《分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論概要和常用實(shí)驗技術(shù)簡介課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論概要和常用實(shí)驗技術(shù)簡介課件（90頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,,,*,,20210426,分子生物學(xué)根底,理論概要和常用實(shí)驗技術(shù)簡介,,分子生物學(xué)根底,1,報告主要內(nèi)容,分子生物學(xué)概要,幾個分子生物學(xué)理論知識點(diǎn),常用分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù),生物信息學(xué)簡介,,報告主要內(nèi)容分子生物學(xué)概要,2,一、什么是分子生物學(xué)？,二、分子生物學(xué)內(nèi)容和原理,三、主要的理論成就,四、主要的應(yīng)用成就,五、技術(shù)進(jìn)步,分子生物學(xué)概要,,一、什么是分子生物學(xué)？分子生物學(xué)概要,3,一、什么是分子生物學(xué)？,從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)根底的學(xué)科。研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)的性質(zhì)和變化以及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象

2、的關(guān)系，如遺傳信息的傳遞，基因的構(gòu)造、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的生理功能，以及細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。,分子生物學(xué)概要,,一、什么是分子生物學(xué)？分子生物學(xué)概要,4,①核酸的分子生物學(xué),研究內(nèi)容包括核酸/基因組的構(gòu)造、遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯，核酸存儲的信息修復(fù)與突變，基因表達(dá)調(diào)控和基因工程技術(shù)的開展和應(yīng)用等。,②蛋白質(zhì)的分子生物學(xué),蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)研究執(zhí)行各生命功能的主要分子──蛋白質(zhì)的構(gòu)造與功能。,③信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué),研究細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間信息傳遞的分子根底。在一些外源信號的刺激下，細(xì)胞可以將這些信號轉(zhuǎn)變一系列的生物化學(xué)變化，例如蛋白質(zhì)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變、磷酸化以及蛋白與蛋白相互作用的變化

3、等，從而使其增殖、分化及分泌狀態(tài)等發(fā)生改變以適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的需要。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的目標(biāo)是說明這些變化的分子機(jī)理，明確每一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與傳遞的途徑及參與該途徑的所有分子的作用和調(diào)節(jié)方式以及認(rèn)識各種途徑間的網(wǎng)絡(luò)控制系統(tǒng)。,二、分子生物學(xué)內(nèi)容和根本原理,,①核酸的分子生物學(xué)二、分子生物學(xué)內(nèi)容和根本原理,5,根本原理：,①構(gòu)成生物體各類有機(jī)大分子的單體在不同生物中都是一樣的。,②大分子建成規(guī)那么一樣。,③某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定 了它的屬性。,,根本原理：,6,三、主要的理論成就,1、DNA雙螺旋模板學(xué)說,2、遺傳中心法那么,3、基因表達(dá)調(diào)控理論,〔操縱子模型〕,4、基因?qū)W說的豐富和開展,

4、〔基因現(xiàn)代概念確實(shí)立〕,5、基因突變理論,6、基因作圖理論,7、分子進(jìn)化學(xué)說,8、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)說,9、細(xì)胞周期調(diào)控理論,10、癌變的分子機(jī)制,11、通用遺傳密碼字典與,非通用遺傳密碼字典,12、生物信息學(xué),13、基因組學(xué)與比較基因,組學(xué),14、“RNA世界〞假說,15、細(xì)胞衰老和程序化死,亡機(jī)理,,三、主要的理論成就1、DNA雙螺旋模板學(xué)說9、細(xì)胞周期調(diào)控理,7,〔1〕已用基因工程的技術(shù)研制出了一批珍貴的基因工程藥物：,①人生長抑素,②生產(chǎn)胰島素,③生產(chǎn)生長激素,④生產(chǎn)組織型血纖維蛋白溶酶原激活因子,⑤抗血友病因子Ⅳ,⑥制備乙型肝炎疫苗,⑦生產(chǎn)多種細(xì)胞因子,⑧制備基因工程抗體,1、在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

5、成就,三、主要的理論成就,,〔1〕已用基因工程的技術(shù)研制出了一批珍貴的基因工程藥物：1,8,〔2〕基因診斷與基因治療,① 疾病診斷：遺傳病、腫瘤、病毒感染的診斷，具有特異,性高，適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，常用方法有核酸雜交、RFLP、,PCR、DNA指紋圖譜,② 法醫(yī)診斷、親子鑒定,③ 基因治療：方法有將目的基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒重組、轉(zhuǎn)染,受體細(xì)胞，使之表達(dá)以彌補(bǔ)缺陷；將目的基因?qū)θ旧w,進(jìn)展定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。,,〔2〕基因診斷與基因治療,9,〔2〕基因診斷與基因治療,① 疾病診斷：遺傳病、腫瘤、病毒感染的診斷，具有特異,性高，適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，常用方法有核酸雜交、RFLP、,PCR、D

