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1、真誠為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請指正。 1.體外受精技術(shù)包含從配子的發(fā)生、體外培養(yǎng)、受精直至生命的形成。所以,體外受精技術(shù)是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ),也是擴(kuò)大良種畜胚胎來源的一種主要手段。由于從屠宰場收集卵巢,通過體外受精技術(shù),生產(chǎn)大量的廉價胚胎,降低了胚胎的生產(chǎn)成本,為胚胎移植技術(shù)的大面積推廣創(chuàng)造了條件。鑒于目前我國沒有大規(guī)模的良種畜可屠宰,以及體外生產(chǎn)胚胎移植后的成功率不高等因素,今后應(yīng)該結(jié)合活體采卵技術(shù),反復(fù)從良種母畜體內(nèi)采集卵母細(xì)胞來生產(chǎn)體外受精胚胎。同時,應(yīng)該進(jìn)一步研究提亭體外受精胚胎的囊胚率,解決妊娠率不高等技術(shù)問題。體外受精技術(shù)不僅限于擴(kuò)大胚胎生產(chǎn)，就整個配子與胚雨生物技術(shù)

2、的發(fā)展而言，它將成為胚胎生物技術(shù)的最基本的核心關(guān)鍵技術(shù)。所以,隨著體外受精技術(shù)配套技術(shù)的不斷完善,其應(yīng)用前景十分廣闊。 2、卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)：(1)超數(shù)排卵: 用促性腺激素處理（2）從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞（3）從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞 母細(xì)胞的選擇，采集到的卵母細(xì)胞絕大多是與卵丘細(xì)胞形成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體COC。未成熟的卵母細(xì)胞分四個等級； 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng):由超數(shù)排卵采集的卵母細(xì)胞已在體內(nèi)發(fā)育成熟，不需培養(yǎng)可直接與精子受精,對未成熟卵母細(xì)胞需要在體外培養(yǎng)成熟。培養(yǎng)時,先將采集的卵母細(xì)胞在實(shí)體顯微鏡經(jīng)過挑選和洗滌后,然后放入成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)。家畜卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液目前

3、普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培養(yǎng)法,微滴體積為50-200微升，每滴中放入的卵母細(xì)胞數(shù)按每5微升一個計(jì)算單位。卵母細(xì)胞移入小滴后,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為39℃ 、100%濕度和5%二氧化碳的空氣。牛的培養(yǎng)時間為20-24h,卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)成熟培養(yǎng)后，卵丘細(xì)胞層擴(kuò)散靠近卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞呈放射狀排列，出現(xiàn)放射冠,用DNA特意性染料染色后,在顯微鏡下進(jìn)行核相觀察,可見卵母細(xì)胞處于第2次成熟分裂中期。 3、體外受精 1．精子的獲能處理:哺乳動物精子的獲能方法有培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)兩種方法。牛、羊的精子常用化學(xué)藥物誘導(dǎo)獲能,誘導(dǎo)獲

4、能的藥物常用肝素和鈣離子載體。 2．受精:即獲能精子與成熟卵子的共培養(yǎng),除鈣離子載體誘導(dǎo)獲能外,精子和卵子一般在獲能液中完成受精過程。受精培養(yǎng)時間與獲能方法有關(guān)。在B2液中一般為⒍8小時而用TALP或SF液作受精液時可培養(yǎng)18-24h。精子和卵子常在小滴中共培養(yǎng),受精時精子密度為1-9 106/ml,每10微升精液中放人1-9枚卵子,小滴體積一般為5O~200微升。 4、胚胎培養(yǎng) 提高受精卵發(fā)育率的關(guān)鍵因素是選擇理想的培養(yǎng)體系。在家畜中,胚胎培養(yǎng)液分為復(fù)雜的和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)液兩大類。復(fù)雜培養(yǎng)液中的成分很多,除無機(jī)和有機(jī)鹽外,還添加維生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等營養(yǎng)成分和血清,最常用的

5、有TCM199、B2和F10。用它們培養(yǎng)胚胎時,可以采用體細(xì)胞共培養(yǎng)體系,即體細(xì)胞與胚胎在微滴中共同培養(yǎng),利用體細(xì)胞生長過程中分泌的有益因子,促進(jìn)胚胎發(fā)育,克服發(fā)育阻斷。 5、 哺乳動物的克隆效率為什么低,試從克隆操作技術(shù)體系方面解釋可能的原因? 卵母細(xì)胞的年齡和細(xì)胞周期會直接影響到重組胚,重編程過程。卵子成熟后卵母細(xì)胞質(zhì)才獲得指導(dǎo)體細(xì)胞核膜破裂的能力，在正常受精胚中,母源mRNAs在受精到早期胚胎合子型基因激活過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。同樣，母源信息也能使移入卵母細(xì)胞質(zhì)中的供體基因組重新程序化,這也是核移植所依據(jù)的主要原理之一。供體細(xì)胞分化特征越明顯克隆效率越低，使用胚胎干細(xì)胞作核供體比

