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1、優(yōu)選精品文檔 共享共進(jìn)共贏 DNA勺粗提取與鑒定 【考試說明要求】 1 .制備和應(yīng)用固定化酶（A） 2 .酵母細(xì)胞的固定化（B） 【課堂活動(dòng)】 ［基礎(chǔ)回顧］ 一、實(shí)驗(yàn)原理 1. DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度 （如2mol/L）就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反（DNA在濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解應(yīng)最?。?，以達(dá)到分離目的。 此外，DNA不溶于酒精溶液,但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與 蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。 2. DNA對(duì)酶、高溫

2、和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60—80°C的高溫，而DNA在 80oC以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜,但對(duì)DNA沒有影響。 3. DNA的鑒定 在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色,因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。 二、實(shí)驗(yàn)材料的選取 凡是含有DNA的生物材料都可以考慮,但是使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織,成功的可能性更大，如皿（原因：DNA含量豐富，材料易得，雞血細(xì)胞吸水易脹破）。若用動(dòng)物組織如豬肝，則需研磨。 三、過程 1 .破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液 動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞

3、液中加入一定量的蒸儲(chǔ)水，同時(shí)用玻璃棒攪 拌，過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。 注息： ①為什么加入蒸儲(chǔ)水能使雞血細(xì)胞破裂？ 蒸儲(chǔ)水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA ②加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？ 洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl,有利于DNA 的溶解。 ③如果研磨不

4、充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？ 研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉 淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。 ④此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？ 可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。 2 .去除濾液中的雜質(zhì) 方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì),不分 解DNA;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。 注息： ①為什么反復(fù)地溶解與析出DNA,能夠去除雜質(zhì)？ 用高鹽濃度的溶液溶解DNA能除去在高鹽中不能溶解白雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解 在低鹽溶液

5、中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA就能夠除去與DN夠解度不同的多種雜質(zhì)。 ②方案二與方案三的原理有什么不同？ 方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DN府口蛋白質(zhì) 對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA^離（60?75C的恒溫水浴保溫10?15min）。 3 .DNA的析出與鑒定 將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積出皂、冷卻的酒精溶液，靜置2?3min,溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物,這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌,卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。 取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液

6、5ml,將絲狀物放入其中一支試管 中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管前％加入4ml的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于其生中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變避。 四、五浦項(xiàng)一 1.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。 2,加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫,不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。 3 .二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。 4 .DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的

7、關(guān)系： 當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于 0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。 5 .盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附， 由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí) 驗(yàn)過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。 ［診斷檢測］ 1 .下列圖示中能反映DNA溶解度與NaCl溶液濃度之間關(guān)系的是： NNCI 儂鑿 md/L) A、 OJ* ■ NC1 戢心

8、2 .在DNAg提取的實(shí)驗(yàn)過程中，得到白絲狀物主要成分就是DNA依據(jù)是 A.絲狀物易溶于2mol/L的氯化鈉溶液中 B.絲狀物溶解后，遇二苯胺（沸水浴）變藍(lán)色 C.絲狀物能在約為O.14mol/L氯化鈉溶液中析出 D.加酒精可使溶解的絲狀物再被析出 3 .在“DNA勺粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，向5mL血細(xì)胞液中加入20mL蒸儲(chǔ)水的目的是 A.使血細(xì)胞破裂B.防止血液凝固C.析出DNAD.使蛋白質(zhì)與DN的離 4 .在NaCl溶液中反復(fù)溶解、析出并過濾，就能除去DNA容液中的雜質(zhì)的理由不包括（） A.用高濃度鹽溶液溶解DNA能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì) B.用低濃度鹽溶液使DNAW出