6、NA指紋圖譜,② 法醫(yī)診斷、親子鑒定,③ 基因治療：方法有將目的基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒重組、轉(zhuǎn)染,受體細(xì)胞，使之表達(dá)以彌補(bǔ)缺陷；將目的基因?qū)θ旧w,進(jìn)展定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。,,〔2〕基因診斷與基因治療,10,,,,,,(Southern/Northern/Western/FISH),6.基因克隆、基因文庫,,,,,,,,,,五、技術(shù)進(jìn)步,,五、技術(shù)進(jìn)步,11,五、技術(shù)進(jìn)步,,,,,,(Southern/Northern/Western/FISH),6.基因克隆、基因文庫,,,,,,,,,,,五、技術(shù)進(jìn)步,12,,,,,,,,,,,,,,,,,分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論概要和常用實(shí)驗技術(shù)簡

7、介課件,13,相關(guān)根底分子生物學(xué)理論,一、基因及基因突變,二、生物信息的傳遞〔中心法那么〕,三、真核基因的表達(dá)與調(diào)控,,相關(guān)根底分子生物學(xué)理論一、基因及基因突變,14,1、,關(guān)于基因的概念,基因的概念隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域的開展而不斷完善。從遺傳學(xué)的角度看，基因是生物的遺傳物質(zhì)，是遺傳的根本單位——突變單位、重組單位和功能單位；從分子生物學(xué)的角度看，基因是負(fù)載特定遺傳信息的DNA分子片段，在一定條件下能夠表達(dá)這種遺傳信息，變成特定的生理功能。有的生物基因為RNA。,,1、關(guān)于基因的概念 基因的概念隨著遺傳學(xué)、,15,2、從分子水平來說，基因有三個根本特性：,①

8、基因可自體復(fù)制；,②基因決定性狀，即基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯決定多肽鏈的氨基酸順序，從而決定某種酶或蛋白質(zhì)的性質(zhì)，而最終表達(dá)為某一性狀,③基因的突變，即基因雖很穩(wěn)定，但也會發(fā)生突變。一般來說，新的突變的等位基因一旦形成，就可通過自體復(fù)制，在隨后的細(xì)胞分裂中保存下來。,,2、從分子水平來說，基因有三個根本特性：,16,3、基因的功能類型,?．構(gòu)造基因〔structural gene〕是可編碼RNA或蛋白質(zhì)的一段序列。構(gòu)造基因的突變可導(dǎo)致特定蛋白質(zhì)〔或酶〕一級構(gòu)造的改變或影響蛋白質(zhì)〔或酶〕量的改變。,?. 調(diào)控基因〔regulator and control gene〕是指其產(chǎn)物參與調(diào)控其他構(gòu)造基因表

9、達(dá)的基因。調(diào)控基因的突變可以影響一個或多個構(gòu)造基因的功能，或?qū)е乱粋€或多個蛋白質(zhì)〔或酶〕時的改變。,?.重疊基因〔overlapping gene) 指同一段DNA的編碼順序，由于閱讀框架的不同或終止早晚的不同，同時編碼兩個或兩個以上多肽鏈的基因。,基因在染色體上可能有重疊，甚至一個基因完全存在于另一個基因內(nèi)部。,,3、基因的功能類型?．構(gòu)造基因〔structural gen,17,④斷裂基因或隔裂基因〔split gene),指一個構(gòu)造基因內(nèi)部為一個或者更多的不翻譯的編碼順序。,外顯子：參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段；,內(nèi)含子：不參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段。,有的真核生物基因可能是不同外顯子的組

10、合——斷裂基因。,真核生物基因的典型構(gòu)造,,④斷裂基因或隔裂基因〔split gene),指一個構(gòu)造基因,18,⑤跳躍基因(jumping gene)又稱為轉(zhuǎn)座(transposon)、轉(zhuǎn)座因子、轉(zhuǎn)位因子(transposable element)，指可作為插入因子和轉(zhuǎn)座因子移動的DNA序列。,,⑥假基因〔pseudogene〕，同的基因相似，但位于不同位點(diǎn)，因缺失或突變而不能轉(zhuǎn)綠或翻譯，是沒有功能的基因。,,,⑤跳躍基因(jumping gene)又稱為轉(zhuǎn)座(trans,19,◆基因突變(gene mutation)：染色體上某一基因位點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了化學(xué)性質(zhì)(構(gòu)造)的變化，與原來基因形成對性關(guān)

11、系。,例如：植物高稈基因D突變?yōu)榘捇騞。,經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為：基因是一個“點(diǎn)〞，在染色體上具有一定的位置和相互排列關(guān)系。而基因突變就是一個點(diǎn)的改變，是以一個整體進(jìn)展突變。因此從經(jīng)典遺傳學(xué)水平看，基因突變又稱為“點(diǎn)突變〞(point mutation)。,◆locus與site,現(xiàn)代基因概念認(rèn)為：基因是DNA分子帶有遺傳信息的堿基序列；基因是由眾多堿基對構(gòu)成，此時將一個堿基對稱為基因的一個座位(site)；基因在染色體上的位置那么稱為位點(diǎn)(locus)。,4、基因突變,人的自然突變頻率為： 1×10-4～1×10-6。,,◆基因突變(gene mutation)：染色體上某