6、體細(xì)胞的克隆效率要高。發(fā)展起來的兩步克隆法以第一步核移植產(chǎn)生的卵裂球或建立的胚胎干細(xì)胞系為供體進(jìn)行第二輪的克隆,可以大大提高克隆效率,并可以有效地使終端分化的B細(xì)胞、T細(xì)胞發(fā)生重編程,長期體外培養(yǎng)或操作過程中發(fā)生的染色體改變也能導(dǎo)致克隆動物發(fā)育異常。 6、供體核的重編程不徹底是造成克隆胚胎發(fā)育不良的主要原因之一,你怎么看?試解釋。核移植后供體核重編程的效果一般從以下幾個方面來評價 (1)囊胚發(fā)育率;(2) 一直到子宮以后胚胎出生率;(3)出生后發(fā)育到成年的比率;(4)克隆囊胚外植后獲取胚胎干細(xì)胞的頻率等。直到現(xiàn)在核移植效率仍然非常低,而且,重構(gòu)胚發(fā)育嚴(yán)重異常,妊娠早期流產(chǎn)率和出生后死亡率非

7、常高。此外,外界環(huán)境引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面的錯誤都有可能成為重編程失常的誘導(dǎo)因素。細(xì)胞核重編程改變是細(xì)胞形態(tài)和功能改變的一個中間事件,將其上下游事件聯(lián)系起來探明重編程的分子機(jī)制將是一個很有意義的方向。 @不同的類型、周期、代數(shù)、物種對重編程有影響。 7、如何進(jìn)行安全轉(zhuǎn)基因操作?針對社會上較多的對轉(zhuǎn)基囚動植物的不信任,你如何認(rèn)識? (l)毒物動力學(xué)試驗(yàn),了解它的吸收、分布、代謝及排泄等情況(2)遺傳毒性試驗(yàn),包括體外試驗(yàn)和體內(nèi)致突變試驗(yàn)(3)潛在致敏性試驗(yàn)(4)基因傳遞與穩(wěn)定性試驗(yàn)。檢查是否導(dǎo)入的基因向人畜胃腸道中存在的微生物中轉(zhuǎn)移和表達(dá)(5)微生物定植和微生物致病性試驗(yàn)。對本身

8、是活菌或含有活菌的新型食品要評價這兩項(xiàng)指標(biāo)(6)嚙齒類90天喂養(yǎng)試驗(yàn)。其中注意遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性及生殖毒性(7)驗(yàn)證對人類的安全性;一定時期后,對轉(zhuǎn)基囚食品安全性的再評價。包括耐受量、腸道群菌譜及數(shù)量等。 8、克隆技術(shù)的環(huán)節(jié)：1、供體核的準(zhǔn)備；2、受體細(xì)胞質(zhì)的選取；3、核質(zhì)重組融合激活技術(shù)；4、重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)；5、重組胚胎的移植 意義：1.理論價值 推翻了細(xì)胞分化的不可逆性，確定了新的理論體系，分化了的細(xì)胞的細(xì)胞核并沒有在結(jié)構(gòu)上發(fā)生不可逆的變化，一旦條件合適便可從頭開始驅(qū)動胚胎發(fā)育的整個進(jìn)程。 9、原始卵泡的發(fā)生機(jī)制？原始卵泡的發(fā)育是非激素依賴性的,主要通過細(xì)胞間的相互

9、作用及局部的細(xì)胞因子調(diào)節(jié) ,在進(jìn)化過程中高度保守。有多個因子參與原始卵泡的調(diào)節(jié) , 當(dāng)原始生殖細(xì)胞到達(dá)生殖嵴形成種系囊時 ,與卵巢的體細(xì)胞相互作用。原始生殖細(xì)胞與前顆粒細(xì)胞組成性腺索,直至原始卵泡形成。性腺索通過基底膜與卵巢的間質(zhì)細(xì)胞隔離。單個的卵母細(xì)胞 ,需要改造基底膜并被包圍形成原始卵泡。原始卵泡由一個卵母細(xì)胞和一層不完整的扁平前顆粒細(xì)胞組成 ,沒有明顯的泡膜細(xì)胞層或有組織的間質(zhì)細(xì)胞圍繞。原始卵泡的組裝要求單個卵母細(xì)胞分開 ,并與前顆粒細(xì)胞結(jié)合?？刂圃悸雅菪纬傻囊蜃舆€不清楚。 10、透明帶作用是保護(hù)卵子，阻止異種精子進(jìn)入。許多卵的透明帶下面還有一層分泌性的囊泡，稱為皮層顆粒。外層為中性

