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1、核酸擴(kuò)增技術(shù)主要內(nèi)主要內(nèi)容容第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)第二節(jié) 熒光定量PCR技術(shù)第三節(jié) 其他核酸擴(kuò)增技術(shù)第四節(jié) 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗室的管理與質(zhì)量控制第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) polymerase chain reaction, PCR一、 PCR技術(shù)發(fā)展簡史二、 PCR技術(shù)原理三、 PCR反應(yīng)體系、條件及其優(yōu)化四、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測及分析五、 PCR常見問題與原因分析六、PCR衍生技術(shù)PCR技術(shù)發(fā)展簡史 Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。 1985年Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)，使用的DNA聚合酶是Klenow片段。(1993年諾貝爾化學(xué)獎獲得者年諾貝爾化學(xué)獎獲得者

2、) PCR技術(shù)發(fā)展簡史 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR。 1988年Saiki 發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶，從此PCR技術(shù)得以廣泛應(yīng)用?；驹?N= N0(1+E)cPCR反應(yīng)體系、條件及其優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系 模板（template） 引物（primers） DNA 聚合酶 (DNA polymerase) dNTP PCR緩沖液（PCR buffer） PCR反應(yīng)條件 變性 退火 延伸 循環(huán) DNA RNA：總RNA、mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA引物（primers) 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)

3、域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。3355Sense primerAntisense primer引物的重要性 在整個PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進(jìn)行有效的延伸，可見引物設(shè)計好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。引物設(shè)計總原則 引物與模板的序列要緊密互補(bǔ) 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。 引物設(shè)計一般原則 引物長度 堿基分布的均衡性 Tm值 引物二級結(jié)構(gòu) 引物3端 引物

4、5端 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 引物的保守性與特異性 擴(kuò)增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)引物長度 一般為15-30個核苷酸，常用的是18-24 bp。在做長片段在做長片段PCRPCR或做某些特殊的或做某些特殊的PCRPCR時應(yīng)使用較長的引物，但最多不超過時應(yīng)使用較長的引物，但最多不超過5050個個核苷酸。核苷酸。 引物過短會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于引物過短會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp16bp是必是必要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為12bp12bp的引物在的引物在人類基因組上存在人類基因組上存在200200個潛在的退火位點(diǎn)個潛在的退火位點(diǎn)(3 x

5、 10(3 x 109 9/4/41212=200 ).=200 ).而一個長度為而一個長度為20bp20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/4001/400個個. . 較長的引物（較長的引物（28-35bp)28-35bp)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)堿基分布的均衡性 GC含量一般40-60%，推薦45-55%或50-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性 GC含量太高也易于引發(fā)

6、非特異擴(kuò)增。 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個引物Tm值 一般要求：55-65。 計算： 對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算 對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件最常用的計算方式。 Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15引物二級結(jié)構(gòu) 引物二聚體 盡可能避免兩個引物分子之間3端有有較多堿基互補(bǔ) 發(fā)夾結(jié)構(gòu) 尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。引物3端 引物的延伸從引物的延伸從3

7、3端開始，因此端開始，因此3 3端的幾個堿基與模板端的幾個堿基與模板DNADNA均需均需嚴(yán)格配對，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致導(dǎo)致PCRPCR擴(kuò)增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，擴(kuò)增完全失敗。考慮到密碼子的簡并性，引物3端最后一個堿基最好不與密碼子第三個堿基配對。引物。引物3 3端端不要出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如，如GGG GGG 或或CCCCCC，否則會使錯誤引發(fā)機(jī)，否則會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加。率增加。 引物引物3 3端的末位堿基對端的末位堿基對Taq Taq 酶的酶的DNADNA合成效率有較大的影響。合成效率有較大的影響

8、。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3 3端使用堿基端使用堿基A A。引物5端 引物引物5 5端可以有與模板端可以有與模板DNADNA不配對堿基，在不配對堿基，在5 5端引端引入一段非模板依賴性序列。入一段非模板依賴性序列。 5 5端加上端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)5 5端加端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。 5 5端的某一位點(diǎn)修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該端的某一位點(diǎn)修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的