12、一基因位,20,5、 基因突變的類型,①根據(jù)基因構(gòu)造的改變方式：,堿基替換突變；,堿基倒位；,移碼(插入與缺失)突變,,②,根據(jù)突變所引起的表型改變分為：,形態(tài)突變型；,生化突變型；,致死突變型；,條件致死突變型,③從DNA堿基序列改變的多少：,單點(diǎn)突變(替換)；與經(jīng)典遺傳學(xué)的點(diǎn)突變point mutation比較.,多點(diǎn)突變(移碼)。,,5、 基因突變的類型①根據(jù)基因構(gòu)造的改變方式：②根據(jù)突變所引,21,④從突變所引起的遺傳信息意義的改變：,,錯義突變〔missense mutation〕:是指DNA分子中堿基改變后引起密碼子變化。導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生替代，從而影響蛋白質(zhì)功能，以至影響到

13、突變體的表型。,,無義突變〔nonsense mutation〕:是指由于DNA的堿基改變導(dǎo)致編碼氨基酸的密碼子突變成終止密碼子。引起mRNA 翻譯提前終止，產(chǎn)生一條短的不完整的多肽鏈。無義突變通常對所編碼的蛋白活性有嚴(yán)重影響。,,,④從突變所引起的遺傳信息意義的改變：,22,同義突變(沉默突變 silent mutation〕:是指DNA分子中的堿基改變后，突變的密碼子仍然編碼原來的氨基酸，并沒有引起多肽鏈中氨基酸的變化。,不會引起表型突變，它們以多態(tài)的形式在生物體DNA中積累，引起同種生物不同個體間DNA序列的變化。,,延長肽鏈突變： 終止密碼子突變成氨基酸的密碼子。,,同義突變(沉默突變

14、 silent mutation〕:是指D,23,1、中心法那么及其開展,中心法那么(central dogma)闡述生物世代、個體以及從遺傳物質(zhì)到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質(zhì)復(fù)制、性狀表現(xiàn)過程中的信息流向。,最初由Crick提出，并經(jīng)過了屢次修正。,,1、中心法那么及其開展中心法那么(central dogma,24,,反轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄)：,反轉(zhuǎn)錄酶；,cDNA。,RNA的自我復(fù)制。,DNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。,,,分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論概要和常用實(shí)驗技術(shù)簡介課件,25,2、遺傳密碼及其特性,,三聯(lián)性；,非重疊性；,連續(xù)性；,簡并性；,有序性；,通用性。,遺傳密碼的根本特性：,,2、遺傳密

15、碼及其特性遺傳密碼的根本特性：,26,起始密碼子與終止密碼子：,起始密碼子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；,終止密碼子(無義密碼子)：UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(蛋白石)。,通用性的另外情況：,,2、遺傳密碼及其特性,,起始密碼子與終止密碼子：2、遺傳密碼及其特性,27,三、真核基因的表達(dá)調(diào)控,①誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄的信號、②基因調(diào)控在哪一步(模板DNA的轉(zhuǎn)錄、mRNA的成熟或蛋白質(zhì)合成) 實(shí)現(xiàn)③不同水平基因調(diào)控的分子機(jī)制是研究基因調(diào)控的三個主要內(nèi)容。,,a DNA水平的基因表達(dá)調(diào)控,b,轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控,,c,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控,,d,翻譯水平的基因表達(dá)調(diào)控,三個主要

16、內(nèi)容：,,三、真核基因的表達(dá)調(diào)控 ①誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄的信號、②基因調(diào),28,1. 真核生物基因組構(gòu)造特點(diǎn),〔1〕基因組大，基因多，存在大量重復(fù)序列，大局部與組蛋白和非組蛋白結(jié)合在一起；,〔2〕基因主要以單順反子形式存在；,〔3〕多數(shù)基因是斷裂的；,〔4〕存在基因家族；,〔5〕基因表達(dá)的調(diào)控位點(diǎn)多，位置多樣化；,〔6〕局部基因組序列存在重排、擴(kuò)增、喪失等規(guī)律性變化。,,1. 真核生物基因組構(gòu)造特點(diǎn)〔1〕基因組大，基因多，存在大量,29,2,,轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控,,2.1,順式作用元件,2.2,反式作用因子,,2.3,真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要模式,,2 轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控 2.1 順

17、式作用元件,30,2.1 順式作用元件,2.1.1 根本概念,2.1.2 順式作用元件的分類,,2.1 順式作用元件2.1.1 根本概念,31,2.1.1 根本概念,順式作用元件(,cis,-acting elements),,基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。,順式作用(,cis,-acting ),順式作用元件對基因表達(dá)起調(diào)控作用的過程。,,2.1.1 根本概念順式作用元件(cis-acting el,32,2.1.2 順式作用元件的分類,〔1〕啟動子,〔2〕增強(qiáng)子,〔3〕絕緣子,〔4〕轉(zhuǎn)座子,〔5〕其他應(yīng)答元件,,2.1.2 順式作用元件的分類〔1〕啟動子

