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1、Click to edit Master title style,,Click to edit Master text styles,,Second level,,Third level,,Fourth level,,Fifth level,,*,,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級(jí),,第三級(jí),,第四級(jí),,第五級(jí),,*,,*,基因工程,制藥簡(jiǎn)介,張,義浜,,2017-05-20,概述,目的基因的獲得,基因的表達(dá),基因工程菌的,培養(yǎng),基因工程藥物的分離純化,傳統(tǒng)制藥（生化制藥）存在的問題,:,1.,材料來源或制造技術(shù)困難而無法研制出產(chǎn)品；,,2.,從動(dòng)物臟器中提取

2、,易感染病毒；,,3.,存在免疫原性，使用受限制。,,,基因工程制藥的優(yōu)點(diǎn),大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽,提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì),發(fā)現(xiàn)更多,的內(nèi)源性生理活性物質(zhì),利用基因工程和蛋白質(zhì)工程對(duì)生理活性物質(zhì)進(jìn)行修飾和改造，提高藥效價(jià)值,獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源,基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物,,用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的，主要是藥用活性蛋白質(zhì),/,多肽，包括：,（,1,）免疫相關(guān)蛋白,----,各種抗原、單克隆抗體。,（,2,）細(xì)胞因子,----,如,IFN,、,IL,、,CSF,、,EGF,、,VIII,、,EPO,（,3,）激素,----,胰島素、生長(zhǎng)激素、心鈉素、人腦激素、人松馳激

3、素。,（,4,）酶類,----,尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、,SOD,、,a-,淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑。,,早期部分基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時(shí)間,產(chǎn)品,研制,國(guó)家,用途,上市,國(guó)家,人生長(zhǎng)激素釋放抑制素,(SRM),1977,日本,巨人癥,,,人胰島素,1978,美國(guó),糖尿病,1982,歐洲,人生長(zhǎng)激素（,HGH,）,1979,美國(guó),侏儒癥,1985,美國(guó),人,α,-,干擾素（,IFN,）,1980,美國(guó),病毒,1985,歐洲,乙肝疫苗,1983,美國(guó),乙肝,1986,歐洲,人白細(xì)胞介素（,IL,）,1984,美國(guó),腫瘤,1989,歐洲,人促

4、紅細(xì)胞生成素（,EPO,）,,日本,貧血,1988,歐洲,人粒細(xì)胞集落刺激因子,(G-CSF),,,白血病,1991,美國(guó),人組織纖溶酶原激活劑（,t-PA,）,,,血栓癥,1987,美國(guó),我國(guó)批準(zhǔn)上市的部分生物技術(shù)藥物,批準(zhǔn)年份,藥品,批準(zhǔn)年份,藥品,1989,IFN-α1b,1999,125Ala IL-2,、人胰島素、,Anti-CD3,鼠源單抗,1992,IFN-α2a,2000,人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（,bFGF,）,,表皮生長(zhǎng)因子（,EGF,）、,EGF,衍生物,,霍亂疫苗（,rBS-WC,）,1994,白介素,2,（,IL-2,）,2001,抗,IL-8,鼠源單抗凝乳劑,199

5、5,乙肝疫苗（酵母）,2003,IL-11,、腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核嵌合抗體注射液重組葡激酶（,r-SAK,）,1996,IFN-α 2b,，,,乙肝疫苗（,CHO,）,,粒細(xì)胞集落刺激因子（,G-CSF,）,2004,重組人,p53,腺病毒注射液,,抗,EGFR,人源單抗,1997,粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（,GM-CSF,）,,重組鏈激酶（,γ-SK,）、,EPO,2005,重組人腦利鈉肽、重組人血管內(nèi)皮抑素,,重組人,5,型腺病毒注射液（,H101,）、,rhTNF-α,、,rhTPO,1998,IFN-γ,、,125Ser IL-2,、生長(zhǎng)激素（,GH,）,,痢疾疫苗、,,牛堿性成纖維細(xì)胞生

