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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,,0,,,12 十二月 2024,1,動物細胞制藥的培養(yǎng)需求,第一節(jié) 動物細胞制藥的表達系統(tǒng)與特征,,昆蟲系統(tǒng)、哺乳動物細胞系統(tǒng)，最成功、重要表達活性外源蛋白的有效系統(tǒng)，應(yīng)用于藥物蛋白質(zhì)的表達。,一、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)與特征,1. 動物細胞的特征,細胞膜、細胞質(zhì),和細胞核,沒有細胞壁。,亞細胞器，功能獨特。,,,2. 動物細胞代謝,動物細胞的不同代謝途徑及其相應(yīng)的酶體系定位于特定的亞細胞區(qū)域。通過胞內(nèi)運輸（囊泡包裹）實現(xiàn)區(qū)域之間的物質(zhì)、信息和能量流動，通過穿梭實現(xiàn)不同代謝途徑之間的交換。,在動物細胞培養(yǎng)中，

2、葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作為合成代謝的前體，因此動物細胞的培養(yǎng)具有一定的靈活性。,葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以補償，反之亦然。谷氨酰胺是動物細胞的氮源，谷氨酰胺受限時，可增加其他氨基酸的消耗得以補償。,,,,糖代謝特點：,動物細胞吸收葡萄糖后，進行糖酵解，大部分葡萄糖分解為丙酮酸，進一步被還原為乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。,丙酮酸還可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶,A,，進入三羧酸循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生,CO,2,和水。小部分（,4,％～,8,％）葡萄糖進入戊糖磷酸途徑，把葡萄糖轉(zhuǎn)化為,4,、,5,、,7,碳糖和還原力,NADPH,，,5,碳糖用于核酸合成，其他中間產(chǎn)物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和

3、氨基酸代謝。,葡萄糖代謝旺盛，會產(chǎn)生大量的乳酸，對細胞產(chǎn)生毒性。,,,,氨基酸代謝特點：,吸收谷氨酰胺后，進入氨基酸代謝途徑，通過脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。,大多數(shù)谷氨酰胺在脫氨酶催化下，生成谷氨酸，并釋放氨，對細胞產(chǎn)生毒性。小部分谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。,谷氨酸還原酶把谷氨酸轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物α,-,酮戊二酸，進入三羧酸循環(huán)，為細胞提供能量。所以谷氨酰胺在細胞能量代謝中具有重要作用。谷氨酰胺與丙酮酸和草酰乙酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸和天門冬氨酸，丙氨酸可進入培養(yǎng)液并積累。在快速生長的動物細胞培養(yǎng)體系，轉(zhuǎn)氨作用是主要的代謝途徑。,,,,不同的

4、培養(yǎng)條件，葡萄糖和谷氨酰胺代謝重疊于丙酮酸。在正常細胞系中，丙酮酸羧化產(chǎn)生草酰乙酸，而草酰乙酸來源于谷氨酰胺。,在連續(xù)細胞系中，沒有這種流動。能量是以,ATP,和,NADPH,的形式提供，來源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二種細胞系對各個代謝途徑的貢獻和所起的作用不同。,常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整個代謝過程，避免有毒廢物積累。,,,,3. 蛋白質(zhì)糖基化,蛋白質(zhì)合成是以mRNA為模板，在核糖體上完成。而蛋白質(zhì)的糖基化無需模板指導(dǎo)，因此糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化。,糖蛋白的單糖單元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露糖、α-D-木糖、α-D-巖藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N-乙酰-α

5、-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神經(jīng)氨酸（或唾液酸）。,糖基化類型：寡糖基以共價鍵與蛋白質(zhì)的氮原子結(jié)合為N-糖基化，或與氧原子結(jié)合為O-糖基化。這兩種糖基化的位點和數(shù)量及糖的種類都不同。,,,N-糖基化：聚糖部分連接在天門冬酰胺的氨基上，其模體的保守序列為Asn-X-Thr/Ser (X為除脯氨酸以外的任意氨基酸)。如果X為Trp、Asp、Glu和Leu，對糖基化有負影響，而第三位Thr能增強糖基化。,N-糖基化分為高甘露糖型、復(fù)合型和雜合型三種類型，共同核心是3個甘露糖和2個N-乙酰葡萄糖胺組成的5糖（Man,3,GluNAc,2,），其他糖形成支鏈。,高甘露糖型的支鏈為甘露聚糖（5～9聚體），

6、無其他糖。,復(fù)合型含有2個以上支鏈，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。,雜合型至少含有一條復(fù)合糖鏈，另一個鏈含有甘露糖。,,,O-聚糖連接在Thr/Ser的羥基上，還沒有發(fā)現(xiàn)保守序列。,O-聚糖有四種不同的核心結(jié)構(gòu)，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化會影響蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象。,O-糖基化比較小，一般為1～6個寡聚糖，但比N-糖基化變化更大。,O-糖基化只在高爾基體上進行，糖基單元有木糖、葡萄糖。,,,,糖基化磷脂酰肌醇錨著點：它在膜與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的相互作用，都具有相同的核心結(jié)構(gòu)：膽胺-PO,4,-Man,2,-GlcHN,2,-肌醇-PO,4,-脂。,膽胺形成膜內(nèi)蛋白的橋，而肌醇在膜內(nèi)。,在細

7、胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白時，磷脂酶C可切割此類蛋白，有利于純化。,,,,細胞特異性糖基化途徑——淋巴細胞中進行，它不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。,IgG的糖基化，等分GlcNAc殘基連接在核心甘露糖上，該糖基化在抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性中起重要作用。,IgG蛋白的鉸鏈區(qū)，富含Ser、Thr和Pro，5個Ser全部糖基化。,促黃體激素、促甲狀腺素等的硫酸化只能在垂體中發(fā)生。,,,,盡管哺乳動物細胞具有細胞內(nèi)的糖基化裝置，但不同細胞系，糖基化特征不同。,鼠和豬細胞傾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠雜交瘤或人鼠雜交瘤生產(chǎn)的抗體中，乙酰果糖占優(yōu)勢。,CHO,細胞不能合成等分,N-,乙酰葡萄糖胺，而鼠細

8、胞系卻能形成半乳糖末端，對人有免疫原性。,要根據(jù)糖基化的結(jié)構(gòu)，選擇適宜的細胞系。,,,,細胞系,,Fuc,,Gal,,唾液酸,,α1,6,,α1,3 Fuc,α1,3Gal,,SO,4,-GalNAc,α2,3,,,α2,6,糖基化,等分GluNAc,BHK,,++,,0,,+,,0,,++,,0,,-,,0,,CHO,,++,,-,,0,,0,,++,,0,,+,,0,,鼠雜交瘤,,++,,0,,++,,0,,++,,0,,+++,,0,,C127,,++,,0,,++,,++,,++,,++,,+++,,0,,J558L,,++,,0,,++,,-,,++,,++,,+++,,0,,人淋巴

9、細胞,++,,0,,0,,0,,+,,+,,0,,++,,人垂體,,++,,0,,0,,+++,,+,,+,,0,,++,,Namalwa,,++,,0,,0,,0,,++,,++,,-,,-,,人鼠雜交瘤,++,,0,,0,,0,,+,,+,,+,,0,,,,2. 哺乳動物細胞表達系統(tǒng),基因工程哺乳動物細胞系：失去分化能力的無限生長細胞系，即永久性細胞。表達的蛋白質(zhì)能正確加工、修飾并折疊形成具有生物活性的功能分子，接近或類似天然產(chǎn)物。,糖基化等修飾是糖蛋白行使功能所必需的，而且對產(chǎn)品質(zhì)量有影響，如生物活性、穩(wěn)定性、免疫原性等。原核細胞表達的EPO無糖基化，在體內(nèi)表現(xiàn)無活性。原核表達的GM－C

