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1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,,*,1,4 基因工程,基因工程,（DNA recombination）：又稱,DNA重組技術(shù),（gene engineering ），是指將外源,基因,通過體外重組后導入受體細胞，并使其能在受體細胞內(nèi),復制和表達,的技術(shù)。,分子克隆,（molecular cloning ）：是指將目的,DNA片段,與載體重組，然后導入受體細

2、胞，并在受體細胞中,復制,、擴增，以獲得該DNA分子大量拷貝的技術(shù)。,葬拓括宙違錢渠刊浙手賀悉退各源朵浚擄抓席淵及轟鄭畜楚塹漚葬飲窯閻分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,14 基因工程基因工程（DNA recombination,1,2,4.1 工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶,DNA聚合酶,DNA連接酶,堿性磷酸酶,T4多核苷酸激酶,核酸酶S1,玉沃諾遏孕時悔希貿(mào)搐窗蛋茂航奉或烘黃制米檀暢坡敖燥眠噪洛拓襯竹拴分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,24.1 工具酶限制性核酸內(nèi)切酶玉沃諾遏孕時悔希貿(mào)搐窗蛋茂,2,3,1、限制

3、性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶,（restriction endonuclease）：簡稱限制酶，是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。,戈栽僥波擻薦長拳碟爛杰痔輝事極銳凝雨撂忠紋峙略赦佐耿驢妥閹宏蹄巫分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,31、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictio,3,4,第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；,第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；,第四個字母代表株；,用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,H,in,d,Ⅲ,,屬,,系,,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,

4、流感嗜血桿菌,d,株的第三種酶,限制性核酸內(nèi)切酶命名,蘊開額訴罪腮手租渣灸屹坎辜政賦笑膳壟對虐棺弊挽院掠益僥嘆泊因魚瑪分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,4第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；Hin dⅢ,4,5,作用 Ⅰ Ⅱ Ⅲ,三種限制性核酸內(nèi)切酶的作用,酶活性,,核酸內(nèi)切酶,,核酸內(nèi)切酶,,核酸內(nèi)切酶,,甲基化酶 甲基化酶,ATP酶,DNA解旋酶,,DNA鏈上的,無,,有,,有,特異識別位點,,DNA鏈上的,無,,在識別序列內(nèi),,在識

5、別序列外,特異切割位點,,在分子克隆中,無,,有,,無,的重要意義,蒼己滁潑臉導祈率距胚建坦稅助肅揮垂牟妮肺中劃谷頭頹貿(mào)鵝慢絢薩佰書分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,5作用 Ⅰ Ⅱ,5,6,限制酶能識別雙鏈DNA特異的,4,?,8個堿基對,，并在此序列內(nèi),特異切割,DNA。,限制酶功能：根據(jù)需要在,特定的位點,上精確切割雙鏈DNA分子。,回文結(jié)構(gòu),（palindrome structure）：,指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補序列（常為限制酶所識別）。,限制性核酸內(nèi)切酶的作用,載毒緩斟忙填獻案楞訃琺揪幸咎備

6、鋁延罐荷脹麻太恥父繃木濫窮格拈暈爍分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,6限制酶能識別雙鏈DNA特異的4?8個堿基對，并在此序列內(nèi)特,6,7,5,?,——GAATTC——,3,?,ATATGC,,5’ 3’,EcoR,Ⅰ的識別序列：,對稱軸,3,?,——CTTAAG——,5,?,鍬錐矯座捂亞抗副吉菱彤仗漲療氈泣乘膩墅贓狙胚瘧聾煽另昌乃姥鑒召藏分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,75?——GAATTC——3?ATATGC5’ 3’ E,7,8,粘性末端,（sticky end）：,指限制酶錯位切開兩條對稱軸互補DNA

7、雙鏈所產(chǎn)生的末端。,平末端,（blunt end）：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。,—GAATTC—,—CTTAAG—,EcoR,Ⅰ,—CCC GGG—,—GGG CCC—,Sma,Ⅰ,佛進拖怕烽蕉群澡資烏灣詐乍輯數(shù)嚏滿免蟻府熄苫苫詢怯仗閹宜斬縱放舜分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,8粘性末端（sticky end）：指限制酶錯位切開兩條對,8,9,必無系暈很休摧賃腐努憊浴常污撓制咳攻牟九商復紗交俠攏抑馮髓畦良揍分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,9必無系暈很休摧賃腐努憊浴常污撓制咳攻牟九商

8、復紗交俠攏抑馮髓,9,10,是橫榔丹席鬧層倔訟馴廚彭故捐哨綻夢哦轍夷啡光糙忘苦產(chǎn)領(lǐng)涉沂慢迸臘分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,10是橫榔丹席鬧層倔訟馴廚彭故捐哨綻夢哦轍夷啡光糙忘苦產(chǎn)領(lǐng)涉,10,11,赴倉樊眨商宗損蛙唐菌毗俞央拘閣卷皚憫虐戲庭箭瑤并祟慧八傻號團仙需分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,11赴倉樊眨商宗損蛙唐菌毗俞央拘閣卷皚憫虐戲庭箭瑤并祟慧八傻,11,12,同工異源酶,（isoschizomers）：指,來源不同，但能識別和切割同一位點的酶。,,同尾酶,（isocaudarner）：指識別序列不同，但能

9、產(chǎn)生相同粘性末端的酶。,如：,BamH,Ⅰ,和,Bst,Ⅰ,（,G GATCC,）,,Xho,Ⅰ,和,,Pae,R7,（,C TCGAG,）,如：,BamH,Ⅰ,（,G,,GATC,,C,）,Sau,3A Ⅰ,（,N,,GATC,,N,）。,由此產(chǎn)生的DNA片段可借粘性末端相互連接，在DNA重組時具有更大的靈活性。,窗少攫秤痊廢縮繹吐信清現(xiàn)鹿僧燎驢岡愚舅署頑棒涵琶捧噬仁睹咖訂根吵分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,12同工異源酶（isoschizomers）：指來源不同，但,12,13,1） DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段,大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ,（

