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1、選修 現(xiàn)代生物科技專題 第一講基因工程第一講基因工程課前自主學習 拓展：質(zhì)粒載體質(zhì)粒是細菌擬核DNA外的環(huán)狀DNA小分子，可在細菌間轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒是常用的轉(zhuǎn)基因載體。 病毒載體 病毒很適合用于基因治療。病毒的蛋白質(zhì)外殼內(nèi)能容納多達7 500個堿基的DNA片段。當病毒侵染宿主細胞并在細胞內(nèi)增殖時，也將重組DNA帶入到細胞中。病毒已經(jīng)用于多次基因治療的臨床實驗。這種方法存在的問題是宿主對病毒的免疫反應(yīng)。 拓展：顯微注射,DNA可以通過顯微注射轉(zhuǎn)入動物細胞中。下圖所示的是目的基因的多份拷貝正通過玻璃微型吸管注射到受精卵中。轉(zhuǎn)基因小鼠和家畜都是利用這種方法產(chǎn)生的，但是成功率很低；只有2%3%的受精卵發(fā)育成

2、轉(zhuǎn)基因動物，在這些動物中只有一小部分表達了轉(zhuǎn)入的基因。 基因槍法,這種方法是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA打入生物組織中。常用的金屬顆粒有金粉粒子或鎢粉粒子。一些細胞能像表達自身基因一樣表達導(dǎo)入的外源DNA。課堂互動探究 1.“分子手術(shù)刀”限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶),(1)存在：主要存在于原核生物中。 (2)特性：一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子。基因工程的基本操作工具 (4)切割后末端的種類：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式黏性末端和平末端(如圖所示)。當限制酶在它識別序列的中軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分

3、別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端，而當限制酶在它識別序列的中軸線處切開時，產(chǎn)生的則是平末端。 2“分子縫合針”DNA連接酶種類EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體功能特性只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來縫合兩種末端，但連接平末端的效率較低相同點都縫合磷酸二酯鍵，如圖 3.“分子運輸車”載體 (1)載體具備的條件： 能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。 具有一個至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。 具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。 (2)最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌擬核之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

4、(3)其他載體：噬菌體的衍生物、動植物病毒。 特別提醒獲取目的基因和切割載體時使用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。 獲取一個目的基因需限制酶剪切兩次，共產(chǎn)生4個黏性末端或平末端。 限制酶切割位點的選擇必須保證標記基因的完整性，以便于檢測。 1據(jù)圖表回答問題： 幾種限制酶識別序列及切割位點表 (1)假設(shè)所用的限制酶均能將所識別的位點完全切開，采用EcoR和Pst酶切含有目的基因的DNA，能得到_種DNA片段。如果將質(zhì)粒載體和含目的基因的DNA片段只用EcoR酶切，酶切產(chǎn)物再加入DNA連接酶，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有_、_、_。限制酶SmaEcoRPst切割位點CCCGGG

5、GGGCCCGAATTCCTTAAGCTGCAGGACGTC (2)為了防止目的基因和質(zhì)粒表達載體酶切后的末端任意連接，酶切時應(yīng)該選用的酶是_、_。 解析：(1)含目的基因的DNA分子上含有2個EcoR和1個Pst的酶切位點，三個切點全部切開，則形成4種DNA片段。質(zhì)粒與含目的基因的DNA片段都用EcoR切割，目的基因兩端和質(zhì)粒的切口處的黏性末端相同，只考慮兩個DNA片段相連，則會形成三種連接產(chǎn)物，即質(zhì)粒與質(zhì)粒相連、質(zhì)粒與目的基因相連、目的基因與目的基因相連。為了防止自連，可選用EcoR和Sma兩種酶同時切割。 答案：(1)4質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體連接物目的基因目的基因連接物質(zhì)粒載體目的基因連接物

