本科課件發(fā)酵工程,本科課件,發(fā)酵工程,本科,課件,發(fā)酵,工程 第三章發(fā)酵工藝條件的確定第一節(jié)培養(yǎng)基的選擇和確定第二節(jié)培養(yǎng)條件的確定第一節(jié)培養(yǎng)基的選擇和確定一、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分二、培養(yǎng)基的用途三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇四、培養(yǎng)基成分的營(yíng)養(yǎng)與作用五、培養(yǎng)基確定方法六、正交試驗(yàn)在培養(yǎng)基確定中的應(yīng)用一、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分微生物的營(yíng)養(yǎng)活動(dòng)，是依靠向外界分泌大量的酶將周圍環(huán)境中大分子的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，再借助細(xì)胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營(yíng)養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的。所有發(fā)酵培養(yǎng)基都必須提供微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成所需的能源，包括碳源、氮源、無機(jī)碳源、氮源、無機(jī)元素、生長(zhǎng)因子及水、氧氣元素、生長(zhǎng)因子及水、氧氣等。對(duì)于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，除考慮上述微生物的需要外，還必須重視培養(yǎng)基原料的價(jià)格和來源原料的價(jià)格和來源。微生物的營(yíng)養(yǎng)來源（1）能源自養(yǎng)菌：光；氫，硫胺；亞硝酸鹽，亞鐵鹽。異養(yǎng)菌：碳水化合物等有機(jī)物，石油天然氣和石油化工產(chǎn)品，如醋酸。（2）碳源：碳酸氣；淀粉水解糖，糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等石油、正構(gòu)石蠟，天然氣醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品（3）氮源豆餅或蠶蛹水解液，味精廢液，玉米漿，酒糟水等有機(jī)氮尿素，硫酸銨，氨水，硝酸鹽等無機(jī)氮?dú)鈶B(tài)氮(4)無機(jī)鹽磷酸鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等其他礦鹽鐵、錳、鈷等微量元素其他（5）特殊生長(zhǎng)因子硫胺素、生物素、對(duì)氨基苯甲酸、肌醇等二、培養(yǎng)基的用途篩選菌種保藏菌種檢驗(yàn)雜菌培養(yǎng)種子發(fā)酵生產(chǎn)（一）、培養(yǎng)基的分類（二）、發(fā)酵生產(chǎn)中的培養(yǎng)基類型（一）、培養(yǎng)基的分類（1）按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基。（2）按物理性質(zhì)固體，液體（3）按用途選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基等（1）天然培養(yǎng)基是采用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分還不恒定的各種植物和動(dòng)物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)(例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等)制成的。適合于各類異養(yǎng)微生物生長(zhǎng)，而一般自養(yǎng)微生物都不能生長(zhǎng)。（2）合成培養(yǎng)基是用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的。成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，可以減少不能控制的因素適用于在實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營(yíng)養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測(cè)定及選育菌種、遺傳分析等定量研究工作。但一般微生物在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，有些微生物營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜，在合成培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。（3）半合成培養(yǎng)基多數(shù)培養(yǎng)基配制是采用一部分天然有機(jī)物作碳源、氮源和生長(zhǎng)因子的來源，再適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品以補(bǔ)充無機(jī)鹽成分，使其更能充分滿足微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要。大多數(shù)微生物都能在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。