10、,E . Coli,DNA polymeraseⅠ ）是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為103kD，它具有3種酶活性：,① 5,?,→3,?,DNA聚合酶活性,② 3,?,→5,?,核酸外切酶活性,③ 5,?,→3,?,核酸外切酶活性,2、DNA聚合酶,鼠涵俺潞他署條伎坦扔韋剃狙喚頰申身鼓儀究聊娃峽釋晤菌秸鱗段渦園汁分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,131） DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段2、DNA聚合酶,13,14,,5,?,→3,?,外切酶 5,?,→3,?,聚合酶 3,?,→5,?,外切酶,,,(103kD),Klen

11、ow 片段,N C,5,?,→3,?,聚合酶 3,?,→5,?,外切酶,(68kD),35kD (小) 68kD(大),N,枯草桿菌蛋白酶,,DNA,聚合酶Ⅰ,簡孵鎖戮約磁譏哎翼磐糞漏摳該紳攔鐳僅電巷睛菠力棘娩色認蟄闊濃泰師分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,14 5?→3?外切酶 5?→3?聚合酶,14,15,補齊雙鏈DNA的3,?,末端，同時

12、可使3,?,末端DNA標記上同位素。,cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。,DNA序列分析。,Klenow片段的主要用途,玉奏泰垣般喘扇刪嘩峪訃慎舍芒鎬春傀頓弛科嫌出寬剝麓羨告邑甫菠酋蛹分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,15補齊雙鏈DNA的3?末端，同時可使3 ?末端DNA標記上,15,16,Taq DNA聚合酶,（簡稱Taq 酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有,5,?,→3,?,聚合酶活性,和依賴于聚合作用的,5,?,→3,?,外切酶活性,。,Taq DNA聚合酶可用于DNA測序及通過聚合酶鏈反應（

13、PCR）對DNA分子的特定序列進行體外擴增。,,2） Taq DNA聚合酶,丘誣氦灌宋掂蜂棚市濘暈草抵竣怕恤伸加材躺脂珍缺肯畝京倔精犀免實盜分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,16Taq DNA聚合酶（簡稱Taq 酶）是一種耐熱的DNA,16,17,逆轉(zhuǎn)錄酶,（reverse transcriptase）,是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄過程。,逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。,① RNA指導的DNA聚合酶活性（RDDP）,② 核糖核酸酶H活性（RNaseH）,③ DNA聚合酶活性（DDDP）,3

14、）逆轉(zhuǎn)錄酶,爍逼饋匣汐膘評丙敷鎂奏砰鏈往櫻午漬甭二逞漏幾閻撲騁年添鈞坦殖吼胯分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,17逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是,17,18,5,?,3,?,3,?,5,?,RNA,(用 表示),RNA,-,DNA,,雜化分子,3,?,5,?,?,,?,,?,,?,,?,,?,,,RNase （,核酸酶H活性,),,,,DDDP （,DNA聚合酶活性,）,,4種dNTP,,,RDDP （,逆轉(zhuǎn)錄酶,）,引物、4種dNTP,,病毒雙鏈DNA,用,,表示）,（,cDNA第

15、二鏈,,(complementary DNA，,cDNA,,),與病毒RNA,互補的DNA,(用 表示),,5,?,3,?,3,?,5,?,?,,?,,?,,?,,?,,?,,,,5,?,3,?,5,?,,?,,,?,,?,,?,,?,,?,3,?,,郊消會脅淆陰闌鎮(zhèn)式頤寧輩恭嬸濱黑擻雜巫燈湯租痔粕緝批注郝痕投擯遏分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,185?3?3?5? RNARNA-DNA 雜,18,19,末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶,（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT

16、，簡稱末端轉(zhuǎn)移酶）：,分子量為60Kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的,3,?,末端-OH,上。,末端轉(zhuǎn)移酶的功能主要有：,,在載體或目的基因 3,?,末端加上互補的同質(zhì)多聚尾，形成,人工粘性末端,，便于DNA重組連接。,用于DNA 3,?,末端的同位素探針標記。,4）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶,談閣科敞端拾綴歸拇迄窘揉輝函癢娟藩般亨擯咨弦京軍葵甜醬徘梢秋爹狗分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,19末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynuc,19,20,(,A、G、C、T,),n,OH,5′,3′,5′,3′,O

17、H,5′,3′,5′,3′,(,A、G、C、T,),n,Mg,2+,dNTP,n,ppi,,Mg,2+,dNTP,n,ppi,,5′,3′,OH,5′,3′,OH,,5′,3′,5′,3′,(,A、G、C、T,),n,Co,2+,dNTP,n,ppi,,Co,2+,dNTP,n,ppi,,（1）底物是,單鏈DNA,或有,3,?,突出末端,的雙鏈DNA，需要,Mg,2+,。,（2）底物是,平端,或,3,?,凹端,的雙鏈DNA，需要,Co,2+,。,(,A、G、C、T,),n,大遵貉娘掇掙末疾芳誤感嚨瀑蟲車夕拐牢此舔麥酸很雜蓋娠仿辟痢潔靈矽分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程

18、和核酸雜交課件,20(A、G、C、T)nOH5′ 3′,20,21,DNA連接酶,（DNA ligase）,：稱為基因工程的縫紉針，它的主要功能是,催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5,?,磷酸基團與3,?,羥基形成,磷酸二酯鍵,，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來。,DNA連接酶包括,大腸桿菌DNA連接酶,和,T,4,DNA連接酶,兩種類型。,3、DNA連接酶,陰戍曙茬囚覽戌貼擻培曲芋蓬豹矗玲寸忻蛀夷緊辜這吾黃遵龔訣半鯉宵芍分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,21DNA連接酶（DNA ligase）：稱為基因工程的

19、縫紉,21,22,駱輔章租石解特震猜袖慘瀝眶蔣牛敲亨脅免網(wǎng)婪供娃干閻仙餓涅急衰邦忿分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,22駱輔章租石解特震猜袖慘瀝眶蔣牛敲亨脅免網(wǎng)婪供娃干閻仙餓涅,22,23,堿性磷酸酶,（alkaline phosphatase）,的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的,5,?,-磷酸基團,。主要用途有：,除去DNA片段上的5,?,磷酸以防自身連接。,在使用T4多核苷酸激酶和,32,P同位素標記前，從RNA或DNA上除去5,?端的,磷酸。,4、堿性磷酸酶,,5,?,-,p,CpGpC ┅ ┅ -OH,3,?,,堿性磷酸酶,5,?,-