18、,33,〔1〕啟動子(Promoter),① 定義,②,作用特點(diǎn),③ 作用機(jī)制,④ 分類,,〔1〕啟動子(Promoter)① 定義,34,,① 定義,位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近且為轉(zhuǎn)錄起始所必需的DNA序列。,,② 作用特點(diǎn),,,一個基因可同時擁有一個及以上啟動子；,,位置不定，一般在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游；,,,可與增強(qiáng)子共同控制轉(zhuǎn)錄起始和強(qiáng)度；,,,發(fā)揮功能時除需RNA聚合酶外，還需轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與啟動子,區(qū)各種調(diào)控元件相互作用。,,,① 定義,35,③ 作用機(jī)制,通過直接與RNA聚合酶相互作用，或結(jié)合于啟動子關(guān)鍵元件上的蛋白質(zhì)因子與RNA聚合酶的直接或間接作用，使得RNA聚酶處于適于轉(zhuǎn)錄起始的

19、位置，從而利于轉(zhuǎn)錄起始。,④ 分類,,細(xì)胞特異啟動子,,誘導(dǎo)型啟動子,,通用啟動子,,③ 作用機(jī)制,36,〔2〕增強(qiáng)子(enhancer),① 定義,② 作用特點(diǎn),③ 作用機(jī)制,④ 分類,,〔2〕增強(qiáng)子(enhancer)① 定義,37,① 定義,,指位于離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)較遠(yuǎn)位置上，具有參與激活和增強(qiáng)起始功能的序列元件。,② 作用特點(diǎn),,增強(qiáng)效應(yīng)顯著；,,增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)；,,要有啟動子才能發(fā)揮作用；,,須與特定蛋白質(zhì)因子結(jié)合才能發(fā)揮作用；,,一般具有組織或細(xì)胞特異性；,,無基因?qū)Ｒ恍浴?,① 定義,38,③ 增強(qiáng)子的作用機(jī)制,通過提高啟動子附近激活劑濃度而起作用。當(dāng)它被約束在啟動子附

20、近時，可在任何位置起作用。,三種可能的作用方式：, 可影響模板附近的DNA雙螺旋構(gòu)造；, 將模板固定在細(xì)胞核內(nèi)特定位置；, 增強(qiáng)子區(qū)可以作為反式作用因子或RNA聚合酶Ⅱ進(jìn)入染色質(zhì)特定構(gòu)造的入口。,④ 增強(qiáng)子的種類, 細(xì)胞特異性增強(qiáng)子 誘導(dǎo)性增強(qiáng)子, 通用增強(qiáng)子,,③ 增強(qiáng)子的作用機(jī)制,39,一種負(fù)調(diào)控元件，參與基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。其作用可不受序列方向影響，能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用。,〔3〕絕緣子(Insulator),〔4〕轉(zhuǎn)座子〔transposon〕,能將自己插入基因組中新的位置的DNA序列。,,一種負(fù)調(diào)控元件，參與基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。其作用可不受序列方,40,反式作用因子(trans-acting

21、 factor),一種基因的RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物，能影響位于基因組另一條染色體上的〔或基因組別處的〕另一個基因的活性。,反式作用(trans-acting),反式作用因子對基因表達(dá)起調(diào)控作用的過程。,2.2.1 根本概念,,反式作用因子(trans-acting factor)2.2,41,2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子的類型,〔1〕根本轉(zhuǎn)錄因子(Basal factor),和RNA聚合酶一起結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和TATA盒；,〔2〕激活劑(activator),特異性識別短共有序列元件的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)合于啟動子或增強(qiáng)子位點(diǎn)上。通過增加根本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(basal apparatus) 結(jié)合于啟動子的效率而起

22、作用；,〔3〕輔激活劑(coactivator),連接了激活劑和根本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體；,〔4〕一些調(diào)節(jié)因子(Some regulators),可使染色質(zhì)構(gòu)造改變。,,2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子的類型〔1〕根本轉(zhuǎn)錄因子(Basal,42,2.3 真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模式,,2.3.1,RNA聚合酶Ⅰ的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子,2.3.2,RNA聚合酶Ⅲ的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子,2.3.3,RNA聚合酶 Ⅱ的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子,,2.3 真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模式 2.3.1 RN,43,酶,主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,RNA聚合酶Ⅰ,rRNA，大多數(shù)snRNA,RNA聚合酶Ⅱ,mRNA前體，部分snRNA,RNA聚合酶Ⅲ,tR