10、SF雖有活性，但在體內(nèi)產(chǎn)生抗體。,動物細胞表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液，容易分離純化。約有70％批準的蛋白質(zhì)藥物由哺乳動物細胞系統(tǒng)表達制造，而且數(shù)目還在不斷增加。,,,表達系統(tǒng),,O-糖基化,,寡聚甘露糖,高甘露糖,復(fù)合體,,大腸桿菌,,0,,0,,0,,0,,釀酒酵母,,＋＋,,0,,＋＋＋＋,,－,,昆蟲Sf9,,＋＋,,＋＋＋＋,,0,,－,,倉鼠CHO,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,倉鼠BHK,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,鼠雜交瘤,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,鼠骨髓瘤,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,C127,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,J558L,,＋＋,,－,,0,,＋＋,,

11、人淋巴細胞,,＋＋,,0,,0,,＋,,Namalwa,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,人鼠雜交瘤,,－,,＋＋,,0,,＋＋,,,,,,大腸桿菌,,酵母,,哺乳動物細胞,,產(chǎn)物濃度,,高,,高,,低,,分子量,,低,,高,,高,,二硫鍵,,有限,,不受限制,,不受限制,,分泌,,無,,有或無,,有,,形式,,包涵體,,單鏈，天然,,單鏈，天然,,折疊,,不正確,,正確,,正確,,糖基化,,無,,可能,,完全,,逆轉(zhuǎn)錄病毒,,無,,無,,可能,,熱原,,可能,,無,,無,,培養(yǎng)特點,,容易,,容易,,較難，成本高,,分離純化,,復(fù)雜,,復(fù)雜,,簡單,,,,細胞類型,,表達水平（μg/ml）,,

12、猴CV1,,1～10,,猴CV1,,0.05,,猴COS,,1,,小鼠成纖維細胞C127,,1～5,,小鼠成纖維細胞3T3,,0.1～0.5,,CHO（dhfr,－,）,,0.01~0.05,,CHO（dhfr,－,）,,10,,,,動物細胞表達系統(tǒng)的不足是細胞生長緩慢，生產(chǎn)效率較低，產(chǎn)量遠遠落后于其他表達系統(tǒng)。,骨髓細胞MPG－11生產(chǎn)IgG的能力為5pg/(細胞.分鐘)，10L反應(yīng)器，密度為107/ml，生產(chǎn)能力不到1g/d。,連續(xù)細胞系增加了生長和代謝速率，但同時導(dǎo)致了副產(chǎn)物的增加。,動物細胞對培養(yǎng)條件要求苛刻和敏感，對溫度、pH、滲透壓、剪切力等忍受能力差。培養(yǎng)基要求高，需要添加氨基酸

13、、維生素等，往往需要附加血清，提供生長因子，費用較高。同時可能有潛在的致病因子、免疫原性存在。,表達載體的改進和宿主細胞的改造是動物細胞表達系統(tǒng)的研發(fā)重要內(nèi)容。,,,3. 昆蟲細胞表達系統(tǒng)與特征,表達載體為昆蟲病毒，轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，表達出目標(biāo)蛋白質(zhì)。昆蟲病毒主要有桿狀病毒科核多角體病毒。,苜蓿尺蠖核多角體病毒－秋黏蟲細胞表達系統(tǒng)，家蠶核多角體病毒－家蠶幼蟲表達系統(tǒng)。,Micro－Gene Sys公司表達艾滋病基因工程疫苗，隨后豬生長素、CD4膜蛋白及瘧疾疫苗、雞新城病毒疫苗、血吸蟲GST疫苗、乙肝表面抗原、重組人GM－CSF等。日本批準用家蠶系統(tǒng)生產(chǎn)干擾素已上市。生物試劑盒的標(biāo)準品大多用昆蟲表達

14、系統(tǒng)生產(chǎn)。,至少有600多種昆蟲可以作為宿主，每年有數(shù)百個基因利用昆蟲系統(tǒng)進行表達，越來越成為非常有用的表達宿主。,,,優(yōu)點,1）安全：桿狀病毒無致病性，產(chǎn)品安全性受FDA認可。,2）易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野外生存能力，飼養(yǎng)，發(fā)育快，,3）高量表達：用強啟動子，外源基因可超量表達。表達產(chǎn)物在昆蟲細胞內(nèi)能結(jié)晶，對產(chǎn)物純化非常有意義。,4）高效表達：可容納較大的外源基因（12kb），表達數(shù)個外源基因，并且正確裝配成有功能的分子。如表達抗體的重鏈和輕鏈，自主裝配成有功能的抗體。,5）翻譯后的加工：昆蟲細胞能進行一系列翻譯后的加工，包括糖基化、脂肪酸?；?、磷酸化、氨基酸的乙?；?、氨?；?，大部分產(chǎn)物顯示

15、出良好的活性。,,,缺點：,1,）重組率低，篩選困難，周期長，需要,4,－,10,天。,2,）外源基因的表達在轉(zhuǎn)染的晚期，大約在,20h,后起始基因表達，在,72,－,94h,細胞裂解死亡，基因表達時間約,30,－,50h,，高水平表達不連續(xù)且時間短，這對表達不利。,3,）昆蟲細胞糖基化等加工途徑與哺乳動物細胞不完全相同，它不提供復(fù)雜的,N,糖基化，如添加半乳糖和唾液酸殘基，有可能造成溶解性、穩(wěn)定性、免疫性等變化。表達水平非常高，加工裝備跟不上，蛋白質(zhì)修飾效率可能不高。,研究開發(fā)的主要方向：有效的病毒表達載體；,決定基因表達時期啟動子，無血清培養(yǎng)昆蟲細胞系。,,,第二節(jié) 基因工程動物細胞系的構(gòu)

16、建,,,構(gòu)建高效表達載體,轉(zhuǎn)染動物細胞,篩選鑒定,獲得生產(chǎn)用工程化細胞系,,,,,動物細胞的表達載體：病毒載體，質(zhì)粒載體。,病毒載體：,逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等載體，對原始病毒改造而來。,同源重組構(gòu)建腺病毒載體，在靜止期轉(zhuǎn)染細胞，表達時間較長。,痘病毒載體可插入,25,～,40 kb,外源基因，甚至是多個基因。無感染性和致癌性，可用于構(gòu)建基因工程疫苗。,美國,Genentech,公司已用,SV40,載體生產(chǎn)乙肝疫苗，其他載體可用于基因治療。,,,,質(zhì)粒載體：,微生物的質(zhì)粒載體類似，一般是穿梭質(zhì)粒，具有兩個復(fù)制子和抗性篩選標(biāo)記基因。,大腸桿菌的復(fù)制子，細菌中繁殖。,抗生素抗性標(biāo)記

17、，原核細胞篩選。,動物細胞的復(fù)制子，,在宿主細胞中穩(wěn)定表達。,還有絲狀噬菌體復(fù)制子。,,,,啟動子序列：含有RNA聚合酶識別和結(jié)合位點，以便有效轉(zhuǎn)錄。TATA盒，確定起始位置；GG盒，影響轉(zhuǎn)錄頻率。,來源于病毒、動物基因和噬菌體的啟動子。,動物病毒啟動子：逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列（LTRS）、SV40病毒的早期和晚期啟動子、腺病毒的晚期啟動子、人巨噬病毒（CMV）立即早期基因啟動子。,動物基因的啟動子：轉(zhuǎn)錄因子EF-1α啟動子、泛素蛋白啟動子、β-肌動蛋白啟動子、干擾素-α啟動子、IgG啟動子、鼠金屬硫蛋白基因啟動子等。,噬菌體T7啟動子比動物基因啟動子表達水平高。,,,PolyA信號序列：