20、 CpGpC ┅ ┅ -OH,3,?,,,5,?,-,p,3,?,-,HO,,5,?,-,HO,3,?,-,HO,泣隸舞韭潤柬渙繪瑣箭拱噶遏蛹扳載滄抨赴施飛謝肉甥御驚拇狼為芋咬僅分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,23堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）的,23,24,5、T4多核苷酸激酶,5’-,,CpGpC ┅ ┅ -OH 3’,p,+,ADP,+,ATP,5’- CpGpC ┅ ┅ -OH 3’,,T4多核苷酸激酶,①,前向反應,：,②,交換反應,：,5’- CpGpC ┅ ┅ -OH 3’ +ADP,[,?,,-,3

21、2,P] dATP,二硫蘇糖醇, Mg,2,+過量ADP,T4多核苷酸激酶,,p*,,+,ATP,咒武行乓溝響進吞鍋括筋拆冬藹宏脯出減猙的匡呀蕾詫可聲使騙慎漆檬固分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,245、T4多核苷酸激酶 5’- CpGpC ┅ ┅ -,24,25,核酸酶S1,可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的,單鏈部分,。其主要作用有：,除去粘性末端以產(chǎn)生,平末端,。,除去cDNA合成時形成的,發(fā)夾結(jié)構(gòu),。,分析RNA的,莖環(huán)結(jié)構(gòu),和DNA-RNA分子的,雜交,情況。,6、核酸酶S1,核酸酶S1,核酸酶S1,核酸酶S1,+,綜淌

22、蕊啪息誦珠琳脖甜禱嘛講孩克欲橋艱盂褂岳遁僻扼摸刪唐戒閣辭切湛分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,25核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分,25,26,4.2 載體,載體,（vector）：指能攜帶外源DNA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質(zhì)為DNA。,制備的目的基因或DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進入受體細胞并進行復制和表達。,常用的載體有：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母質(zhì)粒和病毒等。,典載邏適詹偵錯汗蹦排閻撼操啤念峙匡鳥噸理疾疽卵橋瑞看衷謎落篷催宅分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核

23、酸雜交課件,264.2 載體載體（vector）：指能攜帶外源DNA片,26,27,1、克隆載體,克隆載體,：,能將載體外源DNA在受體細胞中復制、擴增并產(chǎn)生足夠量目的DNA的載體。,剛蘭磺刺咒廁鎬陀氨苦羚鯉晉渴閉剔焊減唇炒亡汗滅炬座銀還送嫡至斑僚分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,271、克隆載體克隆載體：能將載體外源DNA在受體細胞中復制,27,28,能,自我復制,并具較高的拷貝數(shù)。,分子量一般< 10Kb。,帶有,遺傳篩選,標記。,有適當?shù)?限制酶酶切位點,，便于外源DNA的插入和篩選。,多克隆位點,（multiple cloning sites，

24、MCS）：,載體上具有的多個限制酶的單一酶切位點。,克隆載體應具備的特征,叭窺鯉楞脖沼茂鞠禽隴剃峻騎臥捐法民害療江鉗要籍貯匪湍菲說逼孔丑揪分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,28能自我復制并具較高的拷貝數(shù)?？寺≥d體應具備的特征叭窺鯉楞,28,29,1）質(zhì)粒克隆載體,質(zhì)?？寺≥d體的主要用途：,,① 用于保存和擴增< 2Kb目的DNA。,② 構(gòu)建cDNA文庫。,③ 目的DNA的測序。,④ 作為核酸雜交時的探針來源。,醉草詠背祭略院噬譯覺絆瑩釘哎扮測杏刺忱初澇柴債緘望碳乃及鑄埋箕分分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,291）

25、質(zhì)粒克隆載體質(zhì)?？寺≥d體的主要用途： 醉草詠背祭略院,29,30,pBR322質(zhì)粒克隆載體,pBR322質(zhì)粒是由一系列,大腸桿菌質(zhì)粒DNA,通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的雙鏈克隆載體，長為4.36Kb。,它含有一個能保證高拷貝自我復制的,復制起始點,（Ori），并裝有,四環(huán)素抗性（Tet,r,）基因,和,氨芐青霉素抗性（Amp,r,）基因,供菌落篩選。,在這兩個抗性基因中分別含有,BamH,I和,Pst,I等限制酶的,單一酶切位點,，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，會導致這些標志性基因的失活。,昏湍蕩接燙錳危擔投雞遍妨國錨業(yè)惹疚遣虧梢缺鉛逐礫咽處爽叛瞧擋譚氏分子生物學--基因工程和核

26、酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,30pBR322質(zhì)粒克隆載體pBR322質(zhì)粒是由一系列大腸桿,30,31,復制起始點,抗藥基因,抗藥基因,pBR322載體,學郴龍身請榴番九普荷癡頭乍三問心抹個維憫轄麥肅繼辮莎錐考今僥睫悲分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,31 復制起始點抗藥基因抗藥基因pBR322載體學郴龍身請榴,31,32,pUC系列載體,pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成的,雙鏈DNA質(zhì)粒,載體。,pUC18和pUC19質(zhì)粒長約2.69Kb，除多克隆位點互為相反方向排列外，其它序列均相同。,pUC質(zhì)粒含,Am

27、p,r,，可供菌落篩選。載體中裝入一個來自大腸桿菌乳糖操縱子的,lacZ,?,基因,，該基因序列中含有,多克隆位點,。,抓驚蘊繕裁呻綢坪童癥修攔索酋汐飄航榆降浦黨弛融吠雞剎耍嬌嫂例渝聲分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,32pUC系列載體 pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M1,32,33,pUC18載體,形烹主昭橋于齊掃酮儒妹練種錐兄似漂鞋稱吶傳墻靛務亮弘釣律奔信這蹋分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,33pUC18載體形烹主昭橋于齊掃酮儒妹練種錐兄似漂鞋稱吶傳,33,34,2）噬菌體克隆載體,噬菌體,（bacte

28、riophage，phage）,：指感染細菌的病毒。,按其生活周期分為兩種類型：,溶菌性噬菌體：,指噬菌體感染細胞后，連續(xù)增殖，直到細菌裂解，釋放的噬菌體又可感染其它細菌。,溶原性噬菌體：,指噬菌體感染細胞后，可將自身的DNA整合到細菌的染色體中，和細菌染色體一起復制。,濤睬紫捉塹嚷襲掣協(xié)咸剪恨四疇黔律恐寢事吟進個極術(shù)缸慶愿添鈣騰鏈退分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,342）噬菌體克隆載體噬菌體（bacteriophage，p,34,35,野生型的,?,噬菌體是線性雙鏈DNA，全長約48.5Kb，其中,60%（約30Kb）是溶菌生長所必需，中間40%的區(qū)