6、(2)EcoRSma基因工程的操作程序及與蛋白質(zhì)工程的比較 1基因工程的操作程序分析 (1)目的基因的獲取途徑 從自然界中已有的物種中分離出來，如從基因組文庫或cDNA文庫中獲取。 人工合成目的基因 常用的方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學合成法。 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 通過PCR技術(shù)可對已獲取的目的基因進行擴增，以獲取大量的目的基因。 (2)基因表達載體的構(gòu)建 拓展：插入的目的基因的表達需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入基因部位之前需有啟動子，之后需有終止子。 兩次使用的限制酶為同一種酶，這樣形成的黏性末端堿基之間互補，便于連接。 (3)將目的基因?qū)胧荏w細胞(轉(zhuǎn)化)生物種類植物細胞動物細胞微生

7、物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞整合到受體細胞的DNA上表達將含有目的基因的表達載體提純?nèi)÷?受精卵)顯微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動物Ca2處理細胞感受態(tài)細胞重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子 (4)目的基因的檢測與鑒定類型檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測導(dǎo)入檢測目的基因是否進入受體細胞DNA分子雜交(DNA和DNA之間)雜交帶轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交(DNA和mRNA之間)雜交帶翻譯檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 2.基因工程與蛋白質(zhì)工程的比

8、較項目區(qū)別與聯(lián)系蛋白質(zhì)工程基因工程區(qū)別過程預(yù)期蛋白質(zhì)功能設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測應(yīng)有的氨基酸序列找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列獲取目的基因構(gòu)建基因表達載體將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定實質(zhì)定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì)定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品結(jié)果可生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質(zhì)只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì) 2(2011山東高考)人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型常用于致病機理的探討及治療藥物的篩選。利用正常大鼠制備遺傳性高血壓轉(zhuǎn)基因模型大鼠的流程如下圖所示。 (1)卵母細胞除從活體輸卵管中采集外，還可從已處死的雌鼠_中獲取。 (2)圖中的高血壓相關(guān)基因作為_，質(zhì)粒作為_，

9、二者需用_切割后連接成重組載體，該過程與質(zhì)粒上含有_有關(guān)。 (3)子代大鼠如果_和_，即可分別在分子水平和個體水平上說明高血壓相關(guān)基因已成功表達，然后可用其建立高血壓轉(zhuǎn)基因動物模型。 (4)在上述轉(zhuǎn)基因大鼠的培育過程中，所用到的主要胚胎工程技術(shù)是_、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植。 解析：本題主要考查基因工程、胚胎工程的相關(guān)知識，意在考查理解能力與綜合運用能力。(1)卵母細胞可以從活體的輸卵管中采集，也可以從處死的雌鼠的卵巢中獲取。(2)根據(jù)題圖可以判斷高血壓相關(guān)基因為目的基因，質(zhì)粒是載體，二者需用同種限制酶切割后連接成重組載體，該過程需要目的基因和質(zhì)粒上有限制酶能識別的切割位點。(3)檢測高血壓相關(guān)

10、基因是否表達，在分子水平上可檢測對應(yīng)的蛋白質(zhì)是否合成，在個體水平上可觀察其是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀。(4)從題圖中可以看出，所用到的胚胎工程技術(shù)主要有體外受精、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植。 答案：(1)卵巢(2)目的基因載體同種限制性核酸內(nèi)切酶(或：同種限制酶)限制酶切割位點(3)檢測到體內(nèi)有相關(guān)蛋白出現(xiàn)高血壓(4)體外受精 1.如圖所示為部分雙鏈DNA片段，下列有關(guān)基因工程中工具酶功能的敘述錯誤的是() A切斷a處的酶為限制酶 B連接a處的酶為DNA連接酶 C切斷b處的酶為解旋酶 D連接b處的酶為RNA聚合酶 解析：限制酶能識別特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子，通常形成黏性末端，

