進(jìn)行,復(fù),復(fù)制和表,達(dá),達(dá)的DNA分子。,基,基因,工,工程中常,用,用的載體,(vector),主要包括質(zhì)粒,(plasmid),、噬菌體,(phage),和病毒,(virus),三大類。,這,這些,載,載體均需,經(jīng),經(jīng)人工構(gòu),建,建，除去,致,致病基因,，,，并賦予,一,一些新的,功,功能，如,有,有利于進(jìn),行,行篩選的,標(biāo),標(biāo)志基因,、,、單一的,限,限制酶切,點(diǎn),點(diǎn)等。,載體構(gòu)建,的,的條件：,1.能,在,在受體細(xì),胞,胞中獨(dú)立,復(fù),復(fù)制。,2.分,子,子量小，,易,易于分離,、,、純化、

4、,導(dǎo),導(dǎo)入,3.有,限,限制性內(nèi),切,切酶位點(diǎn),。,。,4.有,可,可供選擇,的,的遺傳標(biāo),志,志。,5.易,于,于導(dǎo)入受,體,體細(xì)胞。,1質(zhì)粒,：,：,是存在于,天,天然細(xì)菌,體,體內(nèi)的一,種,種獨(dú)立于,細(xì),細(xì)菌染色,體,體之外的雙鏈環(huán)狀,DNA,，具有獨(dú)立復(fù)制的能力，,通,通常帶有,細(xì),細(xì)菌的抗藥基因。最早,使,使用的質(zhì),粒,粒,DNA,是人工構(gòu),建,建的,pBR322,，該質(zhì)粒,分,分子大小,為,為,4.3kb,，帶有抗,四,四環(huán)素和,抗,抗氨芐青,霉,霉素基因,，,，含,EcoR,，,BamH,，,Hind,等單一,的,的限制酶,切,切點(diǎn)。,質(zhì)粒,pUC19,的分子結(jié),構(gòu),構(gòu),2噬菌,

5、體,體：,l,可通過轉(zhuǎn),染,染方式將,其,其,DNA,送入細(xì)菌,體,體內(nèi)進(jìn)行,增,增殖。常,用,用的為人,工,工構(gòu)建的,噬菌體載,體,體,。噬菌體,兩,兩端的片,段,段對(duì)于其,包,包裝是必,需,需的，因,而,而應(yīng)予保,留,留；而其,中,中間部分,則,則可進(jìn)行,改,改造或置,換,換，使之,具,具有某種,單,單一的限,制,制酶切點(diǎn),。,。目的基,因,因與噬菌,體,體,DNA,進(jìn)行重組,時(shí),時(shí)，可采,用,用插入重組,方,方式，也可采,用,用置換重組,方,方式。,3病毒,：,：,常用的為,SV40,，通過感,染,染方式將,其,其,DNA,送入哺乳,動(dòng),動(dòng)物細(xì)胞,中,中進(jìn)行增,殖,殖。目前,應(yīng),應(yīng)用相對(duì)

6、,較,較少。,（二）目,的,的基因：,目的基因,的,的篩選和,分,分離可采,用,用以下方,法,法進(jìn)行：,1直接,從,從染色體DNA中,分,分離：,僅適用于,原,原核生物,基,基因的分,離,離，較少,采,采用。,2人工,合,合成：,根據(jù)已知,多,多肽鏈的,氨,氨基酸順,序,序，利用,遺,遺傳密碼,表,表推定其,核,核苷酸順,序,序再進(jìn)行,人,人工合成,。適,應(yīng),應(yīng)于編碼,小,小分子多,肽,肽的基因,。,。,l,采用一定,的,的方法釣,取,取特定基,因,因的,mRNA,，再通過,逆,逆轉(zhuǎn)錄酶,催,催化合成,其,其互補(bǔ),DNA,（,cDNA,），除去,RNA,鏈后，再,用,用,DNA,聚合酶合,成,

7、成其互補(bǔ),DNA,鏈，從而,得,得到雙鏈,DNA,。這一方,法,法通?？?得,得到可表,達(dá),達(dá)的完整,基,基因,。,3,從,mRNA,合成,cDNA,：,4從基,因,因文庫(kù)中,篩,篩選：,將某一種,基,基因,DNA,用適當(dāng)?shù)?限,限制酶切,斷,斷后，與,載,載體,DNA,重組，再,全,全部轉(zhuǎn)化,宿,宿主細(xì)胞,，,，得到含,全,全部基因,組,組,DNA,的種群，,稱,稱為,G,文庫(kù),(genomicDNAlibrary),。,將,將某種細(xì),胞,胞的全部,mRNA,通過逆轉(zhuǎn),合,合成,cDNA,，然后轉(zhuǎn),化,化宿主細(xì),胞,胞，得到,含,含全部表,達(dá),達(dá)基因的,種,種群，稱,為,為,C-,文庫(kù),(c