9、位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。以作研究。 5 5端端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。辛等）。引物的保守性與特異性 保守性：通用引物檢測同一類病原微生物盡可能多的型別 特異性：避免非特異性擴(kuò)增擴(kuò)增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu) 模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，在選擇引物時，應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。 擴(kuò)增區(qū)域的自由能（G。）小于58.61kJ/mol 引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30 Tm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length

10、(primer premier 5.0)lTm product = 81.5 + 16.6(log10(Na+) + 0.41 (%G + %C) - 600/length (primer 3)引物與PCR 引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L 引物濃度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O (單位：L) 退火溫度 最適退火溫度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of product) 25 一般采用較引物Tm值低5作為PCR退火溫度。引物設(shè)計軟件引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5.

11、0 Oligo Primer express primer 3 MethPrimerDNA 聚合酶(DNA polymerase) 特性： 熱穩(wěn)定性:92.5、95、97.5時，半衰期分別為130min、40min、5-6min 延伸效率:75-80時，150個核苷酸/s 校正功能:Taq DNA聚合酶沒有3-5外切酶活性，Vent 、pfu等具有3-5外切酶活性dNTP dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。 量：20-200umol/L dNTP會絡(luò)合Mg2+，當(dāng)PCR需要較高濃度的dNTP時，應(yīng)在反應(yīng)體系中適當(dāng)增加Mg2+濃度。 PCR緩沖液（PCR buffer） 一般

12、組成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室溫PH8.3) ，1.5mM MgCl2 Mg2+濃度： 附加成分：牛血清白蛋白、明膠、非離子去污劑（如Tween20，濃度0.05%）二甲亞砜（DMSO）PCR一般方案反應(yīng)組成 50 ul PCR反應(yīng)體系的組成： 樣品DNA 0.11ug； 正、負(fù)鏈引物（25umol/L）各1.0ul； 脫氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul 10PCR緩沖液 5.0ul ； MgCl2（25mmol/L）3.0ul ； Taq DNA聚合酶12.5u ； 蒸餾的去離子水補(bǔ)至50ul，短暫離心混勻。 陽性對照、空白對照分別以陽性模

13、板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。 PCR 94, 300S 94, 60S 30 55, 60S 72, 60S 72, 5-10min PCRPCR一般方案一般方案熱循環(huán)熱循環(huán)PCR反應(yīng)體系、條件的優(yōu)化 三磷酸脫氧核苷酸 耐熱DNA聚合酶 緩沖液 模板核酸 引物 Mg2+ 變性溫度與時間 復(fù)性溫度與時間 延伸溫度與時間 循環(huán)數(shù)和擴(kuò)增效率 降落PCR (Touchdown PCR) 熱啟動PCR（hot start PCR）降落 PCR(Touchdown PCR) 根據(jù)引物Tm值，選定一個退火溫度范圍（跨越10-20的溫度范圍，引物Tm值在這個范圍之內(nèi)）。在設(shè)置循環(huán)參數(shù)時，讓退火溫度

14、從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低1-5），最后結(jié)束在選定范圍的最低溫度。在每一個退火溫度上循環(huán)2-5次。 舉例：如果一對引物的Tm值為60，可設(shè)置退火溫度從63降低到48，每次降低1，每個退火溫度循環(huán)兩個周期，最后在48退火溫度下做15個循環(huán)。熱啟動PCR（hot start PCR） PCR反應(yīng)體系中先不加Taq DNA聚合酶，等PCR擴(kuò)增儀的溫度上升到80以后再加Taq DNA聚合酶。 將石蠟珠在Ependorf管中PCR反應(yīng)液上面融化并凝固，在石蠟層上面加上Taq DNA聚合酶。在溫度上升到變性溫度時，石蠟融化，Taq DNA聚合酶進(jìn)入反應(yīng)體系，通過對流作用而混勻。