11、即能切割DNA鏈外側(cè)的磷酸二酯鍵(圖中的a處)，內(nèi)側(cè)堿基對之間的氫鍵(b處)可通過解旋酶解開。DNA連接酶將切斷的磷酸二酯鍵進行連接，即圖中的a處。RNA聚合酶的作用是催化DNA的轉(zhuǎn)錄。 答案：D 2(2013南京聯(lián)考)某科學家從細菌中分離出耐高溫淀粉酶(Amy)基因a，通過基因工程的方法，將a轉(zhuǎn)到馬鈴薯植株中，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)Amy在成熟塊莖細胞中存在，下列說法正確的是() A基因a只有導(dǎo)入到馬鈴薯受精卵中才能表達 B目的基因來自細菌，可以不需要載體直接導(dǎo)入受體細胞 C基因a導(dǎo)入成功后，將抑制細胞原有的新陳代謝，開辟新的代謝途徑 D目的基因進入受體細胞后，可隨著馬鈴薯的DNA分子的復(fù)制而復(fù)制，傳給

12、子代細胞并表達 解析：培育轉(zhuǎn)基因植株可以以體細胞或受精卵作為受體細胞；目的基因必須借助載體才能導(dǎo)入受體細胞；目的基因?qū)氤晒?，不抑制細胞原有的代謝途徑。 答案：D 3研究人員將魚的抗凍基因?qū)敕洋w內(nèi)，獲得抗凍能力明顯提高的番茄新品種。下列操作合理的是() A設(shè)計相應(yīng)DNA單鏈片段作為引物，利用PCR技術(shù)擴增目的基因 B利用限制酶和DNA聚合酶構(gòu)建基因表達載體 C將基因表達載體導(dǎo)入番茄細胞之前需用Ca2處理細胞 D運用DNA分子雜交技術(shù)檢測抗凍基因是否在番茄細胞中表達 解析：利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶構(gòu)建基因表達載體；將基因表達載體導(dǎo)入原核細胞之前需用Ca2處理，番茄細胞為真核細胞；

13、運用抗原抗體雜交技術(shù)可檢測抗凍基因是否在番茄細胞中表達。 答案：A 4(2012福建高考)肺細胞中的let7基因表達減弱，癌基因RAS表達增強，會引發(fā)肺癌。研究人員利用基因工程技術(shù)將let7基因?qū)敕伟┘毎麑崿F(xiàn)表達，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的增殖受到抑制。該基因工程技術(shù)基本流程如圖甲。 請回答： (1)進行過程時，需用_酶切開載體以插入let7基因。載體應(yīng)有RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，以驅(qū)動let7基因轉(zhuǎn)錄，該部位稱為_。 (2)進行過程時，需用_酶處理貼附在培養(yǎng)皿壁上的細胞，以利于傳代培養(yǎng)。 (3)研究發(fā)現(xiàn)，let7基因能影響癌基因RAS的表達，其影響機理如圖乙。據(jù)圖分析，可從細胞中提取_進行分子雜交

14、，以直接檢測let7基因是否轉(zhuǎn)錄。肺癌細胞增殖受到抑制，可能是由于細胞中_(填“RAS mRNA”或“RAS蛋白”)含量減少引起的。 解析：(1)過程為重組載體的構(gòu)建過程，需要限制性核酸內(nèi)切酶切開載體，插入目的基因；RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位稱為啟動子。(2)動物細胞培養(yǎng)中原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)過程中，細胞出現(xiàn)貼壁生長，用胰蛋白酶處理貼附在培養(yǎng)皿壁上的細胞，以利于傳代培養(yǎng)。(3)檢測let7基因是否轉(zhuǎn)錄，可采用DNARNA分子雜交技術(shù)，提取細胞中的RNA進行分子雜交；由圖乙看出肺癌細胞增殖受抑制可能是翻譯過程受抑制，即RAS蛋白含量減少引起的。 答案：(1)限制性核酸內(nèi)切(或限制)啟動子(2)胰蛋白(3)RNARAS蛋白