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1、十字花科植物DFR蛋白的生物信息學(xué)分析 植物花色主要是由類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜色素三大色素決定的?；ㄇ嗨厥且活愂种匾念慄S酮化合物，廣泛分布于各種植物中，其賦予了植物花、葉和果實(shí)各種顏色【1】，它主要調(diào)控花、葉和果實(shí)生成紅色、紫色和藍(lán)色?；ㄉ蘸铣蛇^(guò)程中，二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變成花色苷的反應(yīng)非常復(fù)雜，二氫黃酮醇4-復(fù)原酶〔dihydroflavonol4-reductase，DFR〕是這一轉(zhuǎn)變中起作用的第一個(gè)酶，失去DFR活性的突變體產(chǎn)生象牙色或者白色【2】。DFR是花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，是一個(gè)重要的調(diào)控點(diǎn)。它以二氫堪非醇〔dihydrokaempferol，DHK〕、二氫櫟皮黃酮〔di

2、hydroquercetin，DHQ〕和二氫楊梅黃酮〔dihydromyricetin，DHM〕為底物，在輔因子NADPH的作用下將4位的羰基復(fù)原為羥基，產(chǎn)生相應(yīng)的不穩(wěn)定無(wú)色花青苷元，然后這些無(wú)色花青苷元在花色素合酶〔anthocyanidinsynthase，ANS〕和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶〔flavonoid3-O-glucosyltransferase，3GT〕的催化下分別形成矢車(chē)菊素、天竺葵素和翠雀素[3-5]。DFR基因調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)于了解花色素苷生化合成途徑和花朵顯色的分子機(jī)制有重要的意義【6】。目前，DFR基因在很多植物中均已被克隆，由于DFR基因具有底物特異性，利用該特點(diǎn)可

3、以定向改良花的顏色【7】。自1987年Meyer等[8]將玉米DFR基因?qū)氚珷颗C01突變體使花色由白色變?yōu)榈u紅色以來(lái)，其在改造花色方面的應(yīng)用取得了很多進(jìn)展[9-12]。該研究采用生物信息學(xué)的方法，對(duì)十字花科植物DFR氨基酸序列的組成成分、理化特性、亞細(xì)胞定位、功能結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行預(yù)測(cè)和推斷，以期為進(jìn)一步研究十字花科花色素苷生物合成的分子機(jī)制以及選育不同花色的植物資源提供根底資料。1材料與方法1.1數(shù)據(jù)獲取以dihydroflavonol4reductase為信息探針?biāo)阉鱊CBIGene數(shù)據(jù)庫(kù)〔s：//ncbi.nlm.nih.gov/gene/〕，獲得十字花科植物的基因序列及編碼的相應(yīng)蛋白

4、質(zhì)序列。1.2DFR蛋白質(zhì)序列分析及亞細(xì)胞定位利用ProtParm在線分析軟件〔：//web.expasy.org/protparam〕預(yù)測(cè)各蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)信息[13]。使用WoLFPSORT在線分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位〔：//genscript -/wolf-psort.html〕。1.3DFR蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與磷酸化位點(diǎn)分析通過(guò)NCBICDD〔s：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi〕〕平臺(tái)獲取蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域[14];利用MEMEVersion4.12.0軟件分析蛋白質(zhì)的保守Motif〔：//meme-suite.

5、org/tools/meme〕[15];利用NetPhos3.1進(jìn)行蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)〔：//cbs.dtu.dk/services/NetPhos/〕[16-17]。1.4DFR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析利用SOPMA工具〔s：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html〕預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。1.5DFR蛋白質(zhì)同源性比較及進(jìn)化分析用DNAMAN8軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)分析;使用MEGA7.0軟件中的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用pdistance模型，并設(shè)置Bootstrap值為1000進(jìn)行校正，生成最終的系統(tǒng)進(jìn)化

6、樹(shù)[18]。2結(jié)果與分析2.1DFR蛋白序列分析及亞細(xì)胞定位利用NCBIGene數(shù)據(jù)庫(kù)，筆者選取了24個(gè)其中擬南芥〔Arabidopsisthaliana〕2個(gè)、琴葉擬南芥〔Arabidopsislyrata〕3個(gè)、甘藍(lán)型油菜〔Brassicanapus〕5個(gè)、甘藍(lán)〔Brassicaoleracea〕3個(gè)、白菜型油菜〔Brassicarapa〕3個(gè)、亞麻芥〔Camelinasativa〕5個(gè)、蘿卜〔Raphanussativus〕3個(gè)。這些蛋白質(zhì)中序列最長(zhǎng)的是RsDFR01〔387aa〕，最短的是AtDFR0401〔326aa〕;外顯子數(shù)目5～7個(gè)，大局部都有6個(gè)外顯子;分子質(zhì)量36481.8

7、9～43129.21Da;等電點(diǎn)最大的為AlDFR03〔pI=8.80〕，最小的是AlDFR01〔pI=5.07〕，大局部DFR蛋白等電點(diǎn)呈現(xiàn)酸性;利用WoLFPSORT分析亞細(xì)胞定位說(shuō)明有2個(gè)基因所編碼的蛋白定位在細(xì)胞核，17個(gè)定位在葉綠體，5個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)〔表1〕，可見(jiàn)大多數(shù)基因編碼的蛋白都定位于葉綠體中。2.2蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與磷酸化位點(diǎn)分析DFR蛋白屬于SDR〔shortchaindehydrogenase/reductase，SDR〕蛋白家族，該基因家族有2個(gè)高度保守功能結(jié)構(gòu)域，即NADP的結(jié)合功能域和底物特異結(jié)合功能域。利用NCBI的CDD在線分析24個(gè)十字花科植物的DFR基因所編