15、在PCR反應(yīng)液中加入Taq DNA聚合酶的單克隆抗體，再加入Taq DNA聚合酶，在溫度上升到將此抗體變性滅活前，抗體中和Taq DNA聚合酶活性，Taq DNA聚合酶對引物無法進(jìn)行延伸。待溫度上升到足夠高時，抗體失活，擴(kuò)增反應(yīng)開始。 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及分析 凝膠電泳： 瓊脂糖凝膠電泳法 聚丙烯酰胺凝膠電泳法 PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP） 單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP） 核酸探針雜交法 PCR產(chǎn)物測序 瓊脂糖凝膠電泳 制膠 加樣 電泳 紫外光檢測 特點(diǎn)： 分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開； 上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠； 回收的DNA純度高； 采用銀染

16、色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點(diǎn)。 用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR。聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 據(jù)目的基因序列可查出所包含的酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后進(jìn)行電泳，觀察消化片段的大小是否與序列資料相符。 用途： 傳染病病原體基因分型 人類基因的變異性研究。單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP） 將PCR 產(chǎn)物雙鏈DNA（

17、dsDNA）變性為單鏈DNA （ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA 分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。核酸探針雜交法 點(diǎn)雜交 反向點(diǎn)雜交 微孔板雜交 熒光探針雜交法點(diǎn)雜交（dot blot） 原理：將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后直接點(diǎn)在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的寡核苷酸探針與之雜交。 探針： 放射性同位素標(biāo)記探針檢測的敏感、特異，具有不穩(wěn)定性和放射性危害。 非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛、熒光素等）標(biāo)記的探針穩(wěn)定性高、使用安全、檢測速

18、度快 用途：主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。反向點(diǎn)雜交(reverse dot blot) 原理：使用帶有標(biāo)記物的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性。將不同的寡核酸探針固定在尼龍膜上，用變性的PCR產(chǎn)物與之雜交。 探針：嚴(yán)格設(shè)計，具有相同的雜交反應(yīng)條件。 用途：反向點(diǎn)雜交特別適用于遺傳性疾病多個位點(diǎn)的點(diǎn)突變分析。 結(jié)果分析： 正常純合子 突變純合子 雜合子微孔板雜交( microplate hybridization) 夾心雜交夾心雜交熒光探針雜交法 目前臨床上常用熒光探針法來檢測PCR產(chǎn)物，主要的方法有TaqMan技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、復(fù)合探針法等。PCR產(chǎn)物測序 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行

19、測序是檢測PCR產(chǎn)物特異性最可靠的方法，可將PCR產(chǎn)物克隆到載體上進(jìn)行測序，也可對直接PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。常見問題原因分析及處理 假陽性 非特異性PCR產(chǎn)物 假陰性 引物二聚體 假陽性 PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。 含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。 陽性對照的污染。 標(biāo)本之間的交叉污染。 Taq聚合酶中帶有細(xì)菌DNA，當(dāng)PCR擴(kuò)增片段為保守的rRNA序列時，易造成假陽性。 怎么可能全家人都得了性病 ? 何某，女，46歲，某部隊衛(wèi)生所護(hù)士，離婚10年，與一男友交往5年。她近來忽然感到陰部瘙癢，白帶有異味，想到自己有非婚性行為，怕萬一得性病被人知道，便悄悄到郊區(qū)一個小診所去看病。結(jié)果被告知是淋病，用