23、NA、部分snRNA,真核細(xì)胞細(xì)胞核中共有3類RNA聚合酶,,酶主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA聚合酶Ⅰ rRNA，大多數(shù)snRNAR,44,,RNA聚合酶Ⅰ的啟動子由一個核心啟動子 (core promoter) 和一個上游控制元件 (upstream control element, UCE) 組成。,2.3.1 RNA聚合酶Ⅰ的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子,,RNA聚合酶Ⅰ的啟動子由一個核心啟動子 (core,45,2.3.2 RNA聚合酶Ⅲ的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子,RNA聚合酶Ⅲ識別的啟動子分為兩類：,? 5S RNA和tRNA基因的啟動子位于基因內(nèi)部(起始點(diǎn)下游)，稱內(nèi)部啟動子(internal promot

24、er) ；,? 核小RNA〔snRNA〕基因的啟動子那么位于起始點(diǎn)上游，與其他常規(guī)啟動子的作用方式一樣。,,2.3.2 RNA聚合酶Ⅲ的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子 RNA,46,2.3.3 RNA聚合酶 Ⅱ的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子,RNA聚合酶Ⅱ的啟動子構(gòu)造復(fù)雜，且序列變化很大，與轉(zhuǎn)錄啟動有關(guān)的位點(diǎn)包括4個部位：,⑴ 帽子位點(diǎn)〔轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)〕，其堿基大多為A；,⑵ -25附近的TATA框；,⑶ -75附近的CAAT框；,⑷ -100以上的遠(yuǎn)上游序列，即增強(qiáng)子。,轉(zhuǎn)錄要起始，需很多的轉(zhuǎn)錄因子參與。,,2.3.3 RNA聚合酶 Ⅱ的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子 RNA,47,3 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控,3.

25、1 RNA的不同剪接和編輯使同一基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生出不同的蛋白質(zhì),3.2 RNA的切割和加polyA改變基因編碼的蛋白質(zhì),3.3 RNA從核中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)的過程受控制,,,3 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控3.1 RNA的不同剪接和,48,基因操作,也稱,重組DNA技術(shù),，主要包括DNA分子的切割與連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、凝膠電泳、核酸分子雜交、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。,基因工程是指在體外將核酸分子插入各種載體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之進(jìn)入新的寄主細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)展持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。,,常用分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù),兩個概念,,基因操作

26、也稱重組DNA技術(shù)，主要包括DNA分子的切割與連接、,49,主要內(nèi)容,一、 重組DNA技術(shù),二、DNA的根本操作,三、 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄,,主要內(nèi)容一、 重組DNA技術(shù),50,一、什么是重組DNA技術(shù)？,1、重組DNA技術(shù)〔Recombinant DNA Technique〕,又稱為基因克隆〔Gene Cloning〕或分子克隆〔Molecular Cloning〕技術(shù)。是按照人們意愿，在體外對DNA分子進(jìn)展重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA的大量拷貝。,重組DNA技術(shù)包括了一系列的基因操作步驟。,,一、什么是重組DNA技術(shù)？1、重組DNA技術(shù)〔Reco

27、mbi,51,2、重組DNA技術(shù)的根本步驟,①目的DNA的獲得與載體的制備；,②目的DNA與載體的連接；,③重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；,④重組DNA的篩選和鑒定；,⑤目的DNA的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測與別離純化。,,2、重組DNA技術(shù)的根本步驟 ①目的DNA的獲得與載體的制備,52,3、載體應(yīng)當(dāng)具備的條件,〔1〕能自主復(fù)制。容易獲得大量的重組的DNA分子；,〔2〕具有適宜的外源DNA插入的位點(diǎn)〔克隆位點(diǎn)或限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)〕。便于接納不同的DNA片段。,〔3〕具備可供選擇的遺傳標(biāo)記。便于進(jìn)展重組體篩選和鑒定。,〔4〕載體本身應(yīng)盡量小。不含或盡量少含多余的DNA局部，這樣可以容納較大的外源DNA。,

28、〔5〕在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性高。,,3、載體應(yīng)當(dāng)具備的條件〔1〕能自主復(fù)制。容易獲得大量的重組的,53,,,,,多克隆位點(diǎn),,,,,,Ori,復(fù)制起始點(diǎn),遺傳標(biāo)記,Amp,,MCS,載體,,多克隆位點(diǎn)Ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記AmpMCS載體,54,4、工具酶,我們的根本目的是：把外源基因與載體連接在一起形成重組DNA分子，最少需要以下兩類工具酶：,①、準(zhǔn)確切割DNA分子的工具〔“分子手術(shù)刀〞〕,------限制性內(nèi)切酶,②、DNA片段的連接工具〔“分子縫合針〞〕,------DNA連接酶,,4、工具酶 我們的根本目的是：把外源基因與載體,55,①、限制性核酸內(nèi)切酶------ “分