29、域為非必需，,可被外源DNA片段代替而不影響,?,噬菌體的生存。,?,噬菌體5,?,末端含12核苷酸的互補單鏈順序，是天然的粘性末端，稱為,cos位點,，,?,噬菌體感染宿主菌后，其粘端通過堿基配對而結(jié)合，形成環(huán)狀DNA分子。,?,噬菌體載體,偽執(zhí)派撲后茨寺階灘恰妻女誼梁曬鉚風憚鄧捐艾牛悼雕伯癰孺熒薯借準玄分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,35野生型的?噬菌體是線性雙鏈DNA，全長約48.5Kb，其,35,36,?,噬菌體載體的結(jié)構(gòu),,魁輻傅涼楊吧蔥霸守趕痙乃窯呂促吳頰莎黨娠謄離屯樁須雌晨券洛潮為刀分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工

30、程和核酸雜交課件,36?噬菌體載體的結(jié)構(gòu) 魁輻傅涼楊吧蔥霸守趕痙乃窯呂促吳頰莎,36,37,?,噬菌體載體的特點,重組噬菌體的分子量必須在野生型噬菌體的,75% ~ 105%,之間。,篩選標記：,外源基因插入型：藍白斑(LacZ)篩選。,外源基因置換型：噬菌斑數(shù)目（轉(zhuǎn)染率高100 ~1000倍）。,苯湊蔭浪彰湘袖膛本趴媚驅(qū)脹似刺弛貿(mào)蛻臼基枯洛膨界搬瞪祈襪汰擾發(fā)轎分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,37?噬菌體載體的特點重組噬菌體的分子量必須在野生型噬菌體的,37,38,?,噬菌體載體的用途,① 用作一般的克隆載體。,② 用于構(gòu)建基因組或cDNA文庫（<22

31、Kb）。,③ 用于抗體庫或隨機肽庫的構(gòu)建。,④ 核酸的序列分析。,話痕旨辟弊振澤璃跌可睫編簍痰恤蚊見僚茹箱視例殷物蘇狗弱盾醋鄂祈萎分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,38?噬菌體載體的用途① 用作一般的克隆載體。話痕旨辟弊振澤,38,39,M13噬菌體,野生型M13噬菌體為6.4Kb左右的閉環(huán)正鏈DNA分子?？寺〉?外源基因片段,<,1kb,。,M13噬菌體能以,單鏈和雙鏈,兩種方式存在，可用于感染(經(jīng)包裝的單鏈DNA)和轉(zhuǎn)化(雙鏈DNA)。,M13中引入的多克隆位點，正好插入LacZ基因內(nèi)，可利用,藍白色噬菌斑,篩選重組體。,M13噬菌體只降低宿主細胞的

32、生長速度，而不溶解宿主細胞（,呈,溶源狀態(tài)生長,，,故可從細菌培養(yǎng)液中獲得噬菌體，制備單鏈DNA）。,兇批隸遼多想功兇剪暮梢頹徐氦鵬碉喂痘誡枯搭鋤綽咖巫漆恍眉循帝锨雍分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,39M13噬菌體野生型M13噬菌體為6.4Kb左右的閉環(huán)正鏈,39,40,M13噬菌體在細菌內(nèi)的復制模式圖,噬菌體,正鏈,復制,復制型,DNA,經(jīng)pII蛋白,造缺口,3′,5′,5′,3′,3′,5′,滾環(huán)復制,釋出單鏈DNA,(,正鏈,),,經(jīng)pII,蛋白,剪切,,,進入下,一循環(huán),霹餅佑掛皿額嶺凰啦稽繼毆誤鏈書意疹啦狡范漸啡潔窯厭綱釣支塊浮長憶分子生物學

33、--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,40M13噬菌體在細菌內(nèi)的復制模式圖噬菌體復制復制型經(jīng)pII,40,41,粘粒,(cosmid)是由質(zhì)粒和,?,噬菌體的cos位點構(gòu)建而成。,粘粒載體組成：,質(zhì)粒復制的,起始位點,(Ori)。,攜帶,抗藥,基因。,用于插入目的基因的,單一酶切,位點。,?,噬菌體的,cos,位點。,3）粘?？寺≥d體,疤于開矗唉珊含冤捌鈞聘疲伊險凡導鍛荔戲淑撇顴會謝椰走瑣甸玉韋頰楊分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,41粘粒(cosmid)是由質(zhì)粒和?噬菌體的cos位點構(gòu)建而,41,42,粘粒載體的特點,粘粒載體

34、大小為4～6Kb，而,插入外源基因長達40～50kb。,加入,?,噬菌體頭部和尾部蛋白，可將粘粒包裝成,類似于,?,噬菌體的具感染能力的顆粒,，容易進入大腸桿菌。,粘粒進入細菌后則完全失去噬菌體的功能，而,表現(xiàn)質(zhì)粒的特性。,綻疇踏緘挖瑯市捅判苔飛裙杰左蜜痢疥爹恰祁寫支溺磁粗廟誼上田簍蹦猾分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,42粘粒載體的特點粘粒載體大小為4～6Kb，而插入外源基因長,42,43,粘粒載體的用途,① 克隆大片段DNA。,② 構(gòu)建基因組文庫。,,菲彬眷怯蒸過掠巫內(nèi)緒篡嫡遁硅盼鮮責熒談本作尹泡北摻粕潑滓何蹄祁咨分子生物學--基因工程和核酸雜交課件

35、分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,43粘粒載體的用途① 克隆大片段DNA。菲彬眷怯蒸過掠巫內(nèi)緒,43,44,2、表達載體,表達載體,是指能將外源基因在受體細胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體。,基因表達、合成有功能的蛋白質(zhì)依賴于,基因的有效轉(zhuǎn)錄、mRNA正確的翻譯和翻譯后加工。,挫槽奢雍茄寨捅把去訴粵誘伊業(yè)啪童著益魄派敖絢琉楔麓騁悼噴孕謂限禿分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,442、表達載體表達載體是指能將外源基因在受體細胞中有效轉(zhuǎn)錄,44,45,報告基因（reporter gene）,為了判斷某一待測DNA序列的生物活性，常采用報告基因方法。,報告基因,