6、長(zhǎng)因子（,bFGF,）,2006,重組,TNFR-Fc,融合蛋白,,什么是基因工程技術(shù)？,基因工程（,genetic engineering,）：也稱基因操作、遺傳工程，重組體,DNA,技術(shù)，基因克隆或分子克隆，指將不同生物的遺傳物質(zhì),——,基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒等）轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。,制備基因工程藥物的基本過程,,獲得目的基因 ↓ 構(gòu)建重組質(zhì)粒 ↓組建基因工程菌,(,或細(xì)胞,)

7、 ↓,培養(yǎng)工程菌 ↓ 產(chǎn)物分離純化 ↓ 除菌過濾 ↓ 半成品檢定 ↓ 成品檢定 ↓ 包裝,,上游階段,選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮：,必須保證所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有生物活性,考慮基因工程蛋白質(zhì)表達(dá)量的多少,蛋白質(zhì)分離純化的難易程度,,下游階段,基因的,克隆,工 具 酶,功 能,限制性核酸內(nèi)切酶,識(shí)別特異序列，切割,DNA,DNA,連接酶,催化,DNA,中相鄰的,5′,磷酸基和,3′,羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使,DNA,

8、切口封合或使兩個(gè),DNA,分子或片段連接,DNA,聚合酶,Ⅰ,合成雙鏈,cDNA,分子或片段連接,,缺口平移制作高比活探針,,DNA,序列分析,,填補(bǔ),3′,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,??,3,?,聚合、,3??,5,?,外切活性，而無,5??,3,?,外切活性。常用于,cDNA,第二鏈合成，雙鏈,DNA 3?,末端標(biāo)記等,反轉(zhuǎn)錄酶,合成,cDNA,,替代,DNA,聚合酶,I,進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5′,羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針,末端轉(zhuǎn)移酶,在,3′,羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加

9、尾,堿性磷酸酶,切除末端磷酸基,目的基因的獲得,一、反轉(zhuǎn)錄法,二、反轉(zhuǎn)錄,PCR,三、化學(xué)合成法,,常用的方法,:,一、反轉(zhuǎn)錄法,為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì),多肽的,DNA,序列，可以從產(chǎn)生該蛋,白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取,mRNA,,以,其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，,反轉(zhuǎn)錄生成該蛋白質(zhì),mRNA,互補(bǔ),DNA,（,cDNA,第一鏈），再以,cDNA,第一鏈為模板，在,DNA,聚合酶,Ⅰ,作,用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈,DNA,序列。,cDNA,克隆示意圖,DNA,聚合酶,I,mRNA,,,,,反轉(zhuǎn)錄酶,ss-DNA,,,,,,,,,ds-cDNA,,,ds-cDNA,核酸酶,S1,,二、反轉(zhuǎn)

10、錄,PCR,,提取組織或細(xì)胞中的總,RNA,，以其中的,mRNA,作為模,板，采用,Oligo(dT),或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成,cDNA,第一,鏈，直接以其為,模板（不需要合成,cDNA,第二鏈）進(jìn)行,PCR,擴(kuò)增,，獲得,目的基因，用于重組、克隆。,三、化學(xué)合成法,前提：核苷酸,序列已知；,或已知其蛋白質(zhì)的氨基酸序列，再推導(dǎo)出核苷酸序列,限制性：,,1,）不能,直接,合成太長(zhǎng)的基因,；,,2,）遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可導(dǎo)致中性突變；,,3,）,成本,較高,DNA,合成儀,基因,的克隆與表達(dá),基因表達(dá)：,基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯及所有加工過程。,基因高效表達(dá)：外源基因在某種宿主細(xì)胞中的表達(dá)

11、活動(dòng)，即剪切下一個(gè)外源基因片段，重組到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。,基因表達(dá)研究的主要問題：目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。,建立最佳的基因表達(dá)體系，是基因表達(dá)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵,一、宿主菌的選擇,,宿主菌應(yīng)滿足以下要求：,,具有高濃度、高產(chǎn)量、高產(chǎn)率；,,能利用易得廉價(jià)原料；,,不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；,,發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；,,容易進(jìn)行代謝調(diào)控；,,方便重組,DNA,操作；,,產(chǎn)物容易提取純化。,1.,原核細(xì)胞,（,1,）大腸桿菌,表達(dá)產(chǎn)物的形式：細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá),(,包涵體,),、胞內(nèi)可溶性表