18、保持mRNA的穩(wěn)定性，防止降解，保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工和正確性，但序列不宜太長，避免能量過度消耗。添加PolyA信號和5′端轉(zhuǎn)錄暫停位點，可以減少上游序列轉(zhuǎn)錄通讀造成的背景。,牛生長素（BGH）基因的PolyA信號比SV40 PolyA更強，常用于高效表達載體中。,終止序列：AAUAAA或連續(xù)的終止密碼UGA、UAA和UAG，能防止轉(zhuǎn)錄通讀，使轉(zhuǎn)錄在正確的位點結(jié)束。,在轉(zhuǎn)錄起始點上游或下游使用相同類型的增強子，有利于提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。,,,雙順反子表達載體：,兩個基因在同一啟動子控制之下，內(nèi)部核糖體進入位點使同一,mRNA,中的第二個基因得到翻譯。將,dhfr,與目標(biāo)基因串連，,dhfr,

19、的,cDNA,插入內(nèi)含子中，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被剪切，翻譯不出蛋白質(zhì)，而目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得到翻譯。,順反子在多亞基蛋白的偶聯(lián)表達及其控制策略等方面有廣泛應(yīng)用前景。,使篩選容易，而且能高效表達。,,,選擇適宜的啟動子，可實現(xiàn)定向表達。,CMV啟動子和人EF-1α啟動子，可實現(xiàn)同一載體上的二個基因的獨立表達。,組織特異性啟動子：如鼠、山羊酪蛋白啟動子，可使基因主要在乳腺中表達。,N端設(shè)計分泌信號肽：如Ig κ鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)之間序列，使外源基因的表達產(chǎn)物向胞外分泌。,C端設(shè)計跨膜錨定序列：可使外源蛋白展示在細胞表面。,亞細胞定位信號肽：目標(biāo)基因產(chǎn)物將轉(zhuǎn)運到細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細胞質(zhì)中，這對基因的功

20、能研究非常合適。,,,基因的擴增系統(tǒng)：,在逐漸提高選擇壓的情況下，使選擇標(biāo)記基因拷貝數(shù)增加，并可連帶其兩側(cè)序列一起擴增，從而提高表達基因水平。,最常用二氫葉酸二氫葉酸還原酶（,DHFR,）基因系統(tǒng)和谷氨酰氨合成酶（,GS,）基因系統(tǒng)。,氨甲喋呤基因與目標(biāo)基因重組，氨甲喋呤使,dhfr,基因與目標(biāo)基因大量增加，達到數(shù)千拷貝。,硫胺蛋氨酸使,GS,系統(tǒng)的基因得到大量擴增。,,,二、受體細胞,1．人源細胞株系,Namalwa：類淋巴母細胞，非整體核型。表達IgM，懸浮生長。外源基因的表達水平較高，可用無血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)，已成功地表達了rhEPO、rhG-CSF、tPA等。英國Wellcome公司

21、用Namalwa細胞的反應(yīng)器達8000L，用Sendai病毒誘導(dǎo)，大規(guī)模生產(chǎn)α干擾素，并批準上市。,WI-38：二倍體成纖維細胞系，2n=46，第一個被用于制備疫苗。貼壁生長，對很多病毒敏感，廣泛用于疫苗生產(chǎn)。,MRC-5：二倍體成纖維細胞系，但生長較WI-38快，對逆境有一定抗性也用于制備疫苗。,,,2．哺乳動物細胞株系,CHO細胞：中國倉鼠卵巢中分離的上皮樣細胞系，貼壁型生長，是目前使用最為普遍和成熟的表達糖基化蛋白藥物的宿主細胞。核型為亞二倍體，分泌表達外源蛋白，而內(nèi)源蛋白分泌很少。貼壁型生長細胞，但可進行懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準確，表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

22、、性質(zhì)和生物活性接近天然。,有多種衍生突變株應(yīng)用于藥物的生產(chǎn)，培養(yǎng)時需要添加脯氨酸。二氫葉酸還原酶缺陷株表達的藥物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ，已上市。,使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白質(zhì)表達水平。,,,BHK－21：幼倉鼠腎臟中分離的成纖維樣細胞，非整倍體。用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。BHK-21表達的重組凝血因子Ⅷ已被獲準上市。,C127：從小鼠乳腺腫瘤中分離獲得的上皮樣細胞，貼壁型生長。C127細胞系已表達多種外源基因，其中EPO的水平達10 mg/L，生產(chǎn)rhGH已被批準上市。,3T3,：,HIN Swiss,小鼠胚胎培養(yǎng)物中

23、分離建立的連續(xù)細胞系，能大量表達外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學(xué)研究。,骨髓瘤細胞：,J558L,是小鼠,BALB/c,骨髓瘤細胞，分泌,IgA,，用于轉(zhuǎn)染研究。,NSO,和,SP2/O,－,Ag14,不分泌,Ig,，與淋巴細胞融合篩選雜交瘤，分泌制備特異性抗體。,,,,雜交瘤細胞：從小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞中分離獲得雜交瘤細胞系，能在無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，能進行糖基化等加工修飾，大量分泌和高效表達。很多雜交瘤細胞系用于抗體的制備。,Vero：從成年非洲綠猴腎中分離獲得的貼壁型成纖維細胞，多倍體核型，能適應(yīng)灌流操作，進行連續(xù)培養(yǎng)。已有突變細胞系能用無血清培養(yǎng)。最為常

24、用Vero E6增殖多種病毒，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)病毒性疫苗，已被批準用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細胞，用于表達外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測。,COS,：是從,SV40 DNA,轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細胞,CV1,中分離得到的，廣泛用于外源基因瞬時表達的研究。,GH3用于生長激素研究，293細胞系用于基因治療的研究。,,,3．昆蟲細胞株系,Sf21：從秋粘蟲卵巢細胞中分離得到，細胞較大，容易放大，高效表達外源基因。,Sf9：從秋粘蟲的卵巢細胞（SF21）中分離得到，是最常用的昆蟲表達細胞。對桿狀病毒高度敏感，生長快，能高效表達外源基因?？箼C械剪切，能在無血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器

25、中生長。,TN-5B1-4：從粉紋夜蛾卵細胞勻漿中分離得到，無血清培養(yǎng)，快速倍增。分泌表達重組蛋白的能力比Sf9細胞系高20多倍，能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。,,,,三、細胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染（是將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎募夹g(shù)通用名稱?；?qū)胝婧思毎姆椒ê芏啵饕谢瘜W(xué)轉(zhuǎn)染、物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。,方法,,表達類型,,毒性,,細胞類型,,特點,,基因槍,,瞬時，穩(wěn)定,,無,,多種細胞組織，器官,,有效，儀器操作,,顯微注射,,瞬時，穩(wěn)定,,無,,多種細胞,,有效，技術(shù)難度大,,電穿孔,,瞬時，穩(wěn)定,,無,,多種細胞,,有效，儀器操作,,沖擊波,,瞬時，穩(wěn)定,,無,,多種細胞，局部組織,,簡單有效，儀器操

26、作,,,,方法,,表達類型,,毒性,,細胞類型,,特點,,逆轉(zhuǎn)錄病毒,,瞬時，穩(wěn)定,,無,,對應(yīng)的宿主細胞,,有效,,原生質(zhì)體融合,,瞬時，穩(wěn)定,,無,,懸浮細胞,,技術(shù)復(fù)雜,,生物轉(zhuǎn)染特點,,,化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。,其基本原理是磷酸鈣、二乙氨乙基（,DEAE,）－葡聚糖（,dextran,）和陽離子樹脂與核酸形成復(fù)合物，附著于細胞表面，通過細胞的內(nèi)吞作用進入細胞。,磷酸鈣與,DNA,形成不溶性沉淀，帶正電荷的,DEAE,－葡聚糖與帶負電荷的,DNA,磷酸基團結(jié)合，陽離子樹脂包裹,DNA,形成脂質(zhì)體。,滲透性休克和,DMSO,等化學(xué)試劑能促進,DNA,進入細胞。轉(zhuǎn)染試劑盒商業(yè)化供應(yīng)，特