因此，在微生物工業(yè)生產(chǎn)上和試驗(yàn)研究中被廣泛使用。（1）液體培養(yǎng)基：常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)及生理代謝等基本理論研究工作。發(fā)酵工業(yè)多用作培養(yǎng)種子和發(fā)酵的培養(yǎng)基。根據(jù)微生物對(duì)氧的要求情況，分別作靜止或通風(fēng)攪拌培養(yǎng)。在菌種篩選工作和菌種培養(yǎng)工作中，也常用液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)微生物在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的情況有時(shí)也可用作鑒定菌種的參考。生理代謝菌種篩選種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)（2）固體培養(yǎng)基分類：斜面試管、平板等是在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑配成的，最常用的凝固劑是瓊脂。作用：固體培養(yǎng)基在菌種的分離、保藏、菌落特征的觀察、活菌計(jì)數(shù)和鑒定菌種方面是不可缺少的。在制曲、酶制劑、檸檬酸等生產(chǎn)中，用來培養(yǎng)霉菌等的固體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基是由麩皮等農(nóng)作物加無機(jī)元素等制成的。增殖培養(yǎng)基：可以配制成適合某種微生物生長(zhǎng)而不適合其他微生物生長(zhǎng)，從而達(dá)到從自然界分離這種微生物的目的。鑒別培養(yǎng)基：是根據(jù)微生物能否利用培養(yǎng)基中某種營(yíng)養(yǎng)成分，借助指示劑的顯色反應(yīng)，以鑒別不同種類的微生物。選擇培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基內(nèi)加入某種化學(xué)物質(zhì)以抑制不需要菌的生長(zhǎng)，而促進(jìn)某種需要菌的生長(zhǎng)。（二）、發(fā)酵生產(chǎn)中的培養(yǎng)基類型工業(yè)發(fā)酵中培養(yǎng)基往往是依據(jù)生產(chǎn)流程和作用分為：斜面培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)基1斜面培養(yǎng)基作用：這是供微生物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖用的，包括細(xì)菌，酵母等的斜面培養(yǎng)基以及霉菌、放線菌生孢子培養(yǎng)基或麩曲培養(yǎng)基等。這類培養(yǎng)基主要作用是供給細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。特點(diǎn)：1.富含有機(jī)氮源，少含或不含糖分。有機(jī)氮有利于菌體的生長(zhǎng)繁殖，能獲得更多的細(xì)胞。2.對(duì)于放線菌或霉菌的產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，則氮源和碳源均不宜太豐富，否則容易長(zhǎng)菌絲而較少形成孢子。3.斜面培養(yǎng)基中宜加少量無機(jī)鹽類，供給必要的生長(zhǎng)因子和微量元素。2種子培養(yǎng)基(包括搖瓶種子和小罐種子培養(yǎng)基)：培養(yǎng)種子的目的：1.擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量；同時(shí)也必須培養(yǎng)出強(qiáng)壯、健康、活性高的細(xì)胞。為了使細(xì)胞迅速進(jìn)行分裂或菌絲快速生長(zhǎng)。種子培養(yǎng)基特點(diǎn)：1.必須有較完全和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別需要充足的氮源和生長(zhǎng)因子。2.種子培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高。供孢子發(fā)芽生長(zhǎng)用的種子培養(yǎng)基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源碳源和氮源。3.種子培養(yǎng)基成分還應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。3發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是發(fā)酵生產(chǎn)中最主要的培養(yǎng)基，它不僅耗用大量的原材料，而且也是決定發(fā)酵生產(chǎn)成功與否的重要因素。（1）根據(jù)產(chǎn)物合成的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)培養(yǎng)基：對(duì)菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物相偶聯(lián)的發(fā)酵類型，充分滿足細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基就能獲得最大的產(chǎn)物。對(duì)于生產(chǎn)氨基酸等含氮的化合物時(shí)，它的發(fā)酵培養(yǎng)基除供給充足的碳源物質(zhì)外，還應(yīng)該添加足夠的銨鹽或尿素等氮素化合物。