20、了許多藥，未見明顯好轉(zhuǎn)。她通過查書感到問題嚴(yán)重”，擔(dān)心全家都會傳染，尤其是正讀初中的女兒被傳染上怎么辦？為了孩子，顧不上面子了。她不僅帶自己的女兒、70歲老母到醫(yī)院檢查，還動員最近與其同居一處的妹妹、妹夫及14歲的外甥女都到醫(yī)院檢查。醫(yī)師給他們用最先進(jìn)的PCR”檢測，結(jié)果6個人都是淋球菌感染”！ 非特異性PCR產(chǎn)物 引物特異性不高，引物用量過多，應(yīng)調(diào)換引物或降低引物用量。 Taq DNA聚合酶質(zhì)量不好或用量偏高，應(yīng)降低酶量或使用質(zhì)量較好的酶。 Mg2+ 濃度過高，可適當(dāng)調(diào)節(jié)Mg2+濃度。 退火溫度過低，退火及延伸時間偏長，可提高退火溫度，減少退火及延伸時間，或者采用二溫循環(huán)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。 熱

21、循環(huán)次數(shù)過多，適當(dāng)增加模板用量，減少循環(huán)次數(shù)。假陰性 引物設(shè)計是否合理 標(biāo)本中是否有Taq酶抑制劑，Taq酶是否失活。 反應(yīng)體系中有無蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95以上加熱10分鐘使其滅活。 反應(yīng)體系中是否有較難去除的蛋白質(zhì)抑制PCR系統(tǒng)，用蛋白酶K重新處理?？色@預(yù)期結(jié)果。 循環(huán)溫度，特別是解鏈溫度是否準(zhǔn)確，退火溫度是否過高。有些PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度不符，過高則酶在前幾個循環(huán)中迅速失活，過低則模板變性不徹底 檢測PCR產(chǎn)物方法靈敏度不夠，如瓊脂糖凝膠電泳法敏感性較低。 靶序列發(fā)生突變、缺失等引物二聚體 v兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3端

22、有互補(bǔ)區(qū)。v引物模板比例太高，可增加模板用量。v退火溫度過低。v熱循環(huán)次數(shù)過多。 PCR污染及預(yù)防措施 分開操作區(qū)域。 耐高壓的試劑及器材應(yīng)高溫高壓滅菌。 使用一次性Tip頭、Eppendorf管等。 小量分裝試劑。 樣品制備應(yīng)按無菌操作原則進(jìn)行，避免樣品間相互污染。 操作者帶手套操作，且應(yīng)勤換手套。 使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶控制PCR產(chǎn)物交叉污染。 每次PCR操作都應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照 。 RNA酶的污染與預(yù)防 去除外源RNase污染 玻璃器皿常規(guī)洗凈后，應(yīng)用0.1% DEPC處理。 所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05%0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理。 操作者戴口罩和手套。 材料器材使用

23、滅菌一次性用品。 抑制內(nèi)源性RNase的活性 使用低特異性RNase抑制物：如皂土、復(fù)合硅酸鹽、肝素、DEPC等。 去除蛋白質(zhì)物質(zhì)：蛋白質(zhì)變性劑、蛋白酶K、陰離子去污劑等，常與RNA酶抑制物聯(lián)合使用，以加強(qiáng)對RNase活力的抑制。 RNase的特異性抑制劑：如RNase阻抑蛋白（RNasin）、氧釩核糖核苷復(fù)合物。 PCR衍生技術(shù) 巢式PCR（nested PCR ） 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 重組PCR(recombinant PCR) 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不對

24、稱PCR（asymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 擴(kuò)增長片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 定量PCR 巢式PCR（nested PCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42）MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37）逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄引物隨機(jī)引物；隨機(jī)引物；Oligo(dT)；特異性引物。特異性引物。one-step RT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄：在同一體

25、系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、引物、Taq DNA聚合酶、聚合酶、PCR引物、引物、dNTP和緩沖液，直和緩沖液，直接以接以mRNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱為一步法擴(kuò)增，稱為一步法RT-PCR。多重PCR(multiplex PCR) 重組PCR(recombinant PCR) 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 基本原理：抽提細(xì)胞總基本原理：抽提細(xì)胞總RNA或或mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成作用下合成cDNA，通過，通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA 3端加上端加上poly(dG)尾。據(jù)此設(shè)計錨定引物尾。據(jù)此設(shè)計錨定引物po