12、達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，極少數(shù)情況下也可分泌到細(xì)胞外。不同的表達(dá)形式具有不同的表達(dá)水平及完全不同的雜質(zhì)。,大腸桿菌表達(dá),外源基因的優(yōu)勢(shì),全基因組測(cè)序，遺傳背景清楚（共,4405,,ORF,）,,基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善,,繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定,,被美國(guó),FDA,批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物,,缺陷,缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能,缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng),內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白,細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素,（,2,）枯草芽孢桿菌,分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成,包涵體,；不能使蛋白質(zhì)糖基化，另外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對(duì)產(chǎn)物

13、進(jìn)行不同程度的,降解,（,3,）鏈霉菌,重要的工業(yè)微生物。不致病、使用安全，分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有一定的糖,基化,能力,2,、真核細(xì)胞,,（,1,）酵母,,特點(diǎn)：,,真核生物細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物能糖基化；,,基因組小，僅為大腸桿菌的,4,倍；,,世代時(shí)間短，繁殖迅速；,,基因操作與原核生物相似；,,建立了有分泌功能的表達(dá)系統(tǒng)，將產(chǎn)物分泌出胞外，分離純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。,（,2,）絲狀真菌,,特點(diǎn)：,,有很強(qiáng)的蛋白分泌能力；,,能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等,;,,其糖基化方式與高等真核生物相似；,,絲狀真菌（如曲霉等）等被確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。

14、,,真核生物和原核生物,基因表達(dá),過程示意圖,克隆,載體,:,克隆,了外源,DNA,后，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，,使克隆,的,DNA,片段數(shù)量大大增加,表達(dá),載體,:,將外源基因或,DNA,片段在宿主細(xì)胞中表達(dá),蛋白質(zhì),插入型載體,:,將外源基因或,DNA,插入其中,置換型載體,:,切除,載體部分,DNA,，代之以外源基因或,DNA,。,載體（,vector,）,質(zhì)粒（,plasmid,）,質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主細(xì)胞染色體外而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子,。絕大多數(shù),質(zhì)粒是,DNA,型的，天然,DNA,質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即,cccDNA,。,基因克隆的載

15、體質(zhì)粒,DNA,分子都具有復(fù)制子、選擇性標(biāo)記、克隆位點(diǎn),。,原核細(xì)胞,表達(dá)載體,非融合型,pKK223-3,,分泌型,PINⅢ-ompA1,,融合蛋白表達(dá)載體,pGEX,結(jié)構(gòu),包涵體型,pBV220,結(jié)構(gòu),,融合蛋白表達(dá)載體,非融合型表達(dá)載體,分泌型表達(dá)載體,包涵體型表達(dá)載體,（一）表達(dá)載體,表達(dá)載體必須具備的條件：,載體能夠獨(dú)立的復(fù)制；,具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記,,,且克隆位點(diǎn)應(yīng)在啟動(dòng)子序列后，以便外源基因表達(dá)；,具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的,RNA,聚合酶識(shí)別；,具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；,具有很強(qiáng)的終止子，使,RNA,聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外

16、源基因，而不轉(zhuǎn)錄無關(guān)的基因；,所產(chǎn)生的,mRNA,必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼,AUG,和,SD,序列，以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。,（二）影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素,外源基因的劑量,外源基因的表達(dá)效率：,,A,、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱：將目的基因插入大腸桿菌,RNA,聚合酶能識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子下游,,B,、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性,,C,、,SD,序列和起始密碼的間距,,D,、密碼子組成：設(shè)計(jì)引物或合成基因時(shí)選擇大腸桿菌“偏愛”的密碼子,表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：,,A,、組建融合蛋白；,,B,、利用信號(hào)肽將真核基因產(chǎn)物搬至周質(zhì)空隙中；,,C,、位點(diǎn)特異性突變，增加蛋白的穩(wěn)定性；,,D,、采用蛋白酶缺陷型大