9、，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì) C.反復(fù)操作就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì) D.反復(fù)操作就能夠使各種雜質(zhì)變性而沉淀析出 ［典例引路］ 在采用雞血為材料對(duì)DNA進(jìn)行粗提取的實(shí)驗(yàn)中，如果需要進(jìn)一步提取雜質(zhì)較少的DNA可以依據(jù)的原理是 （） A.在物質(zhì)的量濃度為0.14mol/L的氯化鈉溶液中DNA的溶解度最小 B.DNA遇二苯胺在沸水浴的條件下會(huì)變成藍(lán)色 C.DNA不溶于酒精而細(xì)胞中的一些物質(zhì)易溶于酒精 D.質(zhì)量濃度為0.1g/mL的檸檬酸鈉溶液具有抗凝血作用 有關(guān)DNA粗提取的操作，錯(cuò)誤的是 A.向溶解DNA的燒杯中加蒸儲(chǔ)水的目的是漂洗DNA 8. DNA和雜質(zhì)分

10、子在95%的冷酒精中溶解度存在差異 C.提取植物細(xì)胞DNA時(shí)需在研缽中加入洗滌劑和氯化鈉等試劑 步驟 具體措施 分析 選材、制備 雞血細(xì)胞液 雞血+擰檬酸鈉 用離心機(jī)離心，再放 冰箱內(nèi)靜置 雞血紅細(xì)胞,白細(xì)胞都具 行細(xì)胞核.含大垃DNA］ 檸檬酸鈉f抗凝劑）使血 液分層，血細(xì)胞處于底部 提取血細(xì) 胞核物質(zhì) ①雞血細(xì)胞液+蒸 摘水,快速沿一個(gè)方 向攪拌Emm ②紗布過濾 ①血細(xì)胞吸水漲破.快速 攪抻加速血細(xì)胞破裂 ②過濾得到佟染色質(zhì)的 謔液.送出細(xì)胞膜、細(xì)胞 器等破碎結(jié)構(gòu) 溶解 BNA ①注液+ ZhmW'L的 Nj心溶液10ml j（攪拌） ②紗布過濾不溶雜

11、質(zhì) 高鹽溶液溶解DNA,去 除不溶于高鹽溶液的雜 質(zhì) 折出含 DNA的 黏稠物 溶液十蒸儲(chǔ)水.輕輕 攬抨,析出絲狀物（直. 至小內(nèi)增加為止） NCI溶液相當(dāng)于被稀稀到 Ql lrmL'L,這一濃度 F IJNA 的溶解度最低而析出 過濾 多層紗布過濾 得到含DNA的茹稠物 DNA黏稠 物再溶解 2 tn ol/L NaCl 溶 液 20mL+上述黏稠物 f溶解 高鹽溶液溶解DNA.再 次去除不溶于高鹽溶液 的雜質(zhì) 過渡 用2層紗布過濾 濾液中含DNA,去除不 溶雜質(zhì) 提取含雜質(zhì) 較少的IJNA 上述濾液+冷卻的 95 %酒精 50mL 析出DNA.去

12、除溶于 95%冷酒精的雜質(zhì) DNA鑒定 絲狀物十。.015mol/L NaCl 溶液 5mL + ML二聚胺,沸水浴 5mm對(duì)照組不加此 狀物 ①試管1和試管2的自 變量是有無絲狀物,因變 量為有無淺藍(lán)色出現(xiàn) ②0, 015 mol/L NaCl 溶 液溶解DNA D.提取動(dòng)物細(xì)胞 DNA時(shí)可用雞血與蒸儲(chǔ)水混合后用玻璃棒攪拌 ［歸納總結(jié)］ 1.雞血細(xì)胞的DNA提取 2 .實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵 ⑴取材不用哺乳動(dòng)物的血細(xì)胞（由于成熟紅細(xì)胞無細(xì)胞核）。 （2）獲取DNA時(shí)要向雞血細(xì)胞液加入足量的蒸儲(chǔ)水，以便使細(xì)胞膜和核膜破裂，把核內(nèi)物質(zhì)釋放出來。 （3）實(shí)驗(yàn)中的攪拌，除最后一次攪拌