8、碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，除了BnaDFRA402只發(fā)現(xiàn)酶活性部位和底物特異結(jié)合區(qū)域，其他的基因編碼的蛋白均具有酶活性部位、NADP結(jié)合位點(diǎn)和底物特異結(jié)合位點(diǎn)〔表2〕。利用在線軟件MEME分析了DFR蛋白的保守motif，搜索了5個(gè)較保守的motifs〔圖1〕，大局部DFR蛋白都含有5個(gè)較保守的motifs，但BnaDFRA402只有4個(gè)motifs，缺失motif1;BoDFRC702、BrDFRA302、RsDFR03和AlDFR03只有3個(gè)，缺失motif1和motif4〔圖2〕。從保守motif序列和位置來(lái)看，這些保守的motif均處于保守結(jié)構(gòu)域中，即酶活性部位、NAD〔P〕結(jié)合位點(diǎn)和底物特

9、異結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，也進(jìn)一步說(shuō)明這些位點(diǎn)對(duì)于DFR蛋白功能是保守的。蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，其均含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，平均45個(gè)磷酸化位點(diǎn)，以BnaDFRC701最多，有53個(gè)，AtDFR0401最少，僅30個(gè);3種磷酸化類型中，以絲氨酸〔Ser〕磷酸化位點(diǎn)最多，其中又以BnaDFRC701最多〔32個(gè)位點(diǎn)〕，CsDFR1801最少〔18個(gè)位點(diǎn)〕;其次是蘇氨酸〔Thr〕磷酸化位點(diǎn)，以AlDFR01和AlDFR02最多〔19個(gè)位點(diǎn)〕，AtDFR0401最少〔8個(gè)位點(diǎn)〕;以酪氨酸〔Tyr〕磷酸化位點(diǎn)最少〔圖3〕?？梢?jiàn)，十字花科DFR蛋白的磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔。2.3DFR蛋白

10、的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用SOPMA軟件對(duì)DFR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4所示，24個(gè)DFR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)那么卷曲組成，其中α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)元件，所占比例為33.85%～51.85%，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最低，以CsDFR2021最高為13.53%，CsDFR1201最低僅為7.43%。2.4DFR蛋白質(zhì)同源性比較分析利用DNAMAN對(duì)十字花科DFR蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果說(shuō)明24個(gè)DFR蛋白的氨基酸序列，由于具有種屬差異，相似性為57.16%，但在重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域序列保守性高，如DFR與NADP結(jié)合區(qū)域和底物結(jié)合區(qū)域〔圖5〕。2.5DFR蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的

11、構(gòu)建根據(jù)不同植物DFR蛋白氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果，結(jié)合鄰近連接法用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖6所示，24個(gè)DFR蛋白共分成兩大族，其中AlDFR03、RsDFR03、BoDFRC702和BrDFRA302聚為一族，其他20個(gè)蛋白聚為一族。由此看出，同一種屬的DFR蛋白并不完全聚在一起，有些甚至不在同一個(gè)族，因此該類蛋白不宜用于十字花科的親緣關(guān)系鑒定及遺傳進(jìn)化分析。3結(jié)論與討論花色是衡量欣賞植物的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，改變花色一直是轉(zhuǎn)基因花卉研究比較熱門(mén)的問(wèn)題。隨著鄉(xiāng)村旅游的開(kāi)展，油菜花旅游逐年升溫，但單一的黃色油菜花限制了其欣賞價(jià)值，因此創(chuàng)制新花色油菜有重要意義。二氫黃酮醇4-復(fù)原酶屬于NA

12、DPH依賴性短鏈復(fù)原酶家族，又屬于細(xì)胞色素P450家族，作為花色素苷合成的關(guān)鍵酶而受到廣泛關(guān)注。隨著測(cè)序技術(shù)的開(kāi)展，公共數(shù)據(jù)量日益增加促使生物信息學(xué)成為后基因組時(shí)代用于預(yù)測(cè)和研究基因功能的重要方法。該研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對(duì)擬南芥、甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、蘿卜等十字花科植物的24個(gè)DFR蛋白序列的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果說(shuō)明十字花科的DFR蛋白均具有NAD〔P〕結(jié)合位點(diǎn)和底物特異結(jié)合位點(diǎn)，且序列較為保守，亞細(xì)胞定位主要在葉綠體，磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔，但不同種屬的DFR蛋白序列具有一定差異，同一種屬的DFR蛋白并不聚在一起，說(shuō)明這些DFR在功能

13、上也是有差異的，這些分析為該類基因表達(dá)和功能研究提供了參考，也為將來(lái)研究油菜花色形成分子機(jī)制及利用基因工程技術(shù)創(chuàng)新彩色油菜種質(zhì)資源提供了根底資料。參考文獻(xiàn)【1】陳大志，周嘉裕，李萍.二氫黃酮醇-4-復(fù)原酶的生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，2021〔12〕：206-212.【2】楊宏霞，曲柏宏，劉振坤，等.延邊蘋(píng)果梨PyDFR基因的克隆及表達(dá)分析[J].北方園藝，2021〔4〕：99-103.【3】周琳，王雁，任磊，等.牡丹二氫黃酮醇-4-復(fù)原酶基因PsDFR1的克隆及表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報(bào)，2021，47〔9〕：885-892.【4】TANAKAY，SASAKIN，OHMIYAA.B

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