17、腸桿菌，減弱降解作用,細(xì)胞的代謝負(fù)荷：,,A,、宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與外源基因的表達(dá)分開；,,B,、宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開；,,C,、形成不溶性的包涵體,工程菌的培養(yǎng)條件,（三）真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式,1.,以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因,其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起，稱融合蛋白。,優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，不易被,細(xì)菌酶類降解；易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；,缺點(diǎn)：有免疫原性，需切除原核多肽,2.,以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因,,非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的,mRNA,的,AUG,為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。,,

18、優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性；,,缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞；可能引起人體免疫反應(yīng),3.,分泌型表達(dá)蛋白藥物基因,,將外源基因融合到編碼信號(hào)肽序列的下游。,,常用的信號(hào)肽有：堿性磷酸酶信號(hào)肽；膜外周質(zhì)蛋白,,信號(hào)肽；霍亂弧菌毒素,B,亞單位；,,優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含甲硫氨酸殘基；,,缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號(hào)肽不被切割或不在特定位置上切割。,酵母中,的基因表達(dá),（一）表達(dá)載體,1.,載體的復(fù)制序列,（,1,）,YEp,類（酵母附加體質(zhì)粒）,（,2,）,YRp,類（酵母復(fù)制型質(zhì)粒）,（,3,）,YCp,類（酵母著絲粒質(zhì)粒）,（,4,）,YIp,類（,酵母整合型質(zhì)粒）,2.,克隆載體,,向酵母載體中引入

19、大腸桿菌質(zhì)粒,pBR322,的,ori,部,,分和,Amp,r,或,Tet,r,部分，這樣構(gòu)成的克隆載體同時(shí)帶,,有細(xì)菌和酵母的復(fù)制原點(diǎn)和選擇標(biāo)記。,,酵母常用的選擇性標(biāo)記：氨基酸或核苷酸合成酶,,系基因，對(duì)抑制酵母生長(zhǎng)的藥物具有抵抗力的抗性,,基因,,3.,表達(dá)載體,,普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表,,達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對(duì)其,N,末端氨基酸,,是否增減并無嚴(yán)格要求。,,精確表達(dá)載體：要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的,,適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并,,使它在表達(dá)和加工后,N,末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物,,相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。,,（二）影

20、響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素,,1.,外源基因的劑量：質(zhì)粒拷貝數(shù)及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性,,2.,外源基因的表達(dá)效率：,,,A,、啟動(dòng)子,,,B,、分泌信號(hào)的效率,,,C,、終止序列的影響,3.,外源蛋白的糖基化,,4.,宿主菌株的影響：,,,A,、菌體生長(zhǎng)力強(qiáng)；,,,B,、菌體內(nèi)源蛋白酶要弱；,,,C,、菌株性能穩(wěn)定；,,,D,、分泌能力強(qiáng),基因工程菌的培養(yǎng),基因工程菌發(fā)酵的基本操作方式有：,,分批培養(yǎng),分批培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，但因不能控制生長(zhǎng)，獲得的菌體密度也有限,,半連續(xù)培養(yǎng)（補(bǔ)料分批）,在,一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營(yíng)養(yǎng)，使細(xì)胞進(jìn)一步的,生長(zhǎng),，或得到更多的代謝產(chǎn)物,連續(xù)培養(yǎng),不斷

21、地流加營(yíng)養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。連續(xù)培養(yǎng)則多用于動(dòng)力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究。,,透析培養(yǎng),,固定化培養(yǎng),基因工程菌培養(yǎng)方式,補(bǔ)料分批培養(yǎng),補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。,在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長(zhǎng)所需的良好微環(huán)境，延長(zhǎng)其生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補(bǔ)料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長(zhǎng)規(guī)律來調(diào)節(jié)補(bǔ)料的流加速率。,連續(xù)培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到一定程度后，開動(dòng)進(jìn)料和出料蠕動(dòng)泵，以一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng)。,連續(xù)培養(yǎng)可以為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制