13、 外，其余攪拌均要朝一個(gè)方向。并且，在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步驟攪拌都要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，防止DNA分子斷裂。 3 .此實(shí)驗(yàn)過程中有幾次使用蒸儲(chǔ)水？幾次過濾，幾次析出，幾次攪拌？ 答：整個(gè)實(shí)驗(yàn)共“兩次蒸儲(chǔ)水，三次 過濾，兩次析出” ①兩次蒸儲(chǔ)水 第一次：細(xì)胞吸水脹破 第二次：使DNA黏稠物析出 ②三次過濾 第一次：DNA存在于濾液里 第二次：DNA被留在紗布上 第三次：DNA存在于濾液里 過濾時(shí)使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關(guān)，第二次要用其濾出的黏稠物有關(guān)，所以要使用多層紗布， 第一次和第三次均要用其濾液，使用 的紗布為1—2層 ③兩

14、次析出 第一次：用0.14mol/L的NaCl溶液,含雜質(zhì)多 第二次：用冷卻的95%的酒精 4 .預(yù)冷的酒精溶液具有的優(yōu)點(diǎn) ①抑制核酸水解酶活性，防止DNA 降解。 ②降低分子運(yùn)動(dòng)易于形成沉淀析出。 ③低溫有利于增加DNA分子柔韌 性，減少斷裂。 5 .評(píng)價(jià)：觀察彳提取的DNA1色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說 明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備 本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì) 6 .酒精的使用 ①觀察花生種子子葉細(xì)胞脂肪顆粒時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為50%

15、的酒精洗去浮色 ②葉綠體色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)中，用無水酒精作有機(jī)溶劑提取色素 ③制作洋蔥根尖細(xì)胞裝片時(shí)，用鹽酸和酒精的混和液對(duì)根尖進(jìn)行解離 ④DNA粗提取過程中，用體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精可以進(jìn)一步純化DNA ⑤70%勺酒精用于消毒，如果酒的制作 ［變式訓(xùn)練］ （多選）下列DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)操作中，經(jīng)離心或過濾后取上清液或?yàn)V液的有 A.在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，混合均勻后離心 B.在盛有血細(xì)胞的塑料燒杯中加蒸儲(chǔ)水，快速攪拌后過濾 C.在2mol/L的氯化鈉溶液中放入絲狀物，輕輕攪拌后過濾 D.在溶有DNA的氯化鈉溶液中緩緩加入蒸儲(chǔ)水，輕輕攪拌后過濾 ［當(dāng)堂反饋］

16、 1 .下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的說法中，正確的是 A.析出DNA時(shí)要緩慢地加蒸儲(chǔ)水，當(dāng)析出黏稠物時(shí)即不再加水 B.在探究洗滌劑對(duì)植物細(xì)胞DNA提取的影響實(shí)驗(yàn)中，自變量是洗滌劑和食鹽 C.提取的DNA溶解后加入二苯胺試劑即可染成藍(lán)色 D.將含有DNA的濾液放在60c?75c的恒溫水浴箱中保溫后過濾，能去除蛋白質(zhì)雜質(zhì) 2 .（多）"DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為2mL 的四種溶液中，經(jīng)攪拌后過濾，獲得4種濾液，含DNA$少的是 1 蒸儲(chǔ)水中 攪拌后過濾 濾?夜E 2 2mol/L的NaCl溶液 攪拌后過濾 濾?夜F 3

17、O.14mol/L的NaCl溶液中 攪拌后過濾 濾?夜G 4 冷卻的95%的酒精溶液中 攪拌后過濾 濾?夜H A.濾液EB.濾液FC.濾液GD.濾液H 3 .在DNA勺粗提取與鑒定試驗(yàn)中，有兩次DNA勺沉淀析出，其依據(jù)的原理是 ①DNABNaCl的物質(zhì)的量的濃度為O.14mol/L時(shí)，溶解度最低②DNAB冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精中能沉淀析出 A.兩次都是①B.兩次都是② C.第一次是①，第二次是②D.第一次是②，第二次是① 4 .（多選）有關(guān)DNA?提取的操作，正確的是 A.盛放雞血細(xì)胞液的容器最好是塑料容器 B.將雞血細(xì)胞液與蒸儲(chǔ)水混合，用玻璃棒沿一個(gè)方向快速