27、別是脂質(zhì)體材料的轉(zhuǎn)染試劑。,影響因素：細胞培養(yǎng)物的密度、,DNA,的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處理時間、促進劑的使用等。,,,方法,,表達類型,,毒性,,細胞類型,,特點,,磷酸鈣,,瞬時、穩(wěn)定,,無,,貼壁細胞，懸浮細胞,,簡單,,DEAE-葡聚糖,,瞬時,,有,,CV1，COS,,簡單,,陽離子樹脂,,瞬時、穩(wěn)定,,有或無,,貼壁、原代懸浮細胞,,簡單，有效,,化學(xué)轉(zhuǎn)染的特點,,,四、轉(zhuǎn)染體篩選與分離,轉(zhuǎn)染后1～6天收獲細胞，進行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測外源基因的瞬時表達。,為了獲得穩(wěn)定整合的細胞系，先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48小時，讓細胞倍增1～2代，使轉(zhuǎn)染DNA表達

28、。再按1：15比例轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上，每2～4天更換培養(yǎng)基，持續(xù)2～3周，促進抗性細胞生長，清除死細胞殘骸，最后得到獨立的克隆。,在轉(zhuǎn)染中大約有萬分之一的細胞將穩(wěn)定整合外源基因，因此需要顯性選擇標(biāo)記來分離轉(zhuǎn)染細胞。,哺乳動物細胞的選擇標(biāo)記，使用與之相對應(yīng)的選擇劑。,,,,選擇劑,,基因,,使用濃度,,氨甲喋呤,,dhfr,－,,0.01～300 μmol/L,,氨喋呤,,tk,＋,,0.4 μmol/L,,5-溴脫氧尿苷,,tk,－,,30 μg/ml,,G418, Zeocin,,neo,,100～800 μg/ml,,潮霉素B,,hyg,,10～400 μg/ml,,殺瘟稻菌素,,bsd

29、,,2～10 μg/ml,,霉酚酸,,gpt,,25 μg/ml,,嘌呤霉素,,乙?；D(zhuǎn)移酶,,0.5～10 μg/ml,,Xyl-A,,ada,,4 μmol/L,,,,報告基因,,特點,,使用與分析方法,,cat,,內(nèi)源活性低，蛋白穩(wěn)定，線性范圍窄，,體外，熒光或免疫分析,,lacZ,,有內(nèi)源活性，X-gal染色，線性范圍寬,,體內(nèi)外，染色，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,堿性磷酸酶,,分泌型，線性范圍寬，受到細胞類型限制,體外，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,gus,,蛋白質(zhì)穩(wěn)定，線性范圍寬，X-Gluc染色,體內(nèi)外，染色，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,gfp,,無內(nèi)源活性，分子量小，穩(wěn)定，無需底物，紫

30、外線激發(fā),體內(nèi)外，熒光分析,,,,第三節(jié) 動物細胞培養(yǎng)的需求與培養(yǎng)基的制備,,動物細胞離體后，失去了消化等系統(tǒng)，不能利用多糖、蛋白質(zhì)等聚合程度高的化合物。,只能利用簡單的單體化合物如單糖、氨基酸等，為了維持細胞正常生長，還必須添加維生素、無機鹽類、生長類因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)、貼附與伸展因子及其它附加成分等。,動物細胞對培養(yǎng)環(huán)境的要求高，不同細胞系的要求也不盡相同，培養(yǎng)基要盡可能與體內(nèi)生活條件接近。,,,一、動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求,,1.糖類,糖類是細胞主要的營養(yǎng)物質(zhì)，分解后釋放出能量ATP。,培養(yǎng)基中都必須添加葡萄糖，有時添加核糖等。,提高細胞生長的碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。,,,

31、2. 氨基酸,氨基酸是蛋白質(zhì)和酶的組成單位。氨基酸還參與合成一些含氮化合物，核苷酸的四種嘌呤和嘧啶堿基、兒茶酚胺等含氮激素及神經(jīng)遞質(zhì)等。氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅?，間接提供能量。,動物細胞：8－10種必須氨基酸。,離體容易失去，20種氨基酸中至少12種是必需氨基酸：,精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸等。,谷氨酰胺還可作為重要的碳源和能源而被利用。,,,3. 維生素,維生素是一類微量的小分子有機生物活性物質(zhì)，對代謝和生長起調(diào)節(jié)和控制作用。,水溶性維生素包括B族維生素和維生素C。B族維生素以輔酶或輔基形式參與酶反應(yīng)

32、，主要調(diào)節(jié)酶活性和代謝活性。維生素C，抗壞血酸，在體內(nèi)參與還原反應(yīng)、羥化反應(yīng)，促進膠原蛋白合成和粘多糖合成，抗氧化作用。,脂溶性維生素包括維生素A、D、E、K四種。,維生素A維持正常視覺和上皮組織。維生素D為視固醇類化合物，主要是調(diào)節(jié)鈣磷代謝。維生素E即生育酚，是抗氧化劑，防止生物膜中磷脂的不飽和脂肪酸被氧化。維生素K，促進合成凝血酶原，促進血液凝固。,,,5. 無機鹽類,無機鹽是細胞代謝所需的酶的輔基，同時保持細胞的滲透壓和緩沖pH的變化。,Na,＋,和Cl,－,參與生理電活動，維持水平衡、保持滲透壓和酸堿平衡。離體培養(yǎng)為細胞提供足夠的Na和Cl離子是基本條件，一般生理鹽水的離子濃度（0.9

33、% NaCl）。,Ca,2＋,、Mg,2＋,，對細胞間的互黏穩(wěn)定起重要作用。在離體培養(yǎng)時，螯合細胞間的Ca,2＋,和Mg,2＋,，可以達到分散細胞的目的。,磷是核酸、磷脂等的組成成分。,碳酸鹽緩沖液是重要的體內(nèi)緩沖體系，與K,＋,、Cl,－,等在維持酸堿平衡具有重要作用。,,,6. 生長類因子及激素,細胞之間是相互聯(lián)系的，而非孤立的。特別是高度分化功能的動物細胞更是如此。,細胞離體生長時，必要添加激素與細胞生長因子等。胰島素是最常用的激素，促進糖原和脂肪酸的合成，對細胞的生長有刺激作用。其它激素有促卵泡激素、甲狀腺素、乳激素、生育酚等。,細胞因子有表皮生長因子、成纖維細胞生長因子和神經(jīng)細胞生長

34、因子，根據(jù)不同細胞添加。,為了細胞的貼壁生長，必需添加貼附因子，纖維結(jié)合蛋白、膠原等，伸展因子如表皮生長因子、成纖維細胞因子等。,,,二、動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境需求,1. 水與滲透壓,細胞生長離不開水，水是細胞反應(yīng)的重要介質(zhì)。1）水是一種良好的溶媒，營養(yǎng)物質(zhì)在水中被吸收，廢物在水中被排泄。2）具有熱穩(wěn)定性和導(dǎo)熱性，調(diào)節(jié)穩(wěn)定溫度。,正常血漿滲透壓主要是無機鹽Na,＋,、K,＋,、Cl,－,、HCO,3,－,等構(gòu)成，蛋白質(zhì)構(gòu)成膠體滲透壓較小。,動物細胞對滲透壓有較強的耐受性，常用增減NaCl的濃度調(diào)整滲透壓，每增加1mg/ml NaCl，滲透壓增加32 mOsm/kg。,離體培養(yǎng)細胞的滲透壓應(yīng)控制為等

35、滲透溶液。,,,2. 溫度,不同種類的動物細胞對溫度的要求是不同的，變溫動物對溫度要求沒有恒溫動物嚴格。,哺乳動物細胞最佳培養(yǎng)溫度為37,℃，雞細胞為39－40℃，而昆蟲類細胞為25－28℃。,在培養(yǎng)過程中，根據(jù)細胞種類選擇確定適宜的培養(yǎng)溫度。,哺乳動物細胞的耐受溫度范圍較窄，在,35-37,℃內(nèi)能正常進行代謝和生長，超出范圍會引起細胞傷害甚至死亡。,細胞對低溫的耐受性比高溫要強，低溫抑制生長，但無傷害作用，在冰點溫度附近仍能存活。,,,3. 氧氣,動物細胞生長必須有氧氣，無氧下，能獲得能量供應(yīng)，但細胞缺氧時不能生存。離體培養(yǎng)的氣體含有5％CO,2,和95％空氣，其中氧濃度為21％。有時充以N

