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1、基因芯片技術(shù)在檢測(cè)腸道致病菌方面的應(yīng)用 摘要：當(dāng)前，基因芯片技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于各種研究領(lǐng)域，如基因突變及多態(tài)性分析、細(xì)菌基因鑒定、致病分子機(jī)理、表達(dá)譜分析、DNA測(cè)序等多個(gè)方面。文中通過毒力因子的檢測(cè)、通用引物結(jié)合基因芯片來檢測(cè)腸道致病菌。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，也會(huì)伴隨著各種問題的產(chǎn)生，只有不斷地發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，改進(jìn)基因芯片檢測(cè)技術(shù)，才能不斷的完善基因芯片檢測(cè)技術(shù)。隨著檢測(cè)的目的的致病菌的種類的不斷的增加、基因芯片技術(shù)檢測(cè)方法不斷創(chuàng)新，使得基因芯片檢測(cè)技術(shù)不斷的成熟和完善。 關(guān)鍵詞：基因芯片 腸道致病菌 檢測(cè) Gene chip technology in the detect

2、ion of intestinal pathogenic bacteria ABSTRACT ：At present, the gene chip technology is widely applied in various research fields, such as gene mutation and polymorphism analysis, identification, pathogenic molecular mechanism of bacterial genes, expression profile analysis, DNA sequencing, and oth

3、er aspects.By detecting the virulence factors, general primer combination of gene chip to detect the intestinal pathogenic bacteria.With the development of gene chip technology, will be accompanied by the production of all kinds of problems, only by constantly to find problems, solve the problem, im

4、prove gene chip detection technology, to constantly improve the gene chip detection technology.With type of detection of pathogenic bacteria of the purpose of continuously increase, gene chip technology to detect method, continuous innovation, making gene chip detection technology continues to matur

5、e and perfect. Keywords: Gene chip； Intestinal pathogens； Detection 當(dāng)前在食物生產(chǎn)全球化的大背景下，由于人們飲食習(xí)慣的改變以及世界的環(huán)境衛(wèi)生狀況越來越差，食品的安全性降低，引發(fā)了全世界人們的關(guān)注。由于食品安全性的降低，誘發(fā)了腸道致病菌的感染。因此，隨著人們關(guān)注食品安全程度的越來越高，自然的關(guān)注到了腸道致病菌的感染。當(dāng)前，世界上有很多的國家都非常注重這個(gè)問題，并采取了相應(yīng)的措施。當(dāng)前，切斷導(dǎo)致病菌的傳染途徑，改善人們的生活條件和飲食條件已經(jīng)成了刻不容緩的問題。本文所論述的正是基因芯片檢測(cè)技術(shù)在腸道致病菌檢測(cè)方面的應(yīng)

6、用。 一、基因芯片技術(shù)簡介 20世紀(jì)80年代，基因芯片技術(shù)誕生。它利用了生物化學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科的現(xiàn)代技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了樣品監(jiān)測(cè)分析過程中的連續(xù)化、集成化和微型化。Ye等學(xué)者詳細(xì)的介紹了基因芯片技術(shù)在微生物方面的應(yīng)用?；蛐酒侵阜聪虬唿c(diǎn)雜交，特異探針以一定得方式固定在某種介質(zhì)上，掃描時(shí)以點(diǎn)出現(xiàn)，每一個(gè)點(diǎn)代表一種特異性探針序列。這種技術(shù)可以檢測(cè)多種片段，比如：基因組DNA、總RNA 、a RNA、質(zhì)粒RNA等等。標(biāo)記的方法一般是利用熒光基因通過特定波長進(jìn)行掃描檢測(cè)。 二、基因芯片技術(shù)檢測(cè)腸道致病菌 基因芯片技術(shù)不但提高了檢測(cè)的水平，而且能夠同時(shí)對(duì)多種致病菌進(jìn)行鑒定，這是傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如

7、分子生物學(xué)、免疫學(xué)技術(shù)所不能比擬的。不僅縮短了檢測(cè)的周期，而且結(jié)果自動(dòng)化分析，避免了由于操作人員的錯(cuò)誤而導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果，是食品安全檢測(cè)方面的重大技術(shù)突破。 2.1 檢測(cè)腸道致病菌的毒力因子 當(dāng)前科研人員選取各種致病菌特異性的毒力因子作為檢測(cè)的靶標(biāo)。通過多重PCR的方法擴(kuò)增多種致病菌，同時(shí)標(biāo)記PCR產(chǎn)物，然后經(jīng)過基因芯片雜交進(jìn)行鑒定。Chizhikow 等學(xué)者以多重PCR擴(kuò)增與食源性致病菌相關(guān)的6種毒力因子為基礎(chǔ)建立了一種基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，和芯片雜交的方式鑒定了6種基因。目前這種技術(shù)路線應(yīng)用于少數(shù)腸道致病菌鑒定方面，效果良好。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)建立了一種用于甄別霍亂弧菌O139的基因芯片和出血