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)盡可能高些，這樣在同等或相近的轉(zhuǎn)化率條件下有利于提高單位容積發(fā)酵罐的利用率，增加經(jīng)濟(jì)效益。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基需耗用大量原料，因此，原料來源、原材料的質(zhì)量以及價(jià)格等必須予以重視。三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇(1)必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基基本成分本成分。(2)有利于減減少少培培養(yǎng)養(yǎng)基基原原料料的的單單耗耗，即提高單位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率。(3)有利于提提高高培培養(yǎng)養(yǎng)基基和和產(chǎn)產(chǎn)物物的的濃濃度度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。(4)有利于提提高高產(chǎn)產(chǎn)物物的的合合成成速速度度，縮短發(fā)酵周期。(5)盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化。(6)原料價(jià)格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。7)所用原料盡可能減少對(duì)發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率，降低能耗。(8)有利于產(chǎn)品的分離純化，并盡可能減少產(chǎn)生“三廢”的物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和注意事項(xiàng)1提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分：培養(yǎng)基成分必須滿足細(xì)胞生長(zhǎng)，代謝活動(dòng)和合成產(chǎn)物所需的基本要求。2配制合適的濃度：可以從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)有關(guān)生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成和基質(zhì)利用物料平衡的關(guān)系中大致推算所需原料或大致計(jì)算出所需主要原料的需要量。3.主成分與其他成分的配比。4控制合適的pH：微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)物的合成往往需要定的pH環(huán)境，在最適pH值下有利于加快各種酶的反應(yīng)。因此在整個(gè)發(fā)酵過程中應(yīng)使培養(yǎng)基的pH適合于微生物生長(zhǎng)或產(chǎn)物合成所需。pH的具體控制方法的具體控制方法1.可以在微生物培養(yǎng)過程中加入酸或堿或流加某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，但更應(yīng)在配制培養(yǎng)基時(shí)考慮所用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成成分，使其pH值適合該微生物生長(zhǎng)或合成代謝產(chǎn)物的需要。2.還要注意有些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被利用后培養(yǎng)基的pH變化情況.3.控制pH最常用的方法是在培養(yǎng)基中添加具有一定緩沖能力的物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)物，如以磷酸鹽作為磷的成分；或者避免使用容易產(chǎn)生生理酸性或堿性使培養(yǎng)基pH波動(dòng)太大的物質(zhì)。4避免產(chǎn)生微生物不能利用的物質(zhì)或形成沉淀葡萄糖與銨鹽或氨基酸的氨基在滅菌高溫下作用形成深褐色物質(zhì)。這種物質(zhì)不被微生物利用。因此這兩類營(yíng)養(yǎng)物不宜直接配在一起進(jìn)行滅菌，而應(yīng)采用分開滅菌后再加入發(fā)酵罐內(nèi)。硫酸銨中的SO42-與鈣鹽易形成難溶的硫酸鈣，因此二者也不宜直接配成培養(yǎng)基。5注意代謝調(diào)節(jié)物的影響：有些物質(zhì)存在于培養(yǎng)基中往往能明顯地促進(jìn)或抑制發(fā)酵產(chǎn)物的形成。前體物質(zhì)誘導(dǎo)劑阻遏物抑制劑金屬離子(1)添加有關(guān)前體物質(zhì)：前作物質(zhì)：是指當(dāng)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化學(xué)物質(zhì)基本上不改變其分子結(jié)構(gòu)而直接進(jìn)入產(chǎn)物中的小分子物質(zhì)，從而在一定條件下控制產(chǎn)物的合成方向和提高產(chǎn)量。在發(fā)酵中添加前體物質(zhì)將有利于產(chǎn)物的合成和顯著提高產(chǎn)量，如苯乙酸及其衍生物被認(rèn)為是青霉素的前體物質(zhì)。(2)添加誘導(dǎo)物：目前工業(yè)用微生物酶多數(shù)為誘導(dǎo)酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。誘導(dǎo)物的存在能大大強(qiáng)化誘導(dǎo)酶的生物合成。