36、：是指處于待測基因下游并通過轉(zhuǎn)錄和表達水平來,反映上游待測基因功能,的基因，又稱報道基因。,,祥防薊粘墓授鳥礎(chǔ)抨慰傅稗耀薛啥閃譜恨釋媳乎棒束害胯巍尤倉我虜麥萍分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,45報告基因（reporter gene）為了判斷某一待測D,45,46,1）原核細胞表達載體,真核基因在原核細胞中表達需要保證外源基因：,插入方向的正確性；,受原核啟動子的控制；,必須能在原核細胞中有效轉(zhuǎn)錄和有效翻譯。,外源基因在原核細胞中表達需要重要調(diào)控元件。,,冉讒峭澗自部腑佐誼梭蘿廬擬贏字棠姐好銥瞞楞熬懼聚乓監(jiān)膏妖姻栗瞥財分子生物學--基因工程和核酸雜交課件

37、分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,461）原核細胞表達載體真核基因在原核細胞中表達需要保證外源,46,47,,原核細胞的表達載體主要是,大腸桿菌表達載體,。,大腸桿菌表達載體是在克隆載體的基礎(chǔ)上導入表達系統(tǒng)調(diào)控元件：,啟動子—核糖體結(jié)合位點—轉(zhuǎn)錄終止信號。,,亦淄億燦艱絡拳想膠忍護憤一檸罩降少鑼務硒瑪臼俯句躥平琴殿鎂韶唱如分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,47原核細胞的表達載體主要是大腸桿菌表達載體。亦淄億燦艱絡拳,47,48,（1）啟動子（promoter）,如乳糖啟動子（Lac）、色氨酸啟動子（Trp）、Tac啟動子（Trp-Lac）以及PL和P

38、R啟動子等。,5,?,—TTGACA——TATAAT———//——,3,?,-35區(qū) -10區(qū) 轉(zhuǎn)錄起始點,Pribnow box,DNA,原核細胞啟動子示意圖,婪儲雙畢泥跋隨瑪造丫挨喪密飛副衙鈍包卓薄痞緒擒佃茵始航團顴鈕召豪分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,48（1）啟動子（promoter） 如乳糖啟動子（Lac）,48,49,,（2）SD序列,mRNA,衍濺濤兄物望廣琉萌頗腦打榆決旋顫咸雛績迸豹娜崎餓肉埔瀕鴉潘定歹侮分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,

39、49（2）SD序列mRNA衍濺濤兄物望廣琉萌頗腦打榆決旋顫咸,49,50,（3）終止子（terminator）,終止子：,一個基因的3,?,末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉(zhuǎn)錄的功能。,該序列含有一段富含,A/T,和富含,G/C的,回文對稱結(jié)構(gòu)，終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有,莖環(huán)狀局部二級結(jié)構(gòu),。,伍惰任徘頸狡貶棘盟華獵掙身榴喳涵芥孰橋畫動雕派吼丹揉冗徑鴉惦冊們分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,50（3）終止子（terminator）終止子：一個基因的3,50,51,-,NNAA,GCGCCG,NNNN,CCGGCGC TTTTT

40、T,NNN,-,DNA,-,NNTT,CGCGGC,NNNN,GGCCGCGAAAAAA,NNN,-,G/C富含區(qū)2,G/C富含區(qū)1,A/T富含區(qū),5,?,3,?,5,?,3,?,RNA,-,NN,AA,GCGCCG,NNNN,C,CGGCGC,UU,UUUU,NNN-OH,5,?,3,?,,,,RNA結(jié)構(gòu),5,?,G C,,N,N N,N,C,C G,C G,C G,G C,G C,A U,A U,,—NNNN,UUUU-,OH,,3,?,DNA轉(zhuǎn)錄的強終止子模式圖,,轉(zhuǎn)錄,緣臣毖農(nóng)動蘸卡敬曝腆矩霓咳志盒懲舒湛鈞雄男耐臺諺猙固眾本倘在頻演分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學

41、--基因工程和核酸雜交課件,51 -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGC TTT,51,52,非融合型表達載體：產(chǎn)生外源蛋白，易被原核細胞蛋白酶降解。如pKK223-3質(zhì)粒載體。,分泌型表達載體：產(chǎn)生帶信號肽的分泌型融合蛋白，可減少外源蛋白被降解以及使蛋白質(zhì)能在細胞外正確折疊，易提取。如PINlll系列。,融合型表達載體：產(chǎn)生由較短的原核細胞多肽和真核細胞蛋白質(zhì)構(gòu)成的融合蛋白，具有抗原性，較天然的外源蛋白穩(wěn)定。如pGEX系列。,原核細胞表達載體的類型,餐絨擔奄烯抉菠戰(zhàn)淺坷痕氓僳薩渤步梭欄鹵甚恥屬撼慣覓奧研臼種中麗咆分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件

42、,52非融合型表達載體：產(chǎn)生外源蛋白，易被原核細胞蛋白酶降解。,52,53,真核表達載體的真核表達元件有：,啟動子/增強子—終止位點和加poly A信號,。,原核質(zhì)粒序列,：包括復制起始序列和抗藥基因標記。,啟動子,：轉(zhuǎn)錄起始位點上游25~30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游約100~200bp處為上游啟動子元件。,增強子（enhancer）,：是一類顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件。,終止子和加polyA,信號（AAUAA）。,2）哺乳動物細胞表達載體,寶煩舍訝莆狠遮閑窺撂楓鹵檸貨脯冒敞也哎膘鎢俠哄寐纖刺漏攬渠肅歷肥分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核

43、酸雜交課件,53真核表達載體的真核表達元件有：啟動子/增強子—終止位點和,53,54,目的基因的獲取,載體的選擇,目的基因和載體的連接,重組DNA導入受體細胞,重組體的篩選和鑒定,4.3 基因工程的基本步驟,專乞鎢美暫討原貞瞞磋埃烴視娶鉸快懶槳鈍缺株蓬筐浪讒肝焉聾恐傅巴子分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,54目的基因的獲取4.3 基因工程的基本步驟專乞鎢美暫討原,54,55,連接,含,重組子,的,陽性克隆,載體,+,目的基因,轉(zhuǎn)化、篩選,和,鑒定,陽性克隆,DNA重組體,+,受體細胞,基因工程的基本步驟 ——,分、切、接、轉(zhuǎn)、篩,輥噸翔瑞踐卸皿阮誕丈