36、,2,氣稀釋O,2,濃度。O,2,濃度在60%以上為高氧環(huán)境，對細胞毒性較大。,4. pH值,動物細胞對pH值很敏感，低于6.8或超過7.6會產(chǎn)生嚴重影響。機體細胞的pH范圍為6－8，血液和體液中，變化范圍很小。人血液pH維持7.36-7.44。pH低于7.05會發(fā)生酸中毒，高于7.45發(fā)生堿中毒。細胞代謝產(chǎn)生CO,2,，使培養(yǎng)液變酸，pH發(fā)生波動。合成培養(yǎng)基偏酸性，為了穩(wěn)定pH，可用緩沖體系配制。在開放體系中，CO,2,逸出，使培養(yǎng)基變堿。通入5％CO,2,，可維持在pH7.2-7.4范圍內(nèi)。,,,5. 生長基質(zhì),改變生長表面特性，促進細胞貼附的物質(zhì)。,貼附細胞生長需要一個支持介質(zhì)，采用在培

37、養(yǎng)液中添加或在器皿表面覆蓋生長基質(zhì)，幫助細胞的貼附和生長。,生長基質(zhì)為胞外基質(zhì)成分，多聚賴氨酸、纖維連接蛋白、膠原、層黏蛋白、韌黏素等。,生長基質(zhì)已有商業(yè)化產(chǎn)品，,用PBS或BBS配成10倍貯存液，在37,℃下包被，靜置2－4小時或室溫過夜，對器皿表面進行包被，然后無菌生理鹽水洗滌后使用。有些還可以直接加入培養(yǎng)液。,,,生長基質(zhì),,貯存液濃度,,使用濃度,,使用方法,,多聚賴氨酸,,0.5 mg/L,,0.05 mg/L,,表面包被,,纖維連接蛋白,,10 mg/ml,,1 mg/ml,,加入培養(yǎng)液,,層粘蛋白,,,,5～10 μg/ml,,表面包被,,韌粘素,,75 μg/ml,,5～15

38、μg/ml,,包被或加入培養(yǎng)液,,膠原蛋白,,1～3 mg/ml,,0.1 mg/ml,,表面包被,,,,6．抗生素,動物細胞培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，很容易被微生物污染。雖然對使用抗生素仍存在質(zhì)疑，但還是常添加抗生素，以避免輕度污染。,抗生素使用濃度差別很大，一般范圍為50～100 μg/ml。在大規(guī)模生產(chǎn)中，除了青霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素外，其它抗生素可以使用。,抗生素使用對細胞會產(chǎn)生毒性，而且使實驗室保留抗藥性微生物，應(yīng)加以注意和克服。,,,,抗生素,,作用對象,,工作濃度（μg/ml）,,穩(wěn)定性（天）,,兩性霉素B,,真菌,,1～2.5,,3,,制霉菌素,,真菌,,50,,3,,

39、氨芐青霉素,,G,＋,、G,－,細菌,,100,,3,,紅霉素,,G,＋,細菌，支原體,,100,,3,,四環(huán)素,,G,＋,、G,－,細菌，支原體,,10,,4,,慶大霉素,,G,＋,、G,－,細菌，支原體,,50,,5,,利福平,,G,＋,、G,－,細菌,,50,,3,,卡那霉素,,G,＋,、G,－,細菌,,100,,5,,鏈霉素,,G,＋,、G,－,細菌,,100,,3,,氯霉素,,G,－,細菌,,5,,5,,青霉素G,,G,＋,細菌,,100,,3,,,,三、動物細胞培養(yǎng)基的種類與組成,動物細胞對培養(yǎng)基的要求高，不同細胞系的要求也不盡相同，因此培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且昂貴。但是要盡可能提供與體

40、內(nèi)生活條件接近的培養(yǎng)環(huán)境。主要組成成分如下：,糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類、生長類因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)、貼附與伸展因子及其它附加成分等。,不同細胞對葡萄糖利用相似，但對氨基酸的利用相差很大，不同的細胞過程對氨基酸的需求存在差別。目前停留在流加谷氨酰胺上,。,,,,血清：蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素和生長因子等。胎牛血清、新生?；虺膳Ｑ?、馬血清、雞血清、羊血清及人血清，最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和新生牛血清。水解乳蛋白和膠原富含氨基酸。血清和水解酪蛋白應(yīng)用于許多細胞系和原代及傳代細胞培養(yǎng)。,脂類化合物對動物細胞培養(yǎng)是必需的，實際中類脂及其前體和血清常平行使用。添加的蛋白質(zhì)試劑主要有鐵傳遞蛋

41、白，起離子載體的作用，有時用無機鐵鹽代替。胰島素起生長素的作用，白蛋白起保護劑作用。其他附加成分如核苷類及丙酮酸鹽等是培養(yǎng)基的必需成分，有助于細胞克隆和特異化細胞的培養(yǎng)。,動物細胞培養(yǎng)過程中，被微生物污染。常添加抗生素，以避免輕度污染。,,,1. 天然培養(yǎng)基,直接取自于動物組織提取液或體液作為培養(yǎng)基，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。營養(yǎng)價值高，成分復(fù)雜，不穩(wěn)定，來源受到限制，不宜大量培養(yǎng)和生產(chǎn)使用。,2. 合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定?，F(xiàn)在已有幾十種合成培養(yǎng)基，大部分已商品化。,組成：無機鹽、糖、氨基酸、維生素及其他成分。,由于細胞種類和培養(yǎng)條件不同

42、，所用合成培養(yǎng)基也不同，在動物細胞培養(yǎng)中最常用培養(yǎng)基有7－8種。,,,3. 無血清培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基是全部用已知成分組配的、不加血清的合成培養(yǎng)基。在含有營養(yǎng)和貼壁因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入適宜的細胞生長因子，細胞良好生長，適合于制藥生產(chǎn)。,無血清培養(yǎng)基提高了培養(yǎng)的質(zhì)量，避免了使用血清帶來的麻煩，產(chǎn)品純化容易，組分穩(wěn)定，可大量配制。,無血清培養(yǎng)基通常需要添加激素與生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁與伸展因子、低分子營養(yǎng)成分等。,大多數(shù)無血清培養(yǎng)基含有蛋白質(zhì)和激素等大分子物質(zhì)，適宜于多種細胞系的培養(yǎng)。對于大規(guī)模生產(chǎn)用的無血清培養(yǎng)基，往往成分不完全清楚，但簡單而且低成本。,,,四、培養(yǎng)基的控制,1. 培養(yǎng)用水

43、質(zhì),細胞培養(yǎng)水質(zhì)最低要求電導(dǎo)率在1X10,6,Ω cm以上。水存放時間不宜超過2周。對于制藥，必需使用純凈水配制培養(yǎng)基，普通水必需除去各類元素有毒或有害物質(zhì)及微生物，還必需除熱源，達到純凈水標(biāo)準。,2. 緩沖液,緩沖液：弱酸與弱酸鹽或弱堿與弱堿鹽組成的，pH恒定但不干擾試驗。不同種類細胞對pH 要求不一致，不同生長階段對pH要求也不同。原代細胞pH要求嚴格，而傳代細胞要求較寬。細胞培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基的pH不斷下降。緩沖液中和培養(yǎng)液中的酸性物質(zhì)。,,,最廣泛使用為碳酸氫鈉/碳酸,其次為磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，調(diào)節(jié)二者的比例，配制成不同pH緩沖液。,碳酸鹽緩沖液除了直接的緩沖作用

