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1、課題2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù) 考點要求 1 ?研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用，進行微生物數(shù)量的測定。 2.能利用選擇培養(yǎng)基分離細菌，運用相矢技術(shù)解決生產(chǎn)生活中有尖微生物的計數(shù)。雙基過矢 一、 理論基礎(chǔ) 1. 篩選菌株 (1) 實驗室中微生物篩選的原理：人為提供有利于 等)，同時 或 其他微生物生長。 ?生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH (2) 選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許一微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。 (3 )配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù) 種類的微生物生長，同時 和 其他種類 根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質(zhì)以達到選擇的目的。 例如，培養(yǎng)基中不加

2、 入有機物可以選擇培養(yǎng) 微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培 養(yǎng) ;的微生物?加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。 2. 統(tǒng)計菌落數(shù)目 (1 )測定微生物數(shù)量的常用方法有 和 (2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理 當樣品的 夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一 個 。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保 證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在 的平板逬行計數(shù)。此外，測定微生物數(shù)量的常用方法 還有 直接計數(shù)。 3. 設(shè)置對照 設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中 對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié) 果的 。例如為了

3、排除培養(yǎng)基是否被雜菌污染了，需以培養(yǎng) 的培 養(yǎng)基作為空白對照。 二、 實驗設(shè)計 矢于土壤中某樣品細菌的分離與計數(shù)實驗操作步驟如下： 1. 取樣：從肥沃、濕潤的3 cm左右，再取 土壤中取樣。應(yīng)先一 樣，將樣品裝入事先準備好的一中。 2. 制備：準備牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基 將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白膿培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯 選擇培 養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白膿培養(yǎng)基可以作為 ，用來判斷選擇培養(yǎng) 基是否起到了選擇作用。 3. 微生物的與觀察 將10g 土樣加入盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中(體積為250 mL)，充分搖勻，吸取上清

4、液一，轉(zhuǎn)移至盛有 的生理鹽水的無菌大試管中，將土樣以 1、101、IO?……依次等 比稀釋至稀釋度，并按照由107?IO?稀釋度的順序分別吸取 進行平板涂布操作。每 將涂布好的培養(yǎng)皿放在30C 個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基、1個牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基。 溫度下培養(yǎng)，及時觀察和記錄。斜面中，爛睦瞬培贈醋琳護同形態(tài)的菌落接入含 培養(yǎng)基的 4?細菌的計數(shù) 2?10的顏色反應(yīng)。 當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在個平板進行重復(fù)計數(shù)， 出菌的數(shù)目。 毀書棗進行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對 :并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細 三：思考與討論 (1)如何從平板上的菌落數(shù)推測出每

5、克樣品中的菌落數(shù)? (2)為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù) 量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 四：典例分析 類型一選擇培養(yǎng)基的配制 【例1】分析下面培養(yǎng)基的配方： KH2PO4、Na2HP04、MgSO4 7H20、葡萄糖、尿素、瓊脂。 請回答： (1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別 —和 (2)想一想這種培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用 ?如果具有，又是如何進行選擇的 類型二統(tǒng)計菌落數(shù)目 【例2】用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為中得到以下幾種統(tǒng)計106的

6、培養(yǎng)基 結(jié)果，正確的是 A?涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是 B?涂布了兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是 C?涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是 D?涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是 230 215和260,取平均值238 21、212和2墨6，取平均值163 210、240和250,取平均值233 類型三設(shè)置對照 【例3】用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對照是 A .未接種的選擇培養(yǎng)基 B ?未接種的牛肉膏蛋白陳(全營養(yǎng))培養(yǎng)基C .接種了的牛肉膏蛋白腺(全營養(yǎng))培養(yǎng)基D ?接種了的選擇培養(yǎng)基 基礎(chǔ)自測 一、選擇題 1 . PCR技術(shù)要求使用耐高溫的D