26、ly(dC)，為，為提高擴(kuò)增特異性，提高擴(kuò)增特異性，poly(dC)在十二聚以上，錨定引物在十二聚以上，錨定引物5端可加上某些限制性內(nèi)切酶識別序列或其它序列信端可加上某些限制性內(nèi)切酶識別序列或其它序列信息。根據(jù)已知的息。根據(jù)已知的3端序列設(shè)計基因特異性引物，與錨端序列設(shè)計基因特異性引物，與錨定引物一起進(jìn)行定引物一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。用途：檢測用途：檢測T細(xì)胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。細(xì)胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。不對稱PCR（asymmetric PCR） 基本原理：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物(高濃度引物)與限制性引物(低濃度引物)，二者之比為50-100：1。在PCR最

27、初10-15個循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)；第15個循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA(ssDNA)。 關(guān)鍵：控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優(yōu)化兩條引物的比例。也有人先用等濃度的引物PCR擴(kuò)增，制備雙鏈DNA；然后以雙鏈DNA為模板，再以其中的一條引物進(jìn)行第二次PCR，制備單鏈DNA。 反向PCR（reverse PCR） 反向PCR用于快速擴(kuò)增已知序列以外的未知DNA片段，從而對未知序進(jìn)行分析研究。該法首先用已知序列和待擴(kuò)增序列都沒有切點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶將模板DNA消化，再用連接酶使酶切產(chǎn)物環(huán)化，使已知的和待擴(kuò)增的未知序列都

28、包含在環(huán)中。在已知序列內(nèi)設(shè)計一對反向的引物，即可擴(kuò)增已知序列以外的區(qū)域。反向反向PCR已知序列PCR用途用途：未知序列的研究未知序列的研究限制酶切點(diǎn)（限制酶切點(diǎn)（X）限制酶切點(diǎn)（限制酶切點(diǎn)（X）限制酶限制酶X酶切酶切連接連接未知序列未知序列擴(kuò)增長片段PCR（long PCR） 模板完整性：應(yīng)用瓊脂糖包埋細(xì)胞抽提法模板DNA 。 引物：一般較長（22-35nt），Tm值較大。 DNA聚合酶：長片段PCR應(yīng)采用錯配率低的耐熱DNA聚合酶：如Ampli Taq、rTth、Hot Tube、Vent、Deen Vent、Pfu、rTma等。Vent、Deen Vent、Pfu、rTma等聚合酶有3-5

29、外切酶活性。 PCR緩沖液：增加Tris的濃度或改用Tricine緩沖液以增強(qiáng)緩沖能力，并使緩沖液pH適度升高。此外，加入適量的甘油、DMSO（二甲亞砜）、明膠、聚乙二醇、Tween 20等物質(zhì)，有助于模板變性和維持DNA聚合酶的穩(wěn)定。 熱循環(huán)：增加延伸時間（一般1kb/min），提高退火溫度，同時采用熱啟動。熱循環(huán)后期，適當(dāng)增加延伸時間，以保證產(chǎn)物充分延伸。免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR（in situ PCR ） 直接法：使用標(biāo)記（放射性同位素、生物素、地高辛、熒光素等）的引物或脫氧三磷酸核苷酸（如dUTP）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則標(biāo)記物摻入到PCR 產(chǎn)物中。最后用放射自顯影、免疫

30、組化或熒光法檢測 PCR 產(chǎn)物及其在細(xì)胞內(nèi)位置。 間接法：先進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA的原位擴(kuò)增，然后用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行原位雜交。 原位逆轉(zhuǎn)錄PCR（in situ reverse transciption PCR）定量PCR 概念：通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板進(jìn)行定量的技術(shù) 。 N= N0(1+E)c 定量PCR中擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法 凝膠電泳： PCR-ELISA 熒光PCR法 由于熒光PCR可使用現(xiàn)代化儀器對PCR產(chǎn)物實(shí)行實(shí)時檢測，很容易保證擴(kuò)增在指數(shù)增長期內(nèi)進(jìn)行，是定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的一個發(fā)展方向。第二節(jié) 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Fluorescence Qua