22、其比生長(zhǎng)速率，為研究基因工程菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、生理生化特性、環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)的影響等創(chuàng)造了良好的條件。,,但由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長(zhǎng)階段和基因表達(dá)階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。在這樣的系統(tǒng)中關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率和細(xì)胞比生長(zhǎng)速率。優(yōu)化這三個(gè)參數(shù)以保證在第一階段培養(yǎng)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定，菌體進(jìn)入第二階段后可獲得最高表達(dá)水平或最大產(chǎn)率。,透析培養(yǎng),透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。,采用膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動(dòng)泵將發(fā)酵液抽出打入罐外的膜透析器的一側(cè)循環(huán)

23、，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中的乙酸濃度，并可通過在透析液中補(bǔ)充養(yǎng)分而維持較合適的基質(zhì)濃度，從而獲得高密度菌體。,膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時(shí)間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間段都對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)率有影響,固定化培養(yǎng),基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對(duì)分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點(diǎn)，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展。,基因工程菌發(fā)酵中試,,基因工程菌中試應(yīng)考慮的問題：適宜商品化生產(chǎn)

24、的工程菌，設(shè)計(jì)發(fā)酵反應(yīng)器，選擇反應(yīng)過程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分，維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法，工藝監(jiān)測(cè)方法，工藝控制方法，工藝自動(dòng)化使用方法，生物催化劑使用，產(chǎn)品提取方法的選擇，分離精制技術(shù)的選擇。,基因工程菌的不穩(wěn)定性,主要,表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，,兩種,表現(xiàn)形式：,,1,）,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性,,重組,DNA,分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失,,2,）,分配不穩(wěn)定性,,整個(gè),重組,DNA,分子從受體細(xì)胞中逃逸,基因工程菌不穩(wěn)定性的可能產(chǎn)生機(jī)制：,受體細(xì)胞,中限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組,DNA,分子的降解,外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞,正常生長(zhǎng)代謝,,,能量、,物質(zhì)的匱乏和

25、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序,重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻,分配,重組質(zhì)粒,逃逸的基本原因,受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排,培養(yǎng)基,比生長(zhǎng)速率,限制性基質(zhì),溫度,pH,和溶氧,外源基因,表達(dá),,,遺傳特性,,影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素,載體的選擇,宿主的選擇,外源基因整合到宿主染色體上,發(fā)酵工藝,1.,培養(yǎng)基,一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性,微生物在含有有機(jī)氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，由于培養(yǎng)基提供了生長(zhǎng)必須的氨基酸和其他物質(zhì)，微生物的生長(zhǎng)較基本培養(yǎng)基快。,,培養(yǎng)條件對(duì),基因工程菌

26、,穩(wěn)定性的影響,2.,比生長(zhǎng)速率,基因重組菌的比生長(zhǎng)速率對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大影響。提高比生長(zhǎng)速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。,基因重組菌的比生長(zhǎng)速率與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，如溫度，,pH,，溶氧，限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等。在一定的溫度和,pH,下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長(zhǎng)速率的主要因素。,3.,限制性基質(zhì),一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，微生物的生長(zhǎng)通常會(huì)受到一種或幾種物質(zhì)的限制。限制性基質(zhì)的種類對(duì)重組菌有不同的影響,4. pH,和溶解氧,pH,和,溶氧是影響微生物生長(zhǎng)的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時(shí)，通常都需要維持一定的,pH,和溶氧水平。在基因重組菌的高密度