8、性大腸桿菌O157：H7，通過檢測(cè)毒力基因以及SNP s位點(diǎn)，將霍亂弧菌O139和O1以及出血性大腸桿菌O157：H7和非H7。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難看出，通過多重PCR擴(kuò)增，將致病菌的毒力因子作為檢測(cè)目標(biāo)的靶細(xì)菌，以雜交篩選的方式和基因芯片相結(jié)合是完全可行的。充分體現(xiàn)了基因芯片檢測(cè)技術(shù)的的靈敏度高、特異性、等特點(diǎn)。彌補(bǔ)了多重PCR不能鑒定多種目的的片段的弊端。但是這種技術(shù)仍然受制于多重PCR，檢測(cè)的數(shù)量少。但是對(duì)于細(xì)菌分型等方面，非常適用。 2.2 通過引物結(jié)合基因芯片檢測(cè)腸道致病菌 2.2.1 通用引物擴(kuò)增16S rDNA基因、23SrDNA基因 該2種基因具有非常重要的生物學(xué)意義，在生物進(jìn)

9、化過程中比其他的基因演變的慢，被稱為“細(xì)菌進(jìn)化的活化石”。然而保守性是相對(duì)的，序列中仍然存在著特異性的片段，且不同菌屬差異性很大。因此，在細(xì)菌的保守性區(qū)域，設(shè)計(jì)通用引物，一次就可擴(kuò)增出多種細(xì)菌的目的片段。然后采用標(biāo)記法、滲入法以及末端標(biāo)記法等，設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的特異性探針，通過基因芯片與PCR產(chǎn)物雜交的結(jié)果對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。有的實(shí)驗(yàn)室的基因芯片研究小組對(duì)致病菌的16S rDNA和23S rNDA基因進(jìn)行檢測(cè)，建立了一種基于二重PCR方法的基因芯片檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)15種腸道致病菌，檢測(cè)的靈敏度達(dá)到103 CFU/mL。 于選取的目的基因保守性相對(duì)較強(qiáng)，有些致病菌只能鑒定到細(xì)菌屬的水平，無法鑒定到

10、細(xì)菌種的水平。但是與毒力基因檢測(cè)方法相比較，達(dá)到高通量檢測(cè)的水平，突破了檢測(cè)數(shù)量的限制，操作簡單，成本較低，適用于食品安全體系的監(jiān)控等多個(gè)方面。 2.2.2 基因芯片直接檢測(cè)致病菌的16S rRNA基因 因?yàn)樵谝恍┹^為復(fù)雜的介質(zhì)中如土壤、糞便等，一些PCR反映抑制物存在，使得細(xì)菌核酸進(jìn)行PCR跨增是非常困難的。解決方法之一是直接檢測(cè)致病菌的rRNA。 原理：將16S rRNA序列上不同種屬的特異性片段作為探針（1000 bp 左右），反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記后，直接檢測(cè)rRNA 可顯示介質(zhì)中致病菌的死活狀態(tài)。方法弊端，靈敏度較低。 Guschin等學(xué)者開建立一種基于聚丙烯酰胺凝膠墊的基因芯片檢測(cè)系

11、統(tǒng)，也適用于檢測(cè)16S rRNA。盡管直接檢測(cè)16S rRNA基因，能夠檢測(cè)致病菌的死活狀態(tài)，特異性很好，但是這種檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)條件和操作者的水平要求較高，靈敏度較低。并且該方法還受到致病菌所處的生長狀態(tài)和介質(zhì)形態(tài)等因素的影響。因此很難再實(shí)際的檢測(cè)中推廣。 2.2.3 基因芯片直接檢測(cè)致病菌的DNA 直接檢測(cè)DNA同樣可以解決復(fù)雜樣品中存在酶抑制物的問題。其原理與直接檢測(cè)rRNA相似。由于DNA本身更加的穩(wěn)定，易操作而且在細(xì)菌體內(nèi)的含量較高，所以直接檢測(cè)DNA的方法不能確定致病菌的死活狀態(tài)，但卻能夠更好的鑒定腸道致病菌。 Sekowshi 等學(xué)者通過基因芯片與基因組DNA雜交的方法，從而區(qū)分

12、腸出血性大腸桿菌O157:H7和非致病性大腸桿菌，該方法的靈敏度要高于免疫學(xué)的方法。 當(dāng)樣品中含有較低濃度的致病菌時(shí)，直接檢測(cè)樣品中分離出的DNA相當(dāng)?shù)睦щy。并且不同的菌屬之間存在許多的同源序列，不可避免的就存在很多同源性序列交叉現(xiàn)象，而且對(duì)探針的設(shè)計(jì)要求很高。對(duì)結(jié)果影響較大。因此與結(jié)合PCR擴(kuò)增的基因芯片方法相比，這種方法限于實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究。 三、基因芯片用于細(xì)菌分型 基因芯片檢測(cè)致病菌技術(shù)還可以應(yīng)用到微生物的基礎(chǔ)研究過程中，通過對(duì)致病菌基因組DNA、rRNA進(jìn)行遺傳分析，從而計(jì)算出細(xì)菌種屬間的遺傳距離以及判斷分析菌體的毒性等。Borucki等學(xué)者建立了一種鑒定不同血清型的單增

13、李氏菌的基因組芯片，從而清晰的將24種單增李氏菌區(qū)分為倆種類型。該基因組分型芯片的結(jié)果正確與否要同足跡法技術(shù)比較，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與足跡法技術(shù)一致，結(jié)果正確。本實(shí)驗(yàn)室建立了炭疽桿菌基因組芯片，通過與其他芽孢桿菌組雜交，鑒定出炭疽桿菌特異性基因。這種方法適用于高通量的篩選出多種差異基因，還可以對(duì)更大規(guī)模的基因進(jìn)行篩選，可以應(yīng)用到細(xì)菌致病分子機(jī)理等基礎(chǔ)研究中。 四、基因芯片在腸道致病菌檢測(cè)方面存在的問題及解決途徑 4.1 基因芯片在腸道致病菌檢測(cè)方面存在的問題 基因芯片技術(shù)雖然彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的很多不足之處，比如不能同時(shí)檢測(cè)大規(guī)模樣品、檢測(cè)方法繁瑣緩慢，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。但是由于基因芯片技術(shù)發(fā)展時(shí)間

14、較短，所以本身仍然存在很多的不足之處。 1. 當(dāng)前由于存在很多的基因制備方法，導(dǎo)致各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的基因芯片的性能無法比較，而且基因芯片缺乏穩(wěn)定性。 2. 雖然熒光基因標(biāo)記技術(shù)成熟，但是熒光染料非常昂貴，并不適合大規(guī)模和常規(guī)的使用。 3. 基因芯片技術(shù)不如PCR等技術(shù)靈敏度高，在少量致病菌感染的情況下可能會(huì)出現(xiàn)陰性結(jié)果。 4. 新發(fā)的各種腸道致病菌不斷的出現(xiàn)和變異。 4.2 基因芯片在腸道致病菌檢測(cè)方面存在的問題的解決的方法 1. 本實(shí)驗(yàn)室基因芯片小組在將可視化技術(shù)結(jié)合到基因芯片技術(shù)檢測(cè)中，取得了一定得成果。該技術(shù)能夠使得肉眼判斷芯片雜交結(jié)果，可降低實(shí)驗(yàn)成本，簡化操作流程。 2. 基

15、因芯片的靈敏度可通過改善核酸提取技術(shù)改善。研究高效的提取方法。 3. 針對(duì)腸道致病菌的不斷出現(xiàn)和變異可通過增加基因芯片檢測(cè)中靶細(xì)胞來改善。 綜上，可以知道雖然基因芯片檢測(cè)技術(shù)存在很多的問題，但是也取得一定得成果， 五、基因芯片在腸道致病菌檢測(cè)方面的前景 本文所論述的基因芯片技術(shù)應(yīng)用于腸道致病菌中的檢測(cè)，不僅提高了檢測(cè)的能力，而且實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)大規(guī)模樣品的檢測(cè)，成為一次具有革命意義的技術(shù)突破。當(dāng)前在國際上，基因芯片技術(shù)已經(jīng)得到廣大的科研工作者的認(rèn)同，成為了當(dāng)前分子診斷和遺傳分析重要的技術(shù)平臺(tái)。隨著檢測(cè)目的致病菌的種類不斷的增加、基因芯片技術(shù)檢測(cè)方法不斷創(chuàng)新，使得基因芯片檢測(cè)技術(shù)不斷

16、的成熟和完善。將來應(yīng)用于腸道致病菌的基因檢測(cè)技術(shù)將會(huì)得到大規(guī)模的應(yīng)用，呈現(xiàn)出更廣闊的應(yīng)用前景。 參考文獻(xiàn) [1] Ye R,Wang T,Bedkey L ,et al.Applications of DNA microanalysis in microbial systems .J Micro biol Methods,2001,47:257-272 [2] Chinovnik V,Parasol A,Chumash K,et al.Micro-array analysis of microbial virulence factors,App l Environ Micro-b

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