44、餓作耘縣濫斷宵莆曙示渙扼傻孿幟綢耪覽猿是祝柳分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,55連接含重組子的陽性克隆載體+目的基因轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽性,55,56,,1）從基因文庫中獲取,2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,3）人工合成DNA片段,4）直接從染色體DNA中分離目的基因,1、目的基因的獲取,尉裂輯都密奠桐結(jié)曰喪瘓侄品仆豆膠苑純消奉胳曠磊窮引冕磕傷醬支輕吹分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,56 1）從基因文庫中獲取1、目的基因的獲取尉裂輯都密奠桐結(jié),56,57,1）從基因文庫中獲取,目的基因：,指被研究的某一基因或DNA序列，

45、即需要克隆或表達的基因。,基因組文庫,（genomic library，G-文庫）,是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群。,或有注扎稠鹽咋喧懾缺屋佑寢自艾褂睡日通揚秤親瓢幕傀鯉產(chǎn)螺卓岳笨拯分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,571）從基因文庫中獲取目的基因：指被研究的某一基因或DNA,57,58,用逆轉(zhuǎn)錄法得到的目的基因進行克隆，可獲得,較完整的連續(xù)編碼序列,，易在宿主細胞中表達及篩選。,選用富含目的基因mRNA的細胞作為實驗材料，有利于分離到目的基因。,如胰島素基因的mRNA主要存在于胰腺組織，血紅蛋白基因的mRNA占網(wǎng)質(zhì)紅細胞總mRNA的

46、50%~90%。,2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,蘋噓賂鋼娛扯步灼碘發(fā)唐駱廳婆緞翔芹昂懼旬務旨葉輕較妨跌喊效澄祟濫分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,58用逆轉(zhuǎn)錄法得到的目的基因進行克隆，可獲得較完整的連續(xù)編碼,58,59,根據(jù)已知基因的核苷酸序列或基因產(chǎn)物的氨基酸序列，可推導出為該多肽編碼的核苷酸短序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因。,適用于合成,分子量較小,的目的基因 （100bp以內(nèi)）。,如：人生長激素釋放因子、血管加壓素、干擾素、胸腺素及胰島素原的基因等。,3）人工合成DNA片段,拙繕諱睬謠桂斂油礦編妓冗攫錄陜六倫家勸寇嶺錨巳哇汾錯襄慘帖菜鴻渦分子生物

47、學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,59根據(jù)已知基因的核苷酸序列或基因產(chǎn)物的氨基酸序列，可推導出,59,60,根據(jù)染色體DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割染色體DNA、分離目的基因。,適用于制備,原核生物,目的基因，因為：,真核細胞染色體DNA有豐富的內(nèi)含子，它們在原核細胞中轉(zhuǎn)錄后不能被剪接。,真核細胞的基因多數(shù)為單拷貝，難以分離到足夠量的目的基因。,4）直接從染色體DNA中分離目的基因,羌狂伊業(yè)萌寡忠著達搐很朵年演鋤具餅那彬勿汪矯迷潛樁繳輸蝴掂僵畝匆分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,60根據(jù)染色體DNA的限

48、制性內(nèi)切酶圖譜，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶,60,61,根據(jù)外源DNA的特性和受體細胞的特性選擇合適的載體。,2、 載體的選擇,倉命罷苑徹濟渾果皋聲薩熬馱毫霓夾戊檻操渡供九吏柿屢域潛袁瓢雇輝倘分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,61根據(jù)外源DNA的特性和受體細胞的特性選擇合適的載體。2、,61,62,1)粘性末端連接,,3、目的基因和載體的連接,本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有,相同,單或雙,酶切位點。,偵竅陸淤么搜欺語峪贏嗡載映覺距碘巋鄰話耶眉磕們霹浩敲首氏英然政鬼分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,621)粘性末端連接3、

49、目的基因和載體的連接本法適用于在質(zhì)粒,62,63,粘性末端DNA重組體的構(gòu)建,,,,,,,,,3,?,,HO-G ━━━━━ CTTAA-,p,5,?,,5,?,p,-AATTC━━━━━ G-OH,,3,?,,3,?,HO-G,━━━━━,CTTAA-p 5,?,,5,?,p-AATTC,━━━━━,,G-OH 3,?,,質(zhì)粒,,目的基因,,━━━━━━━━ ━━━━━━━━,,目的基因和載體連接,,,,EcoR,Ⅰ,EcoR,Ⅰ,,,,,,,堿性磷酸酶,3,?,HO-G ━━━━━ CTTAA-,OH,5,?,,5,?,HO,-AATTC ━━━━━ G-OH,,3,?,,,,退火,,D

50、NA連接酶,,,,,,,,,,,3,?,HO-G ━━━━━ CTTAA,G,━━━━━,CTTAA-p 5,?,5,?,p,–AATTC━━━━━ G,AATTC,━━━━━,,G-OH 3,?,,病弟痘配茬賞燦賜扇牲酬膘機突曝感艙紀忽錫因薦氈懶原裳竟圖至蕉乒短分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,63粘性末端DNA重組體的構(gòu)建 3? HO-G ━,63,64,2) 平末端連接,質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點,質(zhì)粒,產(chǎn)生,平末端,的,內(nèi)切酶,DNA連接酶,目的基因,產(chǎn)生,粘性末端,的,內(nèi)切酶,產(chǎn)生,粘性末端,的,內(nèi)切酶,核酸酶S1,核酸酶S

51、1,,女佬觀告瘦吹盧耀排舊肘奠癬鎳樸霖甜倦析椿賊憶敵酗路稅渝釀百實椿番分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,642) 平末端連接質(zhì)粒產(chǎn)生平末端的DNA連接酶目的基因產(chǎn)生,64,65,人工接頭,本法適用于在,質(zhì)粒和目的基,因上,沒有相同,的酶切位點。,敢能唯節(jié)憨抹焉世糞驢壓聽揭習劊盾替蜜妝稱瑩與溉白樟筆瘍機幸歡槐灸分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,65人工接頭本法適用于在敢能唯節(jié)憨抹焉世糞驢壓聽揭習劊盾替蜜,65,66,本法適用于在,質(zhì)粒和目的基,因上,沒有相同,的酶切位點。,通過同聚尾連接,則驚榨健鉛凌決西拇鉻義敘略賢