44、外，還有間接作用，碳酸生成揮發(fā)性CO,2,后很快逸出。細胞呼吸產(chǎn)生的CO,2,與水形成碳酸，任何堿在培養(yǎng)液中都被中和，生產(chǎn)相應(yīng)碳酸氫鹽,其他緩沖液:Tricine-Glycine、MOPS 、TES 、HEPES 、DIPSO 、HEPPSO 等等有機緩沖液，緩沖能力強。Tris所含氨基具有高的化學(xué)反應(yīng)活性，能抑制細胞生長，并通過生物膜，它調(diào)節(jié)pH要依賴于溫度的變化，因此不宜作為培養(yǎng)液。離體培養(yǎng)中，緩沖液多為平衡鹽溶液的重要組分之一，很少單純使用。,,,3. 生理鹽水與平衡鹽溶液,在緩沖液的基礎(chǔ)上，添加調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類，在一定程度上能滿足細胞對pH和鹽離子要求。,緩沖液或緩沖鹽溶液用于:配制溶

45、液, 處理細胞的溶液。對于直接接觸、長期培養(yǎng)的培養(yǎng)液，常用生理鹽水和平衡鹽溶液，是滲透壓與胞漿滲透壓平衡的溶液。,生理鹽水供給細胞水分和各種離子，維持一定滲透壓，并能良好溶解試劑和藥物。有各種不同成分的生理鹽水，分別加入pH緩沖劑與指示劑、葡萄糖，形成平衡鹽溶液。,平衡鹽溶液：集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲能力、營養(yǎng)供給為一體，具有多種功能和作用。,,,BSS配制：,1）先分別溶解CaCl,2,、MgCl,2,、MgSO,4,。,2）在另一容器中依次溶解其他試劑。,3）在另一容器中用5.6% NaHCO,3,數(shù)滴溶解酚紅。,4）將含Ca,2+,、Mg,2+,溶液緩慢倒入步驟2配制的溶液中，

46、攪拌，防止沉淀。,5）再加入酚紅溶液。,6）補足水，并用NaHCO,3,調(diào)節(jié)pH。,含葡萄糖的BSS過濾除菌，不含葡萄糖時常規(guī)高壓滅菌。小量培養(yǎng)液可置4度保存。一旦出現(xiàn)沉淀，要重新配制。,,,注意事項：,細胞只利用L型氨基酸，不能利用D型，對于DL混合型氨基酸，使用量應(yīng)該加倍。,谷氨酰胺溶液中很不穩(wěn)定，要單獨配制成濃縮液。,NaHCO,3,一般配成3.7％、5.6%、7.4%三種濃度，過濾除菌或高壓滅菌，4度保存，使用前加入，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。,為了優(yōu)化細胞生長環(huán)境，還添加其他成分，如嘌呤和嘧啶類，維生素C、谷胱甘肽、巰基乙醇。,一般情況下，培養(yǎng)基成分如氨基酸、維生素、葡萄糖、緩沖液等、補充因子

47、幾類，先配制成高倍濃縮的母液，過濾滅菌，冷藏。使用時按一定比例稀釋，配制成工作液。,,,第二節(jié) 動物細胞增殖生長的動力學(xué)過程,一、單細胞生長增殖周期,從一個細胞分裂形成兩個新細胞的過程為一個細胞周期或一個細胞世代。單個細胞周期包括細胞間期、細胞分裂期，間期又包括間期1、DNA合成期和間期2三個時期。,不同的細胞類型其分裂周期及各期的時間都不同，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分也會影響細胞周期,,,一般地動物細胞分裂周期為,12,－,48,小時,,,典型的細胞周期為,24,小時。,對連續(xù)細胞系，失去了細胞周期控制，人工培養(yǎng)條件不適，細胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡。在培養(yǎng)過程中，缺乏生長因子或血清、營養(yǎng)受限和逆境

48、等可引發(fā)凋亡發(fā)生。,,,,二、細胞群體的生長過程,細胞群體生長增殖過程與微生物的生長增殖過程相似,1. 潛伏期，細胞經(jīng)歷一段懸浮狀態(tài)，貼附于器皿表面。,2. 對數(shù)生長期：細胞分裂旺盛，指數(shù)增加。細胞相互接觸匯合成片，接觸抑制，限制分裂和運動，密度不再增加。,3. 靜止期 ：分裂數(shù)與死亡數(shù)相等的相對動態(tài)平衡時期。,4.衰亡期：細胞死亡數(shù)目大于分裂數(shù)目的時期。,三、群體細胞生長的動力學(xué)參數(shù),細胞分裂代數(shù)G就可用下列公式計算：,G＝logN－logN0）/log2,,,第四節(jié) 動物細胞的分離與培養(yǎng),一、細胞的種類,生物體是由多種多樣的分化細胞構(gòu)成，如人體的細胞類型達200余種。,這些細胞都是由受精卵

49、分裂產(chǎn)生的細胞后代生長增殖分化而來。不同細胞具有不同的功能，細胞分化異常導(dǎo)致癌變。分化程度越高，脫分化的能力越差。,在胚胎發(fā)育過程中，高等動物細胞的分化是由全能性變成多能性，再變成單能性，進而失去再分化的能力。,雖然成熟細胞不能再分化，但其細胞核仍然具有全能性，因此可以通過核移植，克隆動物。,,,體外培養(yǎng)細胞，可分為原代細胞系、傳代細胞。,原代培養(yǎng)：,從體內(nèi)取出的組織細胞進行體外接種培養(yǎng)，原代培養(yǎng)的細胞為原代細胞，它生長分裂并不旺盛，與體內(nèi)細胞相似，適合于藥物檢測實驗。生產(chǎn)中有些產(chǎn)品仍沿用原代細胞，如雞胚細胞，兔或鼠腎細胞、淋巴細胞。,傳代細胞:,原代細胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細胞。傳代后，細胞分裂增殖

50、旺盛，能保持一致的二倍體核型，所以又成為二倍體細胞系。傳代細胞的增殖能力有限，所以也稱為有限細胞系。如WI－38、MRC－5、2BS等用于生產(chǎn)。,,,根據(jù)細胞的傳代次數(shù)和壽命，可分為有限細胞系和無限細胞系或連續(xù)細胞系。,有限細胞系:正常細胞經(jīng)過多次傳代后，一般可連續(xù)培養(yǎng)30－50代，就會逐漸失去增殖能力，也就是說它們只能生長有限的時間，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后將老化死亡。,無限細胞系：當(dāng)細胞經(jīng)過自然或人為的因素轉(zhuǎn)化為異倍體后，才能變?yōu)闊o限細胞系。如腫瘤細胞就是自發(fā)形成的永久細胞系，沒有分裂次數(shù)的限制。物理、化學(xué)或生物因素也能獲得。,細胞壽命無限，生長不受細胞密度的影響，倍增時間短不具接觸抑制現(xiàn)象，它

51、對培養(yǎng)條件和生長因子等要求低，，非常適合于工業(yè)化生產(chǎn)，理想的藥物生產(chǎn)細胞系。,,,根據(jù)細胞對生長特性和對基質(zhì)的依賴性，可分為貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞。,貼壁依賴性細胞：生長需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面，細胞自身分泌或人為在培養(yǎng)基中加入貼附因子，使細胞依附在支持物表面，才能生長和增殖，大多數(shù)動物細胞都屬于此類。,非貼壁依賴性細胞：生長不依賴于固體支持物表面，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，有時被稱為懸浮細胞。血液、淋巴細胞、腫瘤細胞和某些轉(zhuǎn)化細胞屬于此類，生長干擾素的Namalwa細胞。,有些細胞對支持物的依賴性不嚴格，可貼壁生長，可懸浮生長。中國倉鼠卵巢細胞、小鼠L929細胞、BHK細