8、DNA library),。,C-,文庫(kù)具有,組,組織細(xì)胞,特,特異性。,基因組文,庫(kù),庫(kù)的制作,5,利用,PCR,合成：,l,如已知目,的,的基因兩,端,端的序列,，,，則可采,用,用聚合酶,鏈,鏈反應(yīng)（,polymerase chainreaction,PCR,）技術(shù)，,在,在體外合,成,成目的基,因,因。但此,法,法可能會(huì),造,造成克隆,的,的目的基,因,因堿基序,列,列的改變,。,。,二、載體,和,和目的基,因,因的切斷,：,：,通常采用限制性核,酸,酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)，簡(jiǎn),稱,稱限制酶,，,，分別對(duì),載,載體DNA和目的,基,基因進(jìn)行,切,切斷

9、，以,便,便于重組,。,。限制酶,目,目前已經(jīng),發(fā),發(fā)現(xiàn)400多種，,所,所識(shí)別的,順,順序往往,為,為4-8,個(gè),個(gè)堿基對(duì),，,，且有回文結(jié)構(gòu)。,由限制酶,切,切斷后的,末,末端可形,成,成平端、,3-,突出粘性,末,末端和,5-,突出粘性,末,末端三種情況,。,。形成粘,性,性末端,(cohesive end),者較有利,于,于載體,DNA,和目的基,因,因的重組,。,。,三、載體,和,和目的基,因,因的重組,（,（接）,即將帶有,切,切口的載,體,體與所獲,得,得的目的,基,基因連接,起,起來，得,到,到重新組,合,合后的DNA分子,。,。（一）粘,性,性末端連,接,接法：當(dāng)載體DNA和

10、目,的,的基因均,用,用同一種,限,限制酶進(jìn),行,行切斷時(shí),，,，二者即,可,可帶有相,同,同的粘性,末,末端。如,將,將載體與,目,目的基因,混,混合在一,起,起，二者,即,即可通過,粘,粘性末端,進(jìn),進(jìn)行互補(bǔ),粘,粘合，再,加,加入DNA連接酶,，,，即可封,閉,閉其缺口,，,，得到重,組,組體。,較少的情,況,況下，對(duì),產(chǎn),產(chǎn)生的平,端,端也可直,接,接進(jìn)行連,接,接。,載體,DNA,與目,的,的基,因,因的,連,連接,（二,）,）人,工,工接,尾,尾法,：,：即同,聚,聚物,加,加尾,連,連接,法,法。,當(dāng),當(dāng)載,體,體和,目,目的,基,基因,無,無法,采,采用,同,同一,種,種限,制

11、,制酶,進(jìn),進(jìn)行,切,切斷,，,，無,法,法得,到,到相,同,同得,粘,粘性,末,末端,時(shí),時(shí)，,可,可采,用,用此,方,方法,。,。,此法,首,首先,使,使用,單,單鏈,核,核酸,酶,酶將,粘,粘性,末,末端,切,切平,，,，再,在,在末,端,端核,苷,苷酸,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)移,酶,酶的,催,催化,下,下，,將,將脫,氧,氧核,糖,糖核,苷,苷酸,添,添加,于,于載,體,體或,目,目的,基,基因,的,的,3-,端，,如,如載,體,體上,添,添加,一,一段,polyG,，則,可,可在,目,目的,基,基因,上,上添,加,加一,段,段,polyC,，故,二,二者,即,即可,通,通過,堿,堿基,互,互補(bǔ),進(jìn),

12、進(jìn)行,粘,粘合,，,，再,由,由,DNA,連接,酶,酶連,接,接。,四、,重,重組,DNA,的轉(zhuǎn),化,化和,擴(kuò),擴(kuò)增,（,（轉(zhuǎn),）,）重組,DNA,需導(dǎo),入,入宿,主,主細(xì),胞,胞才,能,能進(jìn),行,行增,殖,殖或,表,表達(dá),。,。重,組,組質(zhì),粒,?？?通,通過轉(zhuǎn)化（,transformation,）方,式,式導(dǎo),入,入宿,主,主細(xì),胞,胞，,即,即將,大,大腸,桿,桿菌,用,用,CaCl,2,處理,，,，增,加,加細(xì),菌,菌細(xì),胞,胞壁,的,的通,透,透性,，,，再,與,與重,組,組質(zhì),粒,粒,DNA,短暫,溫,溫育,，,，質(zhì),粒,粒,DNA,即可,導(dǎo),導(dǎo)入,宿,宿主,細(xì),細(xì)胞,。,。,如果