10、或弱酸性粘多糖蛋白,內(nèi)層主要為強(qiáng)酸性粘多糖蛋白。 11. 卵發(fā)生機(jī)制？ 腦垂體在下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素GnRH的控制下，分泌FSH和LH，卵巢受到FSH刺激后，其皮質(zhì)內(nèi)的卵泡生長，發(fā)育，成熟，并促使卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌激素。經(jīng)FSH的作用后，LH可以增強(qiáng)卵泡顆粒細(xì)胞合成孕激素和多種酶的能力，隨著Graafian氏卵泡的形成，通過水解作用和卵泡內(nèi)液壓力在卵泡眼點(diǎn)處增大，導(dǎo)致卵泡壁和卵巢表面立方生殖上皮破裂而發(fā)生排卵 12、精子最終進(jìn)入卵質(zhì)完成受精需克服多少障礙？1.在頂體酶的作用下，精子穿過放射冠，與ZP3相作用穿過透明帶進(jìn)入卵周隙2.受精開始時，皮質(zhì)顆粒的膜與卵細(xì)胞融合，使細(xì)胞表面

11、負(fù)電荷隨之增多，從而制止精子質(zhì)膜與卵膜的融合，發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)3. 透明帶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，發(fā)生透明帶反應(yīng)，透明帶對精子的結(jié)合能力降低，防止多精受精。4. 皮質(zhì)顆粒的內(nèi)容物除能破壞或滅活透明帶上與精子結(jié)合的受體，還能使透明帶中肽鏈間的交聯(lián)增加，對頂體蛋白酶的敏感性減弱，制止精子穿透。 13. 在小鼠的受精過程中，也有頂體反應(yīng)，但是小鼠的精子不會形成頂體突，受精過程中也沒有受精錐的出現(xiàn)。相同：在防止多精入卵的過程中，都會有皮質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生，即隨著皮質(zhì)顆粒的膜與卵細(xì)胞融合，使細(xì)胞表面負(fù)電荷隨之增多，從而制止精子質(zhì)膜與卵膜的融合 14. 哺乳動物胚胎著床機(jī)制? 著床是指胎生哺乳類動物的早期胚胎和母體子宮壁

12、結(jié)合, 從而建立母子間結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換的過程。胚胎著床是在著床期間胚胎與母體子宮內(nèi)膜細(xì)胞表面通過定位、黏附、連接及侵入等一系列事件完成著床過程, 是哺乳動物所特有的生殖活動, 是妊娠建立的標(biāo)志和首要環(huán)節(jié)。實(shí)質(zhì)上是胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體子宮內(nèi)膜細(xì)胞間逐步建立密切的細(xì)胞間通訊聯(lián)系的過程, 是胚胎與母體間復(fù)雜、精細(xì)的多因子雙向調(diào)控的結(jié)果。目前已知涉及胚胎著床的因子包括有激素、細(xì)胞因子、黏附分子、細(xì)胞表面寡糖、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞活素類物質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白酶等。它們形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 精細(xì)地調(diào)控胚胎著床的每一生理過程。 （1）妊娠識別：著床前胚胎首先產(chǎn)生和釋放妊娠信號給母體的子宮內(nèi)膜，母

13、體在接受這些信號后隨即產(chǎn)生反應(yīng)，以維持黃體的功能和促進(jìn)孕體的繼續(xù)發(fā)育從而保障妊娠的建立。（2）子宮的容受性：人類在月經(jīng)周期的黃體時相內(nèi)，子宮內(nèi)膜出現(xiàn)類似蛻膜反應(yīng)的轉(zhuǎn)化,，稱為前蛻膜。若卵子不受精, 前蛻膜則在行經(jīng)時脫落而隨血流排出；如果受精，則在孕卵著床時轉(zhuǎn)化為蛻膜。蛻膜細(xì)胞能為發(fā)育的胚胎提供營養(yǎng)物質(zhì)，并限制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵蝕，起保護(hù)母體的作用。（3）激素調(diào)節(jié)：孕激素(孕酮)在胚胎著床中起主導(dǎo)作用,它刺激子宮腔內(nèi)腺上皮的發(fā)育和子宮腺體的分泌, 為早期胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)。孕酮及其代謝物能抑制妊娠母體的免疫反應(yīng), 促進(jìn)著床。 性別鑒定：核型分析；X連接酶法鑒定胚胎性別；H-yY抗原法；SRY-PCR