18、攪拌，釋放DNA C.向溶解DNA勺燒杯中加蒸儲(chǔ)水的目的是漂洗DNA D.用漏斗和濾紙過濾析出的DNA得到DNA占稠物 5.在《DNA粗提取》實(shí)驗(yàn)中，為得到含DNA的黏稠物，某同學(xué)進(jìn)行了如下操作： ①在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，經(jīng)離心后，除去血漿留下血細(xì)胞備用。 ②取5—10mL血細(xì)胞放入50mL的塑料燒杯中，并立即注入20mid.015mol/L的氯化鈉溶液，快速攪拌5min后經(jīng)濾紙過濾，取得其濾液。 ③濾液中加人40mL2mol/L的氯化鈉溶液，并用玻璃棒一個(gè)方向快速攪拌lmin。 ④上述溶液中緩緩加人蒸儲(chǔ)水，同時(shí)用玻璃棒沿一個(gè)方向不停地輕輕攪拌，同時(shí)加蒸儲(chǔ)水，直到溶液中

19、出 現(xiàn)絲狀物為止，再進(jìn)行過濾而得到含DNA的黏稠物。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果是：所得含DNA的黏稠物極少，導(dǎo)致下一步實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。 請(qǐng)指出并改正該同學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作上的三個(gè)錯(cuò)誤：（3分） （標(biāo)明濃度）；提取含雜質(zhì)較少的 DNA的 （2分） DNA ,而用動(dòng)物的肝臟組織作為 （2）按正確操作提取和過濾黏稠物后，再溶解黏稠物所用的溶劑為 方法是。 （3）鑒定DNA的試劑是試劑，DNA鑒定時(shí)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置方法為。 （4）采用牛或羊的血液做實(shí)驗(yàn)，取材方便，但即使正確操作也無法提取到實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，原因是，實(shí)驗(yàn)中最好增加一步驟為。 （10分）（1）0.015mol/L的氯化鈉溶液應(yīng)改為蒸儲(chǔ)水

20、；濾紙應(yīng)改為紗布；直到溶液中出現(xiàn)絲狀物為止應(yīng)改 為直到溶液中絲狀物不再增加為止（每項(xiàng)1分） （2）2mol/L的NaCl溶液加入冷卻的、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精 （3）二苯胺 向試管中只加0.015mol/L的NaCl溶液和二苯胺試劑，不加DNA,沸水浴 （4）哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核研磨 ①提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)將制備好的雞血細(xì)胞液5mL?10mL注入到50mL燒杯中。向燒杯中加入 蒸儲(chǔ)水20mL,同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢?min,使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過濾至500ml.取其濾液。 ②溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA各氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L40m

21、L加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min,使其混合均勻，這時(shí)DNA^溶液中呈溶解狀態(tài) ③析出含DNA的粘稠物沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸儲(chǔ)水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物 出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸儲(chǔ)水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸儲(chǔ)水（這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14mol/L） ④濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至500mL的燒杯中，含DNA的粘稠 物被留在紗布上 ⑤將DNA的粘稠物再溶解取1個(gè)50mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L的溶液 20mL用鈍頭鐐子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地?cái)嚢?，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中 ⑥過濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個(gè)100mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。取其濾 液，DNA溶于濾液中 ⑦提取含雜質(zhì)較少的DNA在上述濾過的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為95%的溶液50mL（使用 冷卻的酒精，對(duì)DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA ⑧DNA的鑒定 6 / 5