13、,是,是用,噬,菌,菌體,作,作為,載,載體,的,的重,組,組體,，,，則,需,需要,用,用外,殼,殼蛋,白,白進(jìn),行,行包,裝,裝，,使,使之,成,成為,具,具有,感,感染,能,能力,的,的噬,菌,菌體,，,，再,通,通過轉(zhuǎn)染(transfection),方,方式,將,將重,組,組噬,菌,菌體DNA導(dǎo),入,入大,腸,腸桿,菌,菌等,宿,宿主,細(xì),細(xì)胞,。,。,重組,DNA,導(dǎo)入,宿,宿主,細(xì),細(xì)胞,后,后，,即,即可,在,在適,當(dāng),當(dāng)?shù)?培,培養(yǎng),條,條件,下,下進(jìn),行,行培,養(yǎng),養(yǎng)以,擴(kuò),擴(kuò)增,宿,宿主,細(xì),細(xì)胞,。,。對(duì),于,于質(zhì),粒,粒,DNA,，還,可,可通,過,過在,培,培養(yǎng),基,

14、基中,加,加入,氯,氯霉,素,素，,抑,抑制,細(xì),細(xì)菌,蛋,蛋白,質(zhì),質(zhì)合,成,成及,染,染色,體,體,DNA,的復(fù),制,制，,以,以單,獨(dú),獨(dú)擴(kuò),增,增細(xì),胞,胞中,的,的質(zhì),粒,粒,DNA,。,五、,重,重組,DNA,的篩,選,選和,鑒,鑒定,（,（篩,）,）,由于,重,重組,體,體導(dǎo),入,入宿,主,主細(xì),胞,胞的,比,比例,通,通常,較,較低,，,，因,此,此需,要,要對(duì),含,含有,重,重組,體,體的,宿,宿主,細(xì),細(xì)胞,進(jìn),進(jìn)行,篩,篩選,并,并作,鑒,鑒定,。,?？?采,采用,以,以下,方,方法,進(jìn),進(jìn)行,：,：（一,）,）根,據(jù),據(jù)重,組,組體,的,的表,型,型進(jìn),行,行篩,選,選

15、：,對(duì)于,帶,帶有,抗,抗藥,基,基因,的,的質(zhì),粒,粒重,組,組體,，,，可,采,采用插入,滅,滅活,法,法進(jìn)行,篩,篩選,。,。如,pBR322,中帶,有,有抗,氨,氨芐,青,青霉,素,素和,抗,抗四,環(huán),環(huán)素,基,基因,，,，當(dāng),將,將目,的,的基,因,因插,入,入抗,四,四環(huán),素,素基,因,因后,，,，就,可,可引,起,起該,基,基因,失,失活,，,，細(xì),菌,菌對(duì),氨,氨芐,青,青霉,素,素耐,藥,藥，,而,而對(duì),四,四環(huán),素,素敏,感,感。,在,在含,氨,氨芐,青,青霉,素,素的,培,培養(yǎng),基,基上,能,能夠,生,生長(zhǎng),，,，而,在,在含,四,四環(huán),素,素的,培,培養(yǎng),基,基上,不,

16、不能,生,生長(zhǎng),的,的細(xì),菌,菌即,為,為帶,重,重組,體,體的,細(xì),細(xì)菌,。,。,插入,滅,滅活,法,法篩,選,選重,組,組體,（二,）,）根,據(jù),據(jù)標(biāo),志,志互,補(bǔ),補(bǔ)進(jìn),行,行篩,選,選：,當(dāng)宿,主,主細(xì),胞,胞存,在,在某,種,種基,因,因及,其,其表,達(dá),達(dá)產(chǎn),物,物的,缺,缺陷,時(shí),時(shí)，,可,可采,用,用此,方,方法,篩,篩選,重,重組,體,體。,即,即在,載,載體,DNA,分子,中,中插,入,入相,應(yīng),應(yīng)的,缺,缺陷,基,基因,，,，如,宿,宿主,細(xì),細(xì)胞,重,重新,獲,獲得,缺,缺陷,基,基因,的,的表,達(dá),達(dá)產(chǎn),物,物，,則,則說,明,明該,細(xì),細(xì)胞,中,中帶,有,有重,組,組體,。,。,（三,）,）根,據(jù),據(jù)DNA,限,限制,酶,酶譜,進(jìn),進(jìn)行,分,分析,：,：,經(jīng)過,粗,粗篩,后,后的,含,含重,組,組體,的,的細(xì),菌,菌，,還,還需,進(jìn),進(jìn)行,限,限制,酶,酶譜,分,分析,進(jìn),進(jìn)一,步,步鑒,定,定。,將,將單,一,一細(xì),菌,菌進(jìn),行,行擴(kuò),增,增后,分,分別,提,提取,其,其,DNA,，用,重,重組,時(shí),時(shí)所,用,用的,同,同一,限,限制,酶,酶進(jìn),行,行酶,