31、ntitive Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR） 一、熒光定量PCR技術(shù)基本原理 二、熒光定量PCR技術(shù) 三、熒光定量PCR測定的數(shù)據(jù)處理 四、實(shí)時熒光定量 PCR技術(shù)的應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)基本原理 熒光擴(kuò)增曲線圖 Ct值 標(biāo)準(zhǔn)定量曲線 熒光擴(kuò)增曲線圖熒光定量PCR：通過對 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行,PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每個循環(huán)收集一個熒光強(qiáng)度信號，通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線.Ct 值 N= N0(1+E) c

32、 logN=logN0+clog(1+e) Ct值的重現(xiàn)性 PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。初始模板量的對數(shù)與初始模板量的對數(shù)與C(T)C(T)循環(huán)數(shù)之間循環(huán)數(shù)之間 呈線性關(guān)系呈線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)定量曲線標(biāo)準(zhǔn)定量曲線熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)初始模板量對數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光定量PCR技術(shù) 熒光染料法熒光標(biāo)記探針 TaqMan熒光標(biāo)記探針 molecular Beacon熒光標(biāo)記探針 熒光標(biāo)記雜交雙

33、探針熒光染料法SYBR染料 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。5353SGExcitationSGSGSGSGEmission雙鏈熒光染料雙鏈熒光染料5353SGSGSGSGSGExcitationEmission溶解曲線分析（溶解曲線分析（TmTm）特異性問題特異性問題TaqMan探針法 遵循一般引物設(shè)計原則； 引物之間的Tm相差避免超過2； 為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；TaqMan技術(shù)引物設(shè)計原則Taq

34、Man探針設(shè)計原則 先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針； 探針長度應(yīng)在15-45bp（最好是20-30bp)，以保證結(jié)合特異性； 探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)；盡量避開二級結(jié)構(gòu)； Tm值在65-70，通常比引物Tm值高5-10，GC含量在40%70%； 探針的5端應(yīng)避免使用G鳥嘌呤因為5G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用； 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量G含量高會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針； 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。TaqMan MGB 探針設(shè)

35、計 盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于13bp。 盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。 原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)。分子信標(biāo)技術(shù) 工作原理 發(fā)夾形的寡聚核苷酸探針 內(nèi)部淬滅的熒光團(tuán)Loop 能和靶序列互補(bǔ)Stem 是由互補(bǔ)序列組成RQExcitationRQQRExcitationEmissionOligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640FRET ProbesExcitationEmissionTransfer熒光能量傳遞熒光能量傳遞復(fù)

36、合探針法 其他核酸擴(kuò)增技術(shù) 核酸序列依賴性擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA) 連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction，LCR) 分枝DNA信號放大系統(tǒng) 核酸序列依賴性擴(kuò)增連接酶鏈反應(yīng)分枝DNA信號放大系統(tǒng)第四節(jié) 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗室的管理與質(zhì)量控制 一、臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室的規(guī)范化設(shè)置 二、操作人員培訓(xùn) 三、臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室質(zhì)量保證 臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室的規(guī)范化設(shè)置操作人員培訓(xùn) 臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)。經(jīng)過培訓(xùn)合格者，由培訓(xùn)單位頒發(fā)合格證書，并將培訓(xùn)合格人員名單報衛(wèi)生部臨檢中心備案。獲得培訓(xùn)合格證書者方可從事臨床基因擴(kuò)增檢驗工作。臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室質(zhì)量保證 標(biāo)本的采集 標(biāo)本的預(yù)處理 標(biāo)本的運(yùn)送 臨床標(biāo)本的接收 核酸的提取 靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增 污染與預(yù)防 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 質(zhì)量控制 室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC） 標(biāo)本制備 逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增 板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控 測定結(jié)果的評價與報告 室間質(zhì)量評價（EQA）