7、NA聚合酶，這種酶要能忍受你來尋找這 93C左右的高溫。如果請 種 耐高溫的酶，你會去哪里尋找 () A?土壤中 海水中 C .熱泉中 D.冷庫中 2 ?下列能選擇出分解尿素的細菌的培養(yǎng)基是 A . KH2PO4、Na2HP04、MgS04 7H20、葡萄糖、尿素、瓊脂、水 B . KH2PO4、Na2HP04、MgS04 7H2O、葡萄糖、瓊脂、水 C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSOq 7H2O、尿素、瓊脂、水 D . KH2PO4、Na2HP04、MgS04 7H20、牛肉膏、蛋白腺、瓊脂、水; 3. 某冋學(xué)在稀釋倍數(shù)為 106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)

8、的平均值為 234，那么每克樣 品中的菌落數(shù)是(涂布平板時所用稀釋液的體積為 o.1 mL)...( ) A . 2.34 氷 0 B . 2.34 X0 C ? 234 D. 23.4 4?在做分離分解尿素的細菌實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)1 06培養(yǎng)基上篩選出大約150個菌落，而其他同 學(xué)只選擇出大約50個菌落。A同學(xué)的結(jié)果產(chǎn)生原因( ) ①由于土樣不同②由于培養(yǎng)基污染③由于操作失誤 ④沒有設(shè)置對照 A g③ B .噩④ C .(D?? D .(D?? 5 矢 于土壤取樣的敘述錯誤的是 0 A ?土壤取樣，應(yīng)選取肥沃、濕潤的土壤 B .先鏟去表層土 3cm

9、左右，再取樣 C .取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌 D .應(yīng)在火焰旁稱取土壤 6 下列矢于從土壤中分離細菌的操作 步驟中，正確的是 ( ①土壤取樣②稱取10g 土壤取出加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中行平板涂布 ④依次 ③吸取0.1 mL進 稀釋至 10〔、102、103、1。4、1。5、1。6、107 稀釋度 A ?①7②7③7④ B ?①7③7②7④ C ?①7②7④7③ D ?①7④7②7③ 7.下列矢于測定土壤中細菌數(shù)量的敘述，正確的是 A .一般選用103?IO?倍的稀液分別涂布 B ?測定放線菌的數(shù)量，一般選用 C .測定真菌的數(shù)量，一般選用 D.當?shù)谝?/p>

10、次測量某種細菌的數(shù)量， 103、IO 4和105倍稀釋 103、104和IO：倍稀釋 可以將 1?107倍的稀釋液分別涂布到平板上 8.下列矢于微生物的培養(yǎng)敘述錯誤的是 A .細菌一般在30?37C的溫度下培養(yǎng)1?2 d B ?放線菌一般在25?28 C的溫度下培養(yǎng)5?7 d C .霉菌一般在25?28 C的溫度下培養(yǎng)3?4 d D .不同種類的微生物，一般需要相同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間 9.下列操作需要在火焰旁進行的一組是 ( ) ①土壤取樣②稱取土壤③稀釋土壤溶液④涂布平板⑤微生物的培養(yǎng) c 10. B .?o)?(5)@? D .②③④ 下列口J以鑒

11、定出分解尿素的細菌的方法是 A?以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加人酚紅指示劑 B?以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入二苯胺試劑 C?以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入蘇丹川試劑 D ?以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入雙縮腺試劑 11. 土壤取樣時最好選擇哪種環(huán)境中的土壤做分離細菌的實驗A .街道旁 B .花盆中 C ?農(nóng)田中 D .菜園里 二、非選擇題 12. 統(tǒng)計菌落數(shù)目一般用稀釋涂布平板法，當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的 一個 ，來源于樣品稀釋液中的一個 。計數(shù)時一般選擇菌落數(shù)在 的平板 計數(shù)。 13. 在做本課題實驗時，一位同學(xué)在稀釋倍數(shù)為 106的培養(yǎng)基中涂布了 3個