27、培養(yǎng)時(shí)，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補(bǔ)充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力。,5.,外源基因的表達(dá),外源基因的表達(dá)會(huì)引起重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定；尤其當(dāng)外源基因高效表達(dá)時(shí)，有可能因競(jìng)爭(zhēng)利用物質(zhì)、能量、核糖體等干擾宿主細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)，并造成質(zhì)粒不穩(wěn)定。,,例如，吲哚丙烯酸（,IAA,）是,trp,,操縱子阻遏物的部分去阻遏劑，在培養(yǎng)大腸桿菌,MV12,（,pVH5,）時(shí)，在培養(yǎng)基中加入不同量的,IAA,，發(fā)現(xiàn)隨,IAA,量的增加，,pVH5,帶有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表達(dá)水平有很大提高，同時(shí)比生長(zhǎng)速率下降，培養(yǎng)液中,Trp,－,,的比例上升。電泳分析

28、表明,60%,～,70%,色氨酸合成能力喪失是由于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的變化，其余是由于質(zhì)粒丟失造成。,1,、改進(jìn),載體受體系統(tǒng),,以,增加質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：,,1,）將,R1,質(zhì)粒上的,parB,,基因引入表達(dá)型載體中，其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞,,2,）正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)，禁止,DNA,片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi),,3,）將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上，同時(shí)構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的,ssb,,基因（,DNA,單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,2,、施加,選擇壓力,根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素,

29、藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素；加入大量的抗生素會(huì)使生產(chǎn)成本增加；添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時(shí)間；添加抗生素選擇壓力對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力,載體上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)組份,培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,3,、分,階段控制培養(yǎng),因外源基因表達(dá)造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時(shí)，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制,在生長(zhǎng)階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達(dá)造成不穩(wěn)定性問題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。,連續(xù)培養(yǎng)時(shí)可以考慮采用多級(jí)培養(yǎng)，如在第一級(jí)進(jìn)行生長(zhǎng)，維持菌體的穩(wěn)定性，在第二級(jí)進(jìn)行表達(dá)。,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,4,

30、、控制目的基因的過量表達(dá),使用可控型啟動(dòng)子控制目的基因的定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度,使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù),,5,、優(yōu)化,基因工程菌的培養(yǎng)工藝,培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定,培養(yǎng)溫度：較低,的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的,穩(wěn)定,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,6,、控制培養(yǎng)條件,有些,含質(zhì)粒的菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長(zhǎng)速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,,例如,研究表達(dá)干擾素的,大腸桿菌,W3110(pEC901),在不同比生長(zhǎng)速率下的質(zhì)

31、粒穩(wěn)定性，隨著稀釋率的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價(jià)也明顯增大,.,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,7,、固定化,培養(yǎng),固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性,基因重組大腸桿菌進(jìn)行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達(dá)率都有了很大提高。 在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用。而采用固定化方法后，這種選擇壓力則可被省去。不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,基因工程藥物的分離純化,目的產(chǎn)物在初始物料中的含量較低；,含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，除目的產(chǎn)物外，還有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培

32、養(yǎng)基、無機(jī)鹽等，特別是產(chǎn)物類似物對(duì)目的產(chǎn)物的分離純化影響很大；,目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對(duì),pH,、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易失活、變性；,種類繁多，包括大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單或復(fù)雜的有機(jī)化合物，以及結(jié)構(gòu)和性質(zhì)復(fù)雜又各異的生物活性物質(zhì)；,應(yīng)用面廣，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱原。,基因工程藥物或生物技術(shù)產(chǎn)品特點(diǎn),一、建立分離純化工藝需了解的各種因素,1.,含目的產(chǎn)物的初始物料的特點(diǎn),（,1,）菌種,類型及其代謝特性,（,2,）原材料和培養(yǎng)基的來源及質(zhì)量是否穩(wěn)定,（,3,）生產(chǎn)工藝和條件,（,4,）初始,物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性,2

33、.,物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì),3.,目的產(chǎn)物特性,4.,產(chǎn)品質(zhì)量的要求,二、分離純化的基本過程,,基因工程藥物的分離純化主要分為,5,個(gè)步驟，,,包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度,,純化直至得到純品，以及成品加工。,,分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)。,,色譜技術(shù)分為：,,離子交換色譜,,,親和色譜,,凝膠過濾色譜,,高效液相色譜等,三、重組蛋白質(zhì)的分離純化,產(chǎn)物的主要特性及在分離純化中的作用,基因工程藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法,基因工程藥物制造實(shí)例,干擾素是真核細(xì)胞對(duì)各種刺激作出反應(yīng)而自然形成的一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)。干擾素除具有廣譜抗病毒活性，還具有抑制細(xì)胞分裂，特別是抑制腫瘤