29、子手術(shù)刀〞,限制性核酸內(nèi)切酶〔Restriction Endonuclease, RE〕：,是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶。,,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,,+,Bam,HⅠ,分類:,I、II、III〔重組DNA技術(shù)中常用II型〕,,①、限制性核酸內(nèi)切酶------ “分子手術(shù)刀〞限制性核酸內(nèi),56,識別序列特點(diǎn)—— 回文構(gòu)造(palindrome),即反向重復(fù)構(gòu)造，以DNA分子中某一處為軸，其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對稱的序列。,每種限制性內(nèi)切酶都有一個它所識別、結(jié)合并切割的特異序列，稱為限制性位點(diǎn)或切點(diǎn)〔4~8bp〕。,識別序列：,

30、,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,HⅠ,,識別序列特點(diǎn)—— 回文構(gòu)造(palindrome),57,,Bam,HⅠ,CCC,GGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Sam,I,CCCGGG,GGGCCC,GGG,CCC,+,平末端〔Blunt end〕：,對稱軸切割,粘性末端〔Sticky end〕：,交織切割,切口：,平端切口、粘端切口,,,Bam HⅠCCCGGATCC+GGATCCSam ICCC,58,幾個常用限制性內(nèi)切酶及其切點(diǎn),,幾個常用限制性內(nèi)切酶及其切點(diǎn),59,②、DNA連接酶------ “分子縫合針〞,DNA連接酶〔DNA L

31、igase〕：,催化兩條DNA鏈的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵而把兩個DNA分子連接在一起。例如:T4 DNA連接酶。,,②、DNA連接酶------ “分子縫合針〞DNA連接酶〔D,60,外源基因與載體的連接方式：,〔1〕粘性末端連接,方式：,① 同一限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的連接,②不同限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的連接,,,,外源基因與載體的連接方式：〔1〕粘性末端連接方式：① 同一限,61,〔2〕平端連接,適用于：,① 限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生的平端,② 粘端經(jīng)特殊酶處理變?yōu)槠蕉?,,〔2〕平端連接適用于：① 限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生的平端,62,〔四〕宿主細(xì)胞,大腸桿菌,酵母,昆蟲細(xì)胞,哺乳動物細(xì)胞,

32、1、常用種類,2、導(dǎo)入方式,轉(zhuǎn)化〔transformation〕,轉(zhuǎn)染〔transfection〕,轉(zhuǎn)導(dǎo)〔transduction〕,,〔四〕宿主細(xì)胞大腸桿菌1、常用種類2、導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化〔tran,63,DNA的根本操作技術(shù),〔Techniques for DNA Manipulation〕,一、核酸的凝膠電泳,二、細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖,,DNA的根本操作技術(shù)〔Techniques for DNA,64,一、核酸的凝膠電泳,核酸凝膠電泳是重組DNA技術(shù)的核心技術(shù)之一，它可以按分子量大小對DNA或RNA進(jìn)展別離。因此，可用于別離、鑒定和純化DNA或RNA片段，也是許多分子生物學(xué)研究方法

33、，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析、凝膠回收等等一系技術(shù)的技術(shù)根底。,,一、核酸的凝膠電泳 核酸凝膠電泳是重組DNA技,65,一、核酸的凝膠電泳,核酸凝膠電泳是重組DNA技術(shù)的核心技術(shù)之一，它可以按分子量大小對DNA或RNA進(jìn)展別離。因此，可用于別離、鑒定和純化DNA或RNA片段，也是許多分子生物學(xué)研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析、凝膠回收等等一系技術(shù)的技術(shù)根底。,,一、核酸的凝膠電泳 核酸凝膠電泳是重組DNA技,66,常用的核酸凝膠電泳有瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳〔PAGE〕。可以

34、在水平或垂直的電泳槽中進(jìn)展。,,常用的核酸凝膠電泳有瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳和聚丙烯,67,瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2-50 kb之間。,聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1-1, 000 bp之間。,凝膠濃度的上下影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。,,瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2-50 kb之間。,68,瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力,,,,,,瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力,69,二、細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖,細(xì)菌轉(zhuǎn)化〔Transformation〕:,一種細(xì)菌菌株由于捕獲了外源DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變

35、的生命過程。承受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株那么被稱為受體菌株。,絕大多數(shù)細(xì)菌，正常條件下僅能獲得極少量的DNA。為了高效轉(zhuǎn)化這些細(xì)菌，必須對受體細(xì)菌進(jìn)展一些物理或化學(xué)的處理，以增加它們獲得DNA的能力。經(jīng)歷這種處理的細(xì)胞被稱為感受態(tài)細(xì)胞〔Competent Cell〕。,,二、細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖細(xì)菌轉(zhuǎn)化〔Transfor,70,常用細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法1------,CaCl,2,法,將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)(0℃〕預(yù)處理的低滲氯化鈣(0.1mol/L)溶液中，使細(xì)胞膨脹形成原生質(zhì)球，外源DNA粘附在細(xì)胞外表。,42℃下做短暫熱刺激，細(xì)胞吸收外源DNA。在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)?/p>