12、平板，統(tǒng)計的 菌落數(shù)分別為21 >212和256，該同學(xué)以這3個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。你認為這一結(jié)果 是否接近真實值？如果需要改進，如何改進？ 14. 在進行操作本課題實驗時應(yīng)特別注意： 、 、 。 15. 在做本課題實驗時，甲同學(xué)篩選出的菌落與其他同學(xué)不同，并且他在設(shè)計實驗時并沒有設(shè)置對照。思考下 列問題： (1) 你認為出現(xiàn)甲同學(xué)這種結(jié)果的原因可能是什么 ？ (2) 要幫助甲同學(xué)排除可能影響實驗結(jié)果的因素，需要設(shè)置 ，實驗方案有兩種： 一種方案是可以由其他同學(xué)用與甲同學(xué) 進行實驗，如果結(jié)果與甲同學(xué)一致，則證 明甲同學(xué) ，如果結(jié)果不同，則證明甲同學(xué)存在操作

13、 或 的配制有問題。 另一種方案是將甲同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加 的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照， 證明培養(yǎng)基是否受到 (3) 由此問題你得出的啟示是什么 16 ?在105稀釋度下求出3個平板上菌落數(shù)的平均值是 63,那么每克樣品中的菌落數(shù)是 多少？ 參考答案： 一、 1 (1)目的菌珠抑制阻止(2)特定抑制 阻止(3)自養(yǎng)能固氮的微生物； 2(1 )有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。 (2).稀釋度 細菌 30-300顯微鏡 3.非測試因素 可信度無雜菌污染 二、 1 ? 土壤，鏟去表層土。2.培養(yǎng)基多于對照均數(shù) 3.培養(yǎng) 1 ml 9ml 0.1 mL 4.30-300

14、 三：思考與討論 1統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，然后按課本旁欄的公式進行 計算 最好能統(tǒng)計 3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值， 2這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù) 約為 (單位：株/kg )是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣2185萬， 放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。 同時還應(yīng)當有針對性地提 此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離， 供選擇培養(yǎng)的條件。 四：典例分析 類型一選擇培養(yǎng)基的配制 1解析：碳源是提供碳元素的物質(zhì)，氮源是提供氮元素的物質(zhì)。所以碳源是葡萄糖，氮源是 尿素。絕大多數(shù)生物都能 利用葡萄糖，但是

15、，只有能合成腺酶的微生物才能分解尿素，所以這種培養(yǎng)基對微生物有選擇作用。選擇的原則是只 有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。答案：(1)葡萄糖尿素9)有選擇作用。因為此配方中尿素是唯一氮源，因 此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。 啟示：選擇培養(yǎng)基篩選微生物的原理：人為提供有利于目的茵株生長的條件度、pH等)，同時抑(包括宮養(yǎng)、溫 制或阻止其他微生物生長。 2解析：在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少 3個平板.作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與 準確性，所以A、B不正確。C項雖涂布了 3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另兩個相差太遠，說明在 操作過程中可能岀現(xiàn)了錯誤， 因此，不能簡單

16、地將3個平板的計數(shù)值 用來求平均值。 答案：D 啟示：在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少 3個平板作為重復(fù)組；在分析實驗結(jié)果時，一定要考 慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需重新實驗。 3解析：將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選 擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此， 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基作為對照。對照遵循的原則是單一變量，所以與選擇培養(yǎng)基一樣接種、培養(yǎng)。 答案：C 啟示：對照實驗是指除了被測試的條件以外， 其他條件都相同的實驗，其作用是比照實驗組， 排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。 基礎(chǔ)自測 一、1. C2. A3. B4. A5. C6. C 7. B8. D9. D 10. A11. D 活菌 30 ?300 13.不接近真 實值，需要重新實驗。 作好標記 規(guī)劃時間 二、12.菌落 14. 無菌操作 15. (1)可能的原因 有兩種：一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。 (2) 對照實驗一樣的土樣，無誤，失誤培養(yǎng)基土樣污染。 (3) 啟示：做實驗時一定要設(shè)置對照。 少年智則國智，少年富則國富，少年強則國強，少年獨立則國獨立，少年自由則國自由，少 年逬步則國進步，少年勝 于歐洲，則國勝于歐洲，少年雄于地球，則國雄于地球。