52、胞。,,,二、工程細胞的獲得與保存,目前用于制藥的動物細胞有4類，即原代細胞系、二倍體細胞系、異倍體細胞系和融合的或重組的工程細胞系。,細胞無限傳代，使大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)藥物成為可能。,異倍體細胞用于產(chǎn)生重組基因工程產(chǎn)品，使動物細胞成為藥物生產(chǎn)的一個新領(lǐng)域。,,,1. 原代細胞系的分離與培養(yǎng),用原代細胞系生產(chǎn)藥物需要大量的動物。,動物組織或器官,洗滌 粉碎,酶解消化,離心或過濾,接種培養(yǎng),培養(yǎng)液稀釋細胞,洗 滌,37度消化，檢查是否充分和完全。,胰蛋白酶：細胞間質(zhì)較少的軟組織，胚胎、肝、腎及傳代細胞,膠原酶：纖維、上皮、癌組織,工作濃度：0.1-0.3 mg/ml,鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶,

53、,,2. 傳代細胞培養(yǎng),長滿器皿表面的細胞進行分離，接種到新的培養(yǎng)基上，進行新一輪培養(yǎng)。,掌握好最佳時期：剛剛?cè)繀R合的細胞，過早產(chǎn)量低，過晚健康狀態(tài)不佳。,過程與原代細胞相同，用30－50倍體的0.25％胰蛋白酶和EDTA對細胞塊消化，消化后再培養(yǎng)。,要注意消化程度，細胞對酶的反應(yīng)不同，有的敏感，掌握好適宜的消化時間和方法，不要過度，獲得細胞濃度均勻，生長速度一致的傳代細胞。,曾經(jīng)廣泛應(yīng)用，但不是理想的生產(chǎn)細胞系,,,3. 細胞系的建立與保存,一旦獲得了穩(wěn)定的有一定特性的細胞系，就建立細胞庫，進行長期保存。根據(jù)藥品生產(chǎn)的有關(guān)規(guī)定，必須建立原始細胞庫和生產(chǎn)用細胞庫或工作細胞庫。,,,WCB1,

54、QC,,WCB2,QC,QC,原始培養(yǎng)物,MCB,,QC內(nèi)容：細胞活性檢測、無菌實驗、核型、,DNA,分析、同工酶分析、支原體試驗、其他外源物試驗、穩(wěn)定性和基因型分析等，工作細胞庫必須與主細胞庫完全一致。,,,,低溫冷凍保存：,用冷凍保護液（含10％血清的培養(yǎng)液，附加10％甘油或7.5%-10%二甲基亞砜）細胞預(yù)冷，稀釋成10,6,細胞/ml。分裝，火焰下封口。緩慢冷凍，細胞放入CO,2,低溫冰柜或液氮中，溫度為-150—-190,℃,，細胞的全部活動幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)。,復(fù)蘇細胞：,冷凍細胞取出，立即在37,℃,水浴中，快速融化。在保護劑存在下，慢凍快融是保存復(fù)蘇細胞的要領(lǐng)。融化后的細胞可用于

55、進一步實驗。,,,三、大規(guī)模培養(yǎng)方法,根據(jù)動物細胞的生長特點，只能采用懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)等三種主要方法進行大規(guī)模培養(yǎng)。,1. 單層貼壁培養(yǎng),細胞貼附于一定的固體支持表面上，進行的培養(yǎng)方法。大多數(shù)動物細胞屬于貼壁依賴性，貼壁培養(yǎng)是動物細胞培養(yǎng)的一種重要方法。接種后，細胞經(jīng)過吸附、接觸而,貼附于基質(zhì)表面，然后進行,生長、分裂繁殖，很快進入對數(shù)期。一般數(shù)天就長滿整個表面，形成致密的單層細胞。,貼壁培養(yǎng)容器:轉(zhuǎn)瓶、玻璃珠、微載體和中空纖維等。,滾瓶是為早期培養(yǎng)所采用，結(jié)構(gòu)簡單，投資少，重復(fù)性好，但勞動強度大，占用空間大，產(chǎn)量低，不易控制和監(jiān)測。,,,細胞貼壁原理：,細胞主要靠靜電引力和范德

56、華力貼附在固體表面，因為動物細胞在生理狀態(tài)下帶負電，貼壁培養(yǎng)的固體表面要求具有正電荷和高表面活性。,適宜的電荷密度是粘附和貼壁的關(guān)鍵，電荷密度低，不能有效粘附，電荷密度高則會對細胞產(chǎn)生毒性。,優(yōu)點：容易更換培養(yǎng)液，灌注培養(yǎng)時，能達到高細胞密度；有利于產(chǎn)物的分泌表達，可改變培養(yǎng)液與細胞的比例。,缺點：操作較煩雜，檢測受到一定限制，培養(yǎng)條件難以均一，傳質(zhì)和傳氧差，放大培養(yǎng)是瓶頸。,,,,2．微載體培養(yǎng),微載體為三維培養(yǎng)系統(tǒng)，細胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養(yǎng)液中。,微載體培養(yǎng)兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點，有很大的比表面積，供單層細胞貼附和增殖。,懸浮微球使細胞生長的環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高

57、，重復(fù)性好，減少了勞動強度，容易放大，于20世紀80年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原等。,多孔微載體或多孔微球，極大地增加了比表面積，如Cytodex-1的比表面積達6000 cm,2,/g，Cytopore的比表面積達28000 cm,2,/g。商品化的微載體基質(zhì)有玻璃、葡聚糖、纖維素、塑料和明膠等，表面帶電基團為DEAE等。,,,玻璃珠：直徑約,2,～,3 μm,，密度,1.5 g/cm,3,，難以在低速下懸浮。在玻璃表面覆蓋塑料，可得到低密度微載體，如,Bioglas,和,Ventreglas,，而中空玻璃也可達到此密度。,葡聚糖微載體：帶正電，干粉可在,pH7.2,的磷酸鹽

58、緩沖液中吸脹，清洗滅菌后使用。,Cytodex 2：,電荷性大大下降，吸附能力很低，適合于蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)。,纖維素微載體,DE52,和,DE53：,適合多種細胞培養(yǎng)。,塑料載體,Biosilon,是聚乙烯載體，無吸附性能，可重復(fù)使用，但貼壁較慢，對細胞的摩擦損傷較大。,聚丙烯酰胺載體貼壁較快，親水性。,,,微載體的選擇依賴于攪拌系統(tǒng)和工藝過程，可用于轉(zhuǎn)瓶、攪拌燒瓶和氣升式反應(yīng)器等。,為了提高貼壁能力，對基質(zhì)表面進行包埋，如血清蛋白、多聚賴氨酸處理，可加速貼壁過程。,在懸浮培養(yǎng)早期，還可向培養(yǎng)液補充丙酮酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶等。,,,,多孔微載體：,直徑,0.2,～,5 mm,，孔徑,

59、20,～,300 μm,，達占總體積的,85%,，可實現(xiàn)細胞的固定化，達到高密度培養(yǎng)。,廣泛使用的多孔微載體有,Cellsnow,、,Cytocell,（纖維素基質(zhì)）、,Verax,、,Cultisphere,（膠原）、,Cytoline 1,和,2,（聚苯乙烯）、,ImmobaSil,（硅橡膠）及,Siran,（玻璃）等。,主要用于攪拌反應(yīng)器、固定床和流化床反應(yīng)器。,,,,貼壁培養(yǎng)的固體表面要求：,正電荷和高度表面活性。玻璃、聚苯乙烯塑料、不銹鋼金屬材料和微載體、,多孔微載體或多孔微球。商品化的微球基質(zhì)是葡聚糖、聚丙烯酰胺、明膠交聯(lián)、聚苯乙烯和纖維素等，帶電基團為DEAE等。微載體有Cyto