酶的正常底物或底物的類似物都可作為誘導(dǎo)物。在各種微生物酶的發(fā)酵培養(yǎng)基中必須加入誘導(dǎo)物，例如淀粉、糊精或麥芽糖是淀粉酶或糖化酶的誘導(dǎo)物。只有添加這些物質(zhì)的培養(yǎng)基，才能獲得高產(chǎn)。(3)注意阻遏物或抑制劑的影響培養(yǎng)基中存在反饋?zhàn)瓒粑锘蚍纸庾瓒粑锞苡绊懨傅暮铣桑档桶l(fā)酵產(chǎn)量。有些酶的抑制劑卻能提高某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，最早利用抑制劑提高中間代謝物產(chǎn)量的例子是甘油發(fā)酵中加入亞硫酸鈉。在培養(yǎng)基配制時(shí)必須注意加入有益的抑制劑，而避免混入有害的抑制物。6.金屬離子的影響：有些種類的發(fā)酵生產(chǎn)對(duì)金屬離子相當(dāng)敏感，因?yàn)橛行┙饘匐x子是中間代謝酶的抑制劑或激活劑。因此對(duì)于有重大影響的金屬離子必須嚴(yán)格控制。如檸檬酸發(fā)酵中鐵、錳和鋅離子都能明顯影響產(chǎn)量，鈣離子對(duì)細(xì)菌淀粉酶的生產(chǎn)有促進(jìn)作用，而鈷離子對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的發(fā)酵是必需的，這些在培養(yǎng)基配制時(shí)都必須予以注意。四、培養(yǎng)基組成物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)與四、培養(yǎng)基組成物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)與作用作用碳素化合物氮素化合物 水 微量元素(無機(jī)鹽類)生長(zhǎng)因子 碳素化合物營(yíng)養(yǎng)源對(duì)微生物生長(zhǎng)發(fā)育的影響(1)碳素化合物的作用構(gòu)成菌體成分的重要元素，產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)的主要原料，同時(shí)又是化能異養(yǎng)型微生物的能量來源。（2）碳源種類糖：?jiǎn)翁侵械募禾牵烟侵械恼崽?、麥芽糖、棉子糖，多糖中的淀粉、纖維素、半纖維素、甲殼質(zhì)和果膠質(zhì)等，其中淀粉是大多數(shù)微生物都能利用的碳源。有機(jī)酸如糖酸、檸檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸、丙酮酸、酒石酸等。醇類中甘露醇、甘油、低濃度的乙醇。脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低級(jí)脂肪酸都可用作碳源。油酸和亞油酸等高級(jí)脂肪酸可被不少放線菌和真菌作為碳源和能源利用，低濃度的高級(jí)脂肪酸可刺激細(xì)菌生長(zhǎng)，但濃度較高時(shí)往往有毒害作用。正烷烴：一般是指從石油裂得到的14C至18C的直鏈烷烴混合物。葡萄糖：是最易利用的糖，并且作為加速微生物生長(zhǎng)的一種有效的糖。過多的葡萄糖會(huì)過分加速菌體的呼吸，以致培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要。糖蜜：是制糖廠生產(chǎn)糖時(shí)的結(jié)晶母液，是蔗糖廠的副產(chǎn)物。含有較豐富的糖、氨素化合物和無機(jī)維生素等，是微生物工業(yè)的價(jià)廉物美的原料。淀粉：一般要經(jīng)菌體產(chǎn)生的胞外酶水解成單糖后再被吸收利用?？煽朔咸汛x過快的弊病。來源豐富，價(jià)格比較低廉。常用的為玉米淀粉、小麥淀粉和甘薯淀。油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用下水解為甘油和脂肪酸，在溶解氧的參與下，氧化成水和CO2。因此用脂肪作碳源時(shí)需比糖代謝供給更多的氧。(2)氮素化合物氮是構(gòu)成微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，而蛋白質(zhì)和核酸是微生物原生質(zhì)的主要組成部分。氮素一般不提供能量，但硝化細(xì)菌卻能利用氨作為氮源和能源。就某一類微生物而言，由于其合成能力的差異，對(duì)氮營(yíng)養(yǎng)的需要也有很大區(qū)別。氮的來源可分為無機(jī)氮和有機(jī)氮：有機(jī)氮源：花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟等。它們?cè)谖⑸锓置诘牡鞍酌缸饔孟?，水解成氨基酸，被菌體進(jìn)一步分解代謝。有機(jī)氮源特點(diǎn)：含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離的氨基酸還含有少量的糖類、脂肪、無機(jī)鹽、維生素及生長(zhǎng)因子。玉米漿：是玉米淀粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，其中固體物含量在50。還含有有機(jī)酸、還原糖、磷、微量元素、生長(zhǎng)素。由于玉米漿的來源不同，加工條件也不同，因此玉米漿的成分有較大波動(dòng)。無機(jī)氮源：銨鹽、硝酸鹽、氨水等。微生物對(duì)其吸收利用比有機(jī)物快，所以也稱速效氮。利用無機(jī)氮時(shí)應(yīng)注意引起的pH變化。實(shí)驗(yàn)室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等作為有機(jī)氮源，工業(yè)生產(chǎn)上常用硫酸銨、尿素、氨水、豆餅粉、花生餅粉、麩皮等原料作氮源。(3)水（1）水是良好的溶劑，菌體所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都是溶解于水中被吸收的。（2）滲透、分泌、排泄等作用都是以水為媒介的；（3）水直接參與代謝作用中的許多反應(yīng)。所以，水在生物化學(xué)反應(yīng)中占有極為重要的地位。（4）水的比熱高，能有效地吸收代謝過程中所放出的熱，使細(xì)胞內(nèi)溫度不致驟然上升。（5）水是熱的良導(dǎo)體，有利于放熱，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的溫度。(4)微量元素(無機(jī)鹽類)無機(jī)鹽類是微生物生命活動(dòng)所不可缺少的物質(zhì)。主要功用是：構(gòu)成菌體成分；作為酶活性基的組成部分或維持酶的活性；調(diào)節(jié)滲透壓、pH值、氧化還原電位等；作為自養(yǎng)菌的能源。無機(jī)元素包括主要元素(又稱大量元素)和微量元素兩類，這是依據(jù)微生物對(duì)它們需要量的大小劃分的。主要元素有P、S、Mg、K、Ca等；微量元素有Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Co、B等。當(dāng)鹽濃度太高時(shí)，對(duì)微生物生長(zhǎng)有抑制作用，而在較低濃度時(shí)卻能刺激生長(zhǎng)。一般在復(fù)合培養(yǎng)基中由于加入許多動(dòng)植物原料等都含有微量元素。磷：是核酸和蛋白質(zhì)的必要成分，也是ATP的成分。在代謝途徑調(diào)節(jié)方面，起著重要作用。促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，但過量時(shí)，許多產(chǎn)物的合成受抑制。鈣：培養(yǎng)基中鈣鹽過多時(shí)，會(huì)形成磷酸鈣沉淀。可分別消毒或逐步補(bǔ)加。鎂：處于離子狀態(tài)時(shí)，是許多酶的輔酶的激活劑，不但影響基質(zhì)的氧化，也影響蛋白質(zhì)的合成。以硫酸鎂加入，但在堿性溶液中會(huì)形成沉淀。(5)生長(zhǎng)因子廣義說，凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)都稱為生長(zhǎng)因子(又稱生長(zhǎng)素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等；狹義說，生長(zhǎng)素僅指維生素。與微生物有關(guān)的維生素主要是B族維生素，這些維生素是各種酶的活性基的組成部分，沒有它們，酶就不能活動(dòng)。凡是缺少合成生長(zhǎng)素類物質(zhì)的微生物(即缺少了合成生長(zhǎng)素過程中的某種酶)，統(tǒng)稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。五、培養(yǎng)基確定方法（1）首先必須做好調(diào)查研究工作，了解菌種的來源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營(yíng)養(yǎng)要求。工業(yè)生產(chǎn)主要應(yīng)用細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類微生物。它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求既有共性，也有各自的特性，應(yīng)根據(jù)不同類型微生物的生理特性考慮培養(yǎng)基的組成。（2）其次，對(duì)生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等也需要有所了解，以便在選擇培養(yǎng)基時(shí)做到心中有數(shù)。（3）最好先選擇一種較好的化學(xué)合成培養(yǎng)基做基礎(chǔ)，開始時(shí)先做一些搖瓶試驗(yàn);然后進(jìn)一步做小型發(fā)酵罐培養(yǎng)，摸索菌種對(duì)各種主要有機(jī)碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力。注意培養(yǎng)過程中的pH變化，觀察適合于菌種生長(zhǎng)繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的兩種不同pH，不斷調(diào)整配比來適應(yīng)上述各種情況。（4）注意每次只限一個(gè)變動(dòng)條件。有了初步結(jié)果以后，先確定一個(gè)培養(yǎng)基配比。其次再確定各種重要的金屬和非金屬離子對(duì)發(fā)酵的影響，即對(duì)各種無機(jī)元素的營(yíng)養(yǎng)要求，試驗(yàn)其最高、最低和最適用量。在合成培養(yǎng)基上得出一定結(jié)果后，再做復(fù)合培養(yǎng)基試驗(yàn)。最后試驗(yàn)各種發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的關(guān)系。培養(yǎng)基內(nèi)pH可由添加碳酸鈣來調(diào)節(jié)，其他如硝酸鈉、硫酸銨也可用來調(diào)節(jié)。（5）有些發(fā)酵產(chǎn)物，如抗生素等，除了配制培養(yǎng)基以外，還要通過中間補(bǔ)料法，一面對(duì)碳及氮的代謝予以適當(dāng)?shù)目刂?，一面間歇添加各種養(yǎng)料和前體類物質(zhì)，引導(dǎo)發(fā)酵走向合成產(chǎn)物的途徑。（6）根據(jù)生產(chǎn)和科學(xué)研究的需要選擇培養(yǎng)基工業(yè)上，液體深層培養(yǎng)具有占地面積小、發(fā