34、細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)等功能，作為一種生物活性蛋白有著良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。,干擾素在我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程藥物。,早期獲得方法：用病毒誘導(dǎo)人白血球,(,白細(xì)胞,),產(chǎn)生，產(chǎn)量低，價(jià)格貴。,300L,人血才提取,1mg,,（一）干擾素,2003,年抗非典期間，江南大學(xué)與麗珠集團(tuán)蘇州新寶制藥廠合作攻關(guān)，通過發(fā)酵工程和生物制藥工程研制成功了重組人,α-2b,干擾素口鼻腔噴霧劑，解決了干擾素常溫保存穩(wěn)定性問題。在疫區(qū)特殊人群捐贈(zèng)使用，效果顯著。,誘生的白細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞提取核酸,,↓,通過寡,dT-,纖維素柱提取,mRNA pBR322,質(zhì)粒,,↓

35、 ↓,5%-23%,蔗糖密度梯度離心提取,12S- mRNA,內(nèi)切酶切割,,↓,↓,由,mRNA,轉(zhuǎn)錄成,cDNA,切割段位于,β,內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi),,↓ 結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素,雙鏈,cDNA,用末端,Pst-I,酶切割,,↓,再用,DNA,轉(zhuǎn)移酶接上,dT,或者,dG,在,pBR322,質(zhì)粒,DNA,的切割段加上,dA,或者,dC,++++++++++++++++,,退火獲得雜交質(zhì)粒 ↓ 轉(zhuǎn)化大腸桿菌

36、,K-12,擴(kuò)增雜交質(zhì)粒 ↓,篩選能夠抗四環(huán)素、但是對(duì)氨芐青霉素敏感的細(xì)菌克隆株,↓,采用雜交翻譯法挑選含有干擾素,cDNA,的克隆 ↓ 將干擾素,cDNA,克隆進(jìn)表達(dá)載體 ↓ 在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá),↓,（進(jìn)入下游工藝）,工程菌構(gòu)建,工程菌的發(fā)酵生產(chǎn),人干擾素,a-2b,的基因工程菌為,SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a,。質(zhì)粒使用,PL,啟動(dòng)子，含有氨芐青霉素抗性基因。種

37、子培養(yǎng)液含,1%,蛋白胨、,0.5%,酵母提取物、,0.5%NaCl,。 ↓基因工程菌接種到,4,個(gè),1000ml,三角燒瓶之中，每個(gè)燒瓶?jī)?nèi)裝有,250ml,種子培養(yǎng)基，,30℃,搖床培養(yǎng),10,小時(shí)，作為發(fā)酵罐的種子。 ↓用,15L,發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基,10L,發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下（,1%,蛋白胨、,0.5%,酵母提取物、,0.05%NaCl,、,0.01%NH,4,Cl,、,0.6%Na,2,HPO,4,、,0.001%

38、CaCl,2,、,0.3%KH,2,PO,4,、,0.01%MgSO,4,、,0.4%,葡萄糖、,50mg/ml,氨芐青霉素、少量防泡沫劑。,pH=6.8,。） ↓攪拌轉(zhuǎn)速,500r/min,、通氣量為,1,：,1v/v*min,、溶氧量為,50%30℃,發(fā)酵,8,小時(shí)（細(xì)菌增殖階段）,42℃,誘導(dǎo),2-3,小時(shí)（產(chǎn)物生產(chǎn)階段） ↓,[,監(jiān)控手段：每隔不同時(shí)間，取,2,毫升發(fā)酵液，,10000r/min,離心除去上清液，稱量菌體