60、dexI、II、III和 DEAE－纖維素等，已是主要的培養(yǎng)方法。,理想的微載體所具備的性能：,質(zhì)地柔軟，微球間摩擦輕；耐高溫，可高壓滅菌；透明性，便于觀察細胞生長；細胞相容性，利于貼附和生長；無毒性和惰性，對細胞無毒害，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，不吸附培養(yǎng)基；低速即懸浮，靜止即沉降，便于換液和收獲；微粒大小均勻；可回收重復(fù)使用。,,,3. 懸浮培養(yǎng),細胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長的培養(yǎng)過程,主要對于非貼壁性依賴性細胞，如雜交瘤細胞等。,動物細胞懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，經(jīng)常借鑒發(fā)酵理論和經(jīng)驗，但有自身的特點，,由于動物細胞沒有細胞壁，不能耐受劇烈的攪拌和通氣剪切，對環(huán)境適應(yīng)性差。,在懸浮培

61、養(yǎng)中要注意發(fā)揮,動物細胞的特性,。,常用的反應(yīng)器有通氣式攪拌混和氣升式生物反應(yīng)器。,方法的優(yōu)點是操作簡單，培養(yǎng)條件相對均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易放大培養(yǎng)。細胞體積小，密度低，培養(yǎng)病毒易失去標(biāo)記而降低免疫能力。,,,4.固定化培養(yǎng),細胞包埋在微載體內(nèi)或膠囊內(nèi)，即細胞固定化后，進行懸浮培養(yǎng)。適宜于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。細胞密度高、抗剪切力和污染等優(yōu)點，是生產(chǎn)首選方法。,吸附：通過物理吸附使細胞貼附在固體載體表面，微載體和中空纖維培養(yǎng)等。,共價交聯(lián)：雙功能試劑處理細胞，使細胞之間交聯(lián)的固定化方法。,包埋：細胞包埋在載體內(nèi)部。網(wǎng)格型為高分子凝膠細網(wǎng)格，而微囊型為高分子半透膜。包埋材料有人

62、工聚合物、瓊脂糖凝膠和血纖維蛋白等。,,,微囊法：親水半透膜把細胞包埋在微囊內(nèi)。,多聚賴氨酸/海藻酸固定細胞：凝膠載體的表面被多聚賴氨酸覆蓋，形成一層多孔可透薄膜，再使凝膠載體液化，便可制成微囊。,雜交瘤細胞與海藻酸鈉溶液混合，經(jīng)微囊發(fā)生器，微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，再用檸檬酸去鈣離子，球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài)，細胞在在微囊內(nèi)懸浮。,微囊化固定培養(yǎng)工藝在單克隆抗體的生產(chǎn)中獲得成功，使抗體截留在膜內(nèi)，血清中的蛋白質(zhì)被排出在膜外，產(chǎn)物濃度和純度較高。培養(yǎng)結(jié)束后，收獲微囊，破微囊，純化抗體，純化工藝簡單，應(yīng)用前景廣。,,,三、細胞培養(yǎng)的操作方式,動物細胞的培養(yǎng)的操

63、作方式與微生物培養(yǎng)基本相同。,（一）分批式操作,已用于攪拌式反應(yīng)器或氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細胞，生產(chǎn)單克隆抗體。分批培養(yǎng)雜交瘤和骨髓瘤細胞的周期為3～5天，細胞密度達2～5×10,5,/ml，最大比生長速率大約為0.05 h,-1,。單克隆抗體的產(chǎn)量約10～100 mg/L。在大規(guī)模攪拌反應(yīng)器中，細胞密度較低，最終達5×10,6,，而在750～1500 cm,2,的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)中，細胞密度達1～2×10,8,。,,,(二)流加式操作,最常見的流加物質(zhì)是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物質(zhì)。通過流加控制，可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。,雜交瘤細胞培養(yǎng)，細胞密度可達1.4×10,7,，生產(chǎn)抗體的產(chǎn)量比分批操作提高幾～

64、10倍，可達500 mg/L。,由于培養(yǎng)體積不斷變化，流加對過程的控制能力仍然有限,在實際生產(chǎn)中應(yīng)用少。,,,（三）半連續(xù)式操作,動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常采用。已應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)乙肝表面抗原、tPA等基因工程產(chǎn)物。,半連續(xù)操作特別適用于分泌表達型細胞，如雜交瘤細胞的培養(yǎng)，尤其是微載體系統(tǒng)。,微載體系統(tǒng)培養(yǎng)基因工程CHO細胞，待細胞長滿載體后，反復(fù)收獲細胞的分泌產(chǎn)物乙肝表面抗原，制備乙肝疫苗。,該方式操作簡單，使細胞密度和產(chǎn)量維持在較高水平，能在較長時間內(nèi)進行持續(xù)生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)物，生產(chǎn)效率高，是動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常被采用的方式。,,,（四）連續(xù)式操作,不斷收獲產(chǎn)物，生產(chǎn)中用于非貼壁依賴

65、性細胞培養(yǎng)。,在動物細胞培養(yǎng)中，比生長速率比稀釋速率大。很難建立單一限制性基質(zhì)的衡化培養(yǎng)，需要多種營養(yǎng)物質(zhì)流加。,稀釋速率可從,0,到最大生長速率之間變化，高稀釋速率將帶出細胞。在穩(wěn)態(tài)，抗體的生產(chǎn)可維持幾個星期甚至幾個月。,連續(xù)操作的培養(yǎng)條件穩(wěn)定，抗體處于最佳生產(chǎn)狀態(tài)，可準確控制最優(yōu)化參數(shù)，產(chǎn)率較高，但必須控制培養(yǎng)基的流加速度和液位高度。,,,,（,五）灌流式操作,細胞被截留在反應(yīng)器內(nèi)的連續(xù)操作，是最受推崇的用動物細胞生產(chǎn)藥物的方式。,截留細胞方式：過濾系統(tǒng)有兩種，一種是安裝在反應(yīng)器內(nèi)部或外環(huán)的旋轉(zhuǎn)過濾器，另一種是切線過濾設(shè)備。,灌流體系：,100,％截留細胞，如固定化包埋細胞，可通過中空纖維

66、、平板膜、凝膠顆粒和微囊等實現(xiàn)；部分截留細胞，如使用微載體系統(tǒng)、貼壁系統(tǒng)、分離懸浮系統(tǒng)等實現(xiàn)，其中分離懸浮系統(tǒng)包括使用膜過濾、旋轉(zhuǎn)過濾、離心、重力沉降等分離技術(shù)。,流化床包埋培養(yǎng)人鼠雜交瘤細胞，整個反應(yīng)器有效濃度達,4,×,10,8,/ml,，單位體積產(chǎn)量提高,200,～,300,倍。,,,優(yōu)點：,1,）大大提高了細胞生長密度和產(chǎn)物濃度。,2,）利用培養(yǎng)基，降低細胞代謝廢物，細胞生長良好。,3,）產(chǎn)物為分泌蛋白質(zhì)，滯留時間短，避免了產(chǎn)物的聚合、降解等產(chǎn)量和活性形式的變化，有利于純化。,4,）中空纖維生物反應(yīng)器、固定床或流化床反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器等的唯一可操作方式。,缺點：要求復(fù)雜儀器設(shè)備控制灌流操作過程，由于過濾器容易堵塞，從而限制培養(yǎng)次數(shù)。,,,四、動物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器,（一）轉(zhuǎn)瓶,最早的大規(guī)模培養(yǎng)的反應(yīng)器。結(jié)構(gòu)簡單，操作培養(yǎng)簡便，不進行過程控制。現(xiàn)在主要用于生產(chǎn)疫苗如流行性腮腺炎、風(fēng)診麻疹等或用作種子罐。,（二）攪拌罐反應(yīng)器,其結(jié)構(gòu)與微生物發(fā)酵罐相似。主要區(qū)別：較低的高徑比，滿足細胞對溶解氧的需求；低攪拌轉(zhuǎn)速，大幅傾斜度槳葉或無槳，避免機械傷害；圓形罐底，防止細胞及載體沿體壁的沉積。