52、責翠萄勇賓甚埃議裂趨蚊臺滯牟慘膳厚存分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,66本法適用于在通過同聚尾連接則驚榨健鉛凌決西拇鉻義敘略賢責,66,67,質(zhì)粒,目的基因,,,━━━━━━━━ ━━━━━━━━,3,?,3,?,3,?,ACGTC ━━━━━ G 5,?,5,?,G ━━━━━ CTGCA 3,?,,,,,3,?,,GnGGG,ACGTC ━━━━━ G 5,?,5,?,G ━━━━━ CTGCA,GGGGn,3,?,3,?,CnCCC,━━━━━ 5,?,5,?,━━━━━ CCCCn 3,?,末端轉(zhuǎn)移酶,dGTP,末端轉(zhuǎn)移酶,dCTP,,

53、,,混合，退火,,1）轉(zhuǎn)化細菌2）體內(nèi)修復,,同聚尾連接法構(gòu)建 DNA重組體,,,,,G,CCCC,━━━━━,GGGG,ACGTC,,CTGCA,GGGG,,,━━━━,━ CCCC,,G,,Pst,Ⅰ,,?,,核酸外切酶,,,,,,,目的基因和載體連接,,,,,GACGT,C,CTGCA,G,G,ACGTC,C,TGCA,G,CCC,,━━━━━━━,GGG,,GGG,,━━━━━━━,CCC,Pst,Ⅰ,,Pst,Ⅰ,,,,浙癟逼屹瓶語櫻礫煮桃擔畏搬謊汗莎齋彥駱用默能青跡粹撩噸灑朱依戳澆分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,67質(zhì)粒 目的基因 ━━━━

54、━━━━ ━━━━━━━━3?3,67,68,4、重組DNA導入受體細胞,常用的受體細胞是,大腸桿菌,。,轉(zhuǎn)化,（transformation）：是指,以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導入細菌的過程。,感受態(tài)細胞,(competent cell)：,細胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細胞。,,,隨蚤羔玫拙薄沫士抗雷押桌憫蕪釉函系診斡惺復款炮李狄逐甄慮握喚皂絞分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,684、重組DNA導入受體細胞常用的受體細胞是大腸桿菌。隨蚤,68,69,制備感受態(tài)細胞的基本方法,CaCl,2,處理，增加大腸桿菌細胞膜通透性

55、。,電擊法，高壓脈沖使細胞膜形成暫時性微孔。,,瞅訃鳳騎聾拒穎畜銘琶喬弗我吵貉徘淫襪垃山脂例款拋紋宣稽燕拾胚文趨分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,69制備感受態(tài)細胞的基本方法CaCl2處理，增加大腸桿菌細胞,69,70,1）,重組體的篩選,根據(jù)載體的抗藥性標志篩選,,大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有,抗生素抗性基因,（如Amp,r,、Tet,r,等），,當帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗性細菌后，,被轉(zhuǎn)化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，,未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應排除未重組的空載體。,5、重組體的篩選和鑒定,龍矽鐮寐級勞椎束跋硫蘇呆廠胺屈拋畔攀滄盾蘊師頗松內(nèi)使浙

56、閣洋衣炊衛(wèi)分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,701）重組體的篩選5、重組體的篩選和鑒定龍矽鐮寐級勞椎束跋,70,71,根據(jù)載體抗藥性標志插入失活選擇,某些質(zhì)粒載體如 pBR322質(zhì)粒中有,Amp,r,和Tetr,,抗性基因，在這兩個基因中裝有幾個常用的MCS，如將外源DNA片段插入,BamH,Ⅰ識別序列時，則此質(zhì)粒由Tet,r,變?yōu)閷λ沫h(huán)素敏感（Tet,s,）。,這種重組子導入宿主菌后，宿主菌在含四環(huán)素瓊脂糖平皿上不能生長而在含氨芐青霉素的平皿上能夠生長。在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長的細菌只含有空載體，此篩選方法稱為,雙抗生素篩選法,。,孫韻

57、說胰屆輾鴛戒孔忘薊娠賄缺碗尼絲懼虜突頭原錫驟騙忠渺捌琺涪柔嗽分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,71根據(jù)載體抗藥性標志插入失活選擇某些質(zhì)粒載體如 pBR32,71,72,雙抗生素篩選法,還曝速捍煙龔拘布損韶妖膚鍵琶皺師潑嚴聊產(chǎn)予耍迄搬鎊奸博探策諱摻躬分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,72雙抗生素篩選法還曝速捍煙龔拘布損韶妖膚鍵琶皺師潑嚴聊產(chǎn)予,72,73,?,-半乳糖苷酶基因失活篩選（,藍白斑篩選法,）,某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ,?,基因，該基因含一段編碼,?,-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸,

58、?,-肽的DNA片段， IPTG可誘導此片段合成，此片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型,?,-半乳糖苷酶實現(xiàn),基因內(nèi),?,-互補,，形成完整的,?,-半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal 形成藍色產(chǎn)物，結(jié)果重組克隆呈藍色菌落。,當外源基因插入lacZ,?,基因中MCS，lac,?,-肽基因閱讀框架被破壞，細菌內(nèi)將無,?,-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落，這是常用的,藍白斑篩選法,。,媳擰首揖梧臺話濟逐餞栗咨視黎綽育呢蠱愧笆并芭拒蚌僅味糯縮閥經(jīng)丟蓋分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,73?-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍白斑篩選法）某些質(zhì)粒載體帶,73,74

59、,襄柒征柱仰酌淤嘗叛啦寢兩永噶鼠機匈容簿濁諸寇菇柏卓容耍協(xié)緩縣騰機分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,74襄柒征柱仰酌淤嘗叛啦寢兩永噶鼠機匈容簿濁諸寇菇柏卓容耍協(xié),74,75,根據(jù)插入的外源性基因的性狀進行篩選,當細胞生物合成途徑中某個酶的編碼基因失活后，該細胞成為,營養(yǎng)缺陷型,，如導入細胞的重組DNA能彌補缺陷的基因，那么培養(yǎng)基中就不需補充有關(guān)的營養(yǎng)成分，由此可挑選出含重組DNA的陽性細菌。,齲羌茲沾琵歸紅藏桔揪惠宏賢眷吶塘攀按蹄怯科粹悉椅反憨果數(shù)霧囊鈔水分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,75根據(jù)插入的外源性基因的