39、濕重。,],,發(fā)酵物質(zhì),4000r/min,離心,30min,，除去上清液。得濕菌，從其中取,100g,。懸浮于,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）,500ml,之中，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。↓,4000r/min,離心,30min,，除去上清液。沉淀部分用,100ml,抽提液在室溫條件下，進(jìn)行攪拌抽提,2,小時(shí)，抽提液組成配方,[8mol/L,尿素、,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）、,0.5mmol/L DTT],。↓抽提液,15000r/min,離心,30min,，下層棄去。取上清液，用,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）稀釋至尿素濃度,

40、0.5mol/L↓,加入,0.1mmol/L,,DTT,，,4℃,攪拌,15,小時(shí)。,15000r/min,離心,30min,，除去不溶物。上清液用截流量,=10000,相對(duì)分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮↓濃縮液采用,Sephadex G50,層析柱分離，層析柱,2cm*100cm,、先用,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）平衡固定相，上柱之后，用同一緩沖液洗脫分離↓收集人干擾素,a-2b,部分，用,SDS-PAGE,檢查。再經(jīng),DE-52,柱進(jìn)行純化層析柱,2cm*50cm,、上柱之后，分別采用含有,0.05mol/L,、,0.10mol/L,、,0.15mol/L,

41、的,NaCl,的,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）洗滌。↓收集含有收集人干擾素,a-2b,部分。分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝。,[,得率要求：全過程蛋白質(zhì)回收率為,20%-25%,，產(chǎn)品不含雜蛋白質(zhì)、,DNA,、熱原質(zhì)檢測(cè)合格。,],干擾素的制備,（二）乙肝基因工程疫苗,1,、乙肝病毒：,（,1,）二十面體核衣殼，,25,－,27nm,。,（,2,）主要結(jié)構(gòu)蛋白為,C,蛋白，又稱核心抗原（,HBcAg,）。,（,3,）具有包膜，直徑,35,－,45nm,。,（,4,）包膜表面的病毒蛋白，乙肝表面抗原（,HBsAg,）。,第一代乙肝疫苗，屬血源疫苗，由無癥狀乙型肝炎表面抗原

42、陽性者的血漿制備而得。因提取工藝不同，疫苗所含成分也有一定的差別，但均含有,22 nm,小顆粒乙型肝炎表面抗原,。但疫苗,的成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng),(65,周,),，還存在傳播艾滋病和肝炎的潛在危險(xiǎn)。,第二代乙肝疫苗，將編碼乙型肝炎表面抗原的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或酵母菌中高效表達(dá)，得到乙肝基因工程疫苗，接種者中約有,10%,不產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)；另有,5%,～,15%,接種者屬低應(yīng)答者，低應(yīng)答者不能獲得完全保護(hù)作用。,第三代乙肝疫苗，乙肝病毒包膜的抗原性主要由,S,抗原和前,S1,、前,S2,抗原組成組成，美國(guó),Medeva,制藥公司利用基因重組技術(shù)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞成功地表達(dá)了包含,S,抗原和前,S1,、

43、前,S2,抗原的第三代重組疫苗，,1998,年用于臨床，能誘導(dǎo)更高的血清陽轉(zhuǎn)率和抗體應(yīng)答反應(yīng),。,工藝流程,謝謝各位的聆聽,,謝謝觀看,/,歡迎下載,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH,內(nèi)容總結(jié),基因工程制藥簡(jiǎn)介。傳統(tǒng)制藥（生化制藥）存在的問題:。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、EGF衍生物。DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA?；蛞阎涞鞍踪|(zhì)的氨基酸序列，再推導(dǎo)出核苷酸序列。不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素。絲狀真菌（如曲霉等）等被確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。真核生物和原核生物基因表達(dá)過程示意圖。插入型載體: 將外源基因或DNA插入其中。常用的信號(hào)肽有：堿性磷酸酶信號(hào)肽。缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號(hào)肽不被切割或不在特定位置上切割。提高比生長(zhǎng)速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)。↓收集含有收集人干擾素a-2b部分。分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝。另有5%～15%接種者屬低應(yīng)答者，低應(yīng)答者不能獲得完全保護(hù)作用。謝謝觀看/歡迎下載,