36、現(xiàn)表達(dá)，涂布于選擇性培養(yǎng)基中別離轉(zhuǎn)化子。,,常用細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法1------CaCl2法將快速生長中的大,71,常用細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法2------,電轉(zhuǎn)化法,利用銳利的電脈沖在細(xì)胞膜上造成小凹陷，進(jìn)而形成,納米級疏水孔洞,。隨著跨膜電壓增加，一些較大的疏水性孔洞會轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性孔洞，溶液中的DNA很容易通過孔洞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。,,常用細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法2------電轉(zhuǎn)化法 利用,72,克隆的篩選和鑒定：,1、抗生素,常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等。,2、α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選法,實(shí)驗室常用帶有不同,抗生素,的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合,α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選法,鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

37、,載體上：β-半乳糖苷酶基因〔LacZ〕的調(diào)控序列和氨基 端〔N端〕146個氨基酸編碼序列，在編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(diǎn)〔MCS〕； ---- ?片段,宿主細(xì)胞：,編碼β-半乳糖苷酶,C端,序列,,----,?片段,,克隆的篩選和鑒定：1、抗生素 常用的抗生素有：氨,73,宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，,Lac,Z基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為,α-互補(bǔ),。,,宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同,74,,分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論概要和常用實(shí)驗技術(shù)簡介課件,75,細(xì)

38、菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖的操作過程,,細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖的操作過程,76,三、RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄,RNA存在于從簡單的病毒到哺乳動物細(xì)胞的所有的生命形式之中。應(yīng)用RNA對細(xì)胞和分子生物學(xué)的各個方面進(jìn)展研究非常普遍。,由于當(dāng)前沒有一種方法能夠直接擴(kuò)增RNA，為了研究RNA所包含的功能信息，一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋〔Complementary DNA，cDNA)，再插入到可以自我復(fù)制的載體中。由于cDNA來自RNA，幾乎不含冗余序列，通過特異性探針篩選cDNA文庫，可以較快的別離到相關(guān)基因。,,三、RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 RNA存在于從簡單的,77,1、 總

39、RNA的提取,細(xì)胞中的總RNA包括,信使RNA (mRNA) 、核糖體RNA (rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA),以及一些,非編碼的小RNA,。一個典型的動物細(xì)胞約含有10,-5,μg,RNA，,其中,rRNA,占80%~85%，tRNA和非編碼小RNA占15%~20% ， mRNA 占1%~5%。,,1、 總RNA的提取 細(xì)胞中的總RNA包括信使,78,按照提取試劑的種類來分，可分為：異硫氰酸胍法、鹽酸胍法、異硫氰酸胍-苯酚法。,Trizol試劑是使用最廣泛的抽提RNA專用試劑。主要由異硫氰酸胍和苯酚組成，可以迅速破壞細(xì)構(gòu)造，使存在于細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)的RNA釋放出來，并使蛋白質(zhì)

40、與RNA分子別離，還能保證RNA的完整性。,常用的RNA提取方法,①,、常用提取方法的種類,,按照提取試劑的種類來分，可分為：異硫氰酸胍法,79,由于,RNA酶,存在于所有的生物中并且能夠抵抗諸如煮沸這樣的物理破壞，固此建立一個,無RNA酶的環(huán)境,對于制備優(yōu)質(zhì)RNA很重要。對于制備mRNA來說這些預(yù)防措施尤其重要。,②、本卷須知,,由于RNA酶存在于所有的生物中并且能夠抵抗諸,80,純的RNA樣品其OD260／OD280應(yīng)介于1.8-2.0之間。,1〕假設(shè)RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染；,2〕比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；,,OD260值=1，相當(dāng)

41、于單鏈DNA或RNA為40μg/mL，寡核苷酸為20μg/mL。,RNA的純度、濃度與完整性,1、RNA的純度,2、RNA的濃度,,純的RNA樣品其OD260／OD28,81,rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度接近2：1；mRNA分布均勻，那么認(rèn)為RNA質(zhì)量較好。,3、RNA的完整性,,rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S,82,2、 cDNA的合成,使用Oligo dT Primer時的cDNA合成,使用Random Primer時的cDNA合成,缺陷：不具有ploy〔A〕尾構(gòu)造的mRNA無法使用此方法！,,2、 cDNA的合成使用Oligo dT P

42、rimer時的c,83,生物信息學(xué)簡介,概念,：生物信息學(xué)是用數(shù)理和信息科學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象、組織和分析呈現(xiàn)指數(shù)增長的生物學(xué)數(shù)據(jù)的一門學(xué)科。,首先是研究遺傳物質(zhì)的載體DNA及其編碼的大分子蛋白質(zhì)，以計算機(jī)為其主要工具，開展各種軟件，對逐日增長的浩如煙海的DNA和蛋白質(zhì)的序列和構(gòu)造進(jìn)展收集、整理、分析和研究，逐步認(rèn)識生命的起源、進(jìn)化、遺傳和發(fā)育的本質(zhì)，破譯隱藏在DNA序列中的遺傳語言，提醒人體生理和病理過程的分子根底，為人類疾病的預(yù)測、診斷、預(yù)防和治療提供最合理和有效的途徑。生物信息學(xué)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科開展的強(qiáng)大推動力量，也是藥物設(shè)計、環(huán)境監(jiān)測的重要