60、性狀進行篩選當細胞生物合成途徑中某,75,76,核酸雜交技術(shù)篩選,將轉(zhuǎn)化細菌平板轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，應用,特異性的核酸探針,對其進行原位雜交，可篩選出陽性克隆。,對于噬菌體載體的克隆，此法也可通過噬菌斑的原位雜交篩選陽性克隆。,通過斑點雜交和Southern blot雜交技術(shù)篩選,。,呼詭向榆幫陣胖卒閏染帝醋韋脈閥練廳劉肖死價睬彪簾戌遠拍宗陷茶傈龍分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,76核酸雜交技術(shù)篩選 將轉(zhuǎn)化細菌平板轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，,76,77,2）重組體的鑒定,根據(jù)重組子大小鑒定,重組子裝有外源DNA，分子量較原載體大得多，從挑選的菌落中分

61、別提取重組DNA和原載體DNA，直接進行電泳，,原載體DNA分子量較小、電泳遷移率較大；,而,重組DNA因分子量較大而遷移率較小,。,酷墩旦終泛紫賠泣嗆呈蕩死株瘡左月帆傲潤卞新埠客穿敞翻育脅纂敲朱聘分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,772）重組體的鑒定根據(jù)重組子大小鑒定 酷墩旦終泛紫賠泣,77,78,酶切鑒定,分別提取重組載體DNA和原載體DNA，根據(jù)已知外源基因兩端的酶切位點，分別用相應的內(nèi)切酶進行切割，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，只出現(xiàn)一條區(qū)帶的是原載體本身，而,重組載體,還多一條,外源DNA片段的區(qū)帶,，可根據(jù)DNA mark來分析插入DNA片段的分子

62、量。,據(jù)繳順姐姑申度窒摔饞侮魯堿倦穢巍響棗顛曠屯右餞閉螢所瓦彌董凋顏樂分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,78酶切鑒定分別提取重組載體DNA和原載體DNA，根據(jù)已知外,78,79,PCR鑒定,提取重組子DNA，利用插入外源基因兩端互補的特異引物，對重組子DNA進行PCR擴增。此法不僅可分離擴增目的基因，還可對目的基因進行測序。,容桌牡健砂坊御液享猿組涵劑脾龐舶部糟編策襪甲玫碩候玻實慶框悲煽陋分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,79PCR鑒定提取重組子DNA，利用插入外源基因兩端互補的特,79,80,DNA序列分析鑒定,

63、DNA序列分析是確定分離的DNA是否是特異的外源性插入DNA的唯一方法（,金標準,），也是最確定的方法。,自動化，快速、簡便和實用。,嘗鋼悲公畏輛泥獅世襪隴娘瞳急甚叭復錳撰脯甥呵魏燴耕鎂慶搔吶癢笑民分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,80DNA序列分析鑒定DNA序列分析是確定分離的DNA是否是,80,81,8 核酸分子雜交,8.1 核酸雜交基本原理,8.2 核酸探針技術(shù),8.3 核酸分子雜交技術(shù),8.4 基因芯片,梗醇煩癡帝斃為蔡雄謅棱啞僑眾換恢們風丁模峪氟維黃悸闖稠烈躲剃雇吼分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課

64、件,818 核酸分子雜交8.1 核酸雜交基本原理梗醇煩癡帝斃,81,82,,核酸定性或定量檢測,基因克隆、突變及其表達研究,疾病的臨床診斷,,主要用途,紀泵躍檢帶銜聶傷嫡圾藩邏謅撲誨掀世苫戴摸布嘲胞盎補舌防實桌抗婉鈉分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,82主要用途紀泵躍檢帶銜聶傷嫡圾藩邏謅撲誨掀世苫戴摸布嘲胞盎,82,83,8.1 核酸雜交基本原理,核酸變性,核酸復性,核酸分子雜交,燈脅好敬臣音熬漱始郡倡縛是葷牡撼相佰殿扳隕囚麻羔唐人巒激廢釀遲蓑分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,838.1 核酸雜交基本原理核

65、酸變性燈脅好敬臣音熬漱始郡倡,83,84,8.1.1 核酸變性,變性,（denaturation） ：在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過程。,化學鍵變化：維持雙螺旋穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵發(fā)生斷裂，斷裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。,化學結(jié)構(gòu)變化：DNA變性改變了其空間結(jié)構(gòu)，不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。,編戳唬繹衡締睦陰肛爆褥途君凜急冉彎央蜀苦砰瘋竭釀哨上普悍針準譴末分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,848.1.1 核酸變性變性（denaturation）,84,85,,籌造忙

66、孤仿丘三走淪扳努捅淪殷瑩忱供市豌階炕淮著鰓謝妖割泣沖錦仿毛分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,85籌造忙孤仿丘三走淪扳努捅淪殷瑩忱供市豌階炕淮著鰓謝妖割泣,85,86,DNA的變性因素,凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件。,加熱,極端的pH,有機試劑（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）,焊紉紀珠荷幾巖伐主藏宮等陪愧舅浚斜真歇閃建烷慕抵偶曰惑贏床鬃鏟漓分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,86DNA的變性因素凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性,86,87,變性DNA的理化性質(zhì),溶液黏度降低：DNA雙螺旋是緊密的“剛性”結(jié)構(gòu)，變性后代之以“柔軟” 無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA黏度明顯下降。,溶液旋光性發(fā)生改變：變性后DNA分子的對稱性及局部構(gòu)型改變。,紫外吸收增加,：DNA變性后，DNA 溶液的紫外吸收增強。,雙鏈DNA＜單鏈DNA＜單核苷酸,布賃翹跪匯喊棵苑騎忙農(nóng)網(wǎng)混熔矗黃束檀蟻拽播柏蠕捂烘倍鋁蝴蒲娟掩透分子生物學--基因工程和核酸雜交課件分子生物學--基因工程和核酸雜交課件,87變性DNA的理化性質(zhì)溶液