14、法 名詞解釋： 1：疏松結(jié)締組織:是由細(xì)胞、纖維、基質(zhì)組成，基質(zhì)含量多。細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、大細(xì)胞等?？筛爬榻?(未分化的間充質(zhì)細(xì)胞)成(成纖維細(xì)胞)巨(巨噬細(xì)胞)大(肥細(xì)胞)白(白細(xì)胞)漿(漿細(xì)胞)房(脂肪細(xì)胞)。細(xì)胞間質(zhì)由膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維和基質(zhì)組成。該組織分布于細(xì)胞、組織和器官之間，具有支持連接、防御保護(hù)、營養(yǎng)和修復(fù)的功能。 2：生殖脊：可以發(fā)育為生殖腺，是脊椎動物胚胎后半部，背系膜側(cè)面中胚層形成的縱行上皮加厚的細(xì)胞條。 3：原窩；原條中間形成的凹陷叫原溝，細(xì)胞通過呀U能夠遷移到囊胚腔，原條前端有原結(jié)，原結(jié)中央的凹陷就是原窩。 4：氣血屏障：肺

15、泡內(nèi)氧氣與肺泡隔毛細(xì)血管內(nèi)血液攜帶CO2進(jìn)行氣體交換通過的結(jié)構(gòu)。包括肺泡表面液體層、I型肺泡細(xì)胞及基膜、薄層結(jié)締組織、毛細(xì)血管基膜及連續(xù)內(nèi)皮。 5：放線菌酮；一種在真核生物中對蛋白質(zhì)生物合成過程有著抑制效應(yīng)的化合物，通過干擾蛋白質(zhì)合成過程中的異位步驟而阻礙翻譯過程。常用來抑制生物體外真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。 6：DMSO；一種滲透性保護(hù)及能降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，減輕自由基對細(xì)胞損害，改變生物膜對電解質(zhì)、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性。它也存在有一定的毒性，可與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)發(fā)生作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。 7；ICSI：卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù) ，也就是第二代“試管嬰兒”，是借助顯微操作系統(tǒng)

16、將單一精子注射入卵子內(nèi)使其受精。 LIF，白血病抑制因子，是典型的多功能生長因子，對于細(xì)胞生長、增殖與分化有著廣泛的作用，與胚胎發(fā)育，神經(jīng)發(fā)育和造血系統(tǒng)的發(fā)育有密切的聯(lián)系。 FSH：卵泡刺激素，只增加卵泡數(shù)目，不刺激卵泡的成熟。 LH：促黃體生成素，作用于成熟的卵泡，引起排卵并生成黃體。） GnRH：促性腺激素釋放激素，可促進(jìn)促性腺激素的分泌，可誘導(dǎo)FSH，LH,等激素的分泌，促使精原細(xì)胞分化。 睪酮：LH與間質(zhì)細(xì)胞結(jié)合，刺激細(xì)胞產(chǎn)生睪酮，睪酮以擴(kuò)散的方式進(jìn)入曲細(xì)精管，發(fā)揮在生精過程中作用。生理作用：（1）促使性器官和副性腺發(fā)育；（2）維持雄性動物第二性征；（3）促使精細(xì)官發(fā)育和精子

17、形成; （4）促進(jìn)動物骨骼與肌肉生長 。 催乳素PRL:（1）促進(jìn)乳腺發(fā)育和乳汁生成（性成熟前促進(jìn)乳腺導(dǎo)管發(fā)育，在妊娠期，促進(jìn)乳腺腺泡發(fā)育）；（2）抑制性腺機(jī)能發(fā)育，引起禽類抱窩，母牛不排卵；（3）對于嚙齒類動物，PRL促使新黃體形成，老黃體退化，提高嚙齒類雄性動物間質(zhì)細(xì)胞LH受體，具有壯陽之作用（4）提高動物母性行為。 絨毛膜促性腺激素hCG 對母畜的作用—促進(jìn)卵泡發(fā)育、誘使排卵，類同LH的作用；對婦女妊娠：胚胎信號；代替卵巢功能；免疫抑制 PG： 前列腺素，增加黃體生成素釋放激素釋放，是睪丸激素分泌增加；對血管和支氣管平滑肌有作用；對胃腸道有作用，可引起平滑肌 收縮；對神經(jīng)系統(tǒng)地址的釋放和活動起調(diào)節(jié)作用；對呼吸系統(tǒng)的作用，E可以松弛支氣管平滑肌，F(xiàn)抑制；對內(nèi)分泌系統(tǒng)有作用。 IPS 通過導(dǎo)入外源基因使體細(xì)胞區(qū)分化為多能干細(xì)胞。 MSTN作為胞外信號分子可與成肌細(xì)胞膜上的受體結(jié)合引起受體白身的磷酸化,啟動細(xì)胞內(nèi)一系列信號傳導(dǎo)過程,作用于生肌決定因子(MyoD)靶基因的調(diào)控區(qū),調(diào)節(jié)肌肉組成蛋白和蛋自基因的表達(dá)。 IGF-1 類胰島素一號增長因子。在嬰兒生長和在成人體內(nèi)持續(xù)進(jìn)行合成代謝作用上具有重要意義。降血糖血脂、舒張血管促進(jìn)骨的合成代謝，保持其正常結(jié)構(gòu)功能，促生長促分化。 4 / 4