43、組成局部。,,生物信息學(xué)簡介概念：生物信息學(xué)是用數(shù)理和信息科學(xué)的觀點(diǎn)、理論,84,1、美國國家信息中心 (National Center of Biotechnology Information, NCBI)的Gen Bank( :/ / nchi. nlm. nih. gov/ web/Gen Bank/ imdex. html),,2、歐洲分子生物學(xué)室驗室(European Molecular Biology L aboratory-Euro-pean Bioinformatics Institute, EMBL-EBI)的 EMBL ( :// ebi. a

44、c.uk/ databases/ index.html),,3、日本 DNA數(shù)據(jù)庫 (DNA Data Bank of Japan, DDBJ) ( :/ / ddbj.nig.ac.jp/ ),三大生物信息數(shù)據(jù)庫,,1、美國國家信息中心 (National Center of,85,生物信息學(xué)的主要研究內(nèi)容,,1、序列比對〔Alignment〕比較兩個或兩個以上符號序列的相似性或不相似性。序列比對是生物信息學(xué)的根底，非常重要。兩個序列的比對有較成熟的動態(tài)規(guī)劃算法，以及在此根底上編寫的比對軟件包——BALST和FASTA,2、構(gòu)造比對 較兩個或兩個以上蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)造的相似,

45、性或不相似性,,3、蛋白質(zhì)構(gòu)造預(yù)測，包括2級和3級構(gòu)造預(yù)測，是最重要的課題之一。,,前者主要是從一些根本原理或假設(shè)出發(fā)來預(yù)測和研究蛋白質(zhì)的構(gòu)造和折疊過程。分子力學(xué)和分子動力學(xué)屬這一范疇。后者主要是從觀察和總構(gòu)造造的蛋白質(zhì)構(gòu)造規(guī)律出發(fā)來預(yù)測未知蛋白質(zhì)的構(gòu)造,,生物信息學(xué)的主要研究內(nèi)容 1、序列比對〔Alignment〕,86,4、計算機(jī)輔助基因識別(僅指蛋白質(zhì)編碼基因),,根本問題是給定基因組序列后，正確識別基因的范圍和在基因組序列中的準(zhǔn)確位置。從具有較多內(nèi)含子的真核生物基因組序列中正確識別出起始密碼子、剪切位點(diǎn)和終止密碼子,5、非編碼區(qū)分析和DNA語言研究，是最重要的課題之一,,在人類基因組中

46、，編碼局部進(jìn)展總序列的3~5%，其它通常稱垃圾〞DNA，其實(shí)一點(diǎn)也不是垃圾，只是我們暫時還不知道其重要的功能。分析非編碼區(qū)DNA序列需要大膽的想象和嶄新的研究思路和方法。DNA序列作為一種遺傳語言，不僅表達(dá)在編碼序列之中，而且隱含在非編碼序列之中。,,4、計算機(jī)輔助基因識別(僅指蛋白質(zhì)編碼基因) 根本問題是給定,87,6、分子進(jìn)化和比較基因組學(xué)，是最重要的課題之一,近年來由于較多模式生物基因組測序任務(wù)的完成，為從整個基因組的角度來研究分子進(jìn)化提供了條件。,,7、序列重疊群〔Contigs〕裝配〔拼接〕,一般來說，根據(jù)現(xiàn)行的測序技術(shù)，每次只能測出片段序列，這就有一個把大量的較短的序列全體構(gòu)成了重

47、疊群〔Contigs〕。逐步把它們拼接起來形成序列更長的重疊群，直至得到完整序列的過程稱為重疊群裝配。拼接EST數(shù)據(jù)以發(fā)現(xiàn)全長新基因也有類似的問題。,8、遺傳密碼的起源,,,6、分子進(jìn)化和比較基因組學(xué)，是最重要的課題之一 近年來由于較,88,9、基于構(gòu)造的藥物設(shè)計,基于生物大分子構(gòu)造的藥物設(shè)計是生物信息學(xué)中的極為重要的研究領(lǐng)域。為了抑制某些酶或蛋白質(zhì)的活性，在其3級構(gòu)造的根底上，可以利用分子對接算法，在計算機(jī)上設(shè)計抑制劑分子，作為候選藥物。這種發(fā)現(xiàn)新藥物的方法有強(qiáng)大的生命力，也有著巨大的經(jīng)濟(jì)效益。,10、其他,如基因表達(dá)譜分析，代謝網(wǎng)絡(luò)分析；基因芯片設(shè)計和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析等，逐漸成為生物信息學(xué)中新興的重要研究領(lǐng)域 。,,9、基于構(gòu)造的藥物設(shè)計 基于生物大分子構(gòu)造的藥物設(shè)計是生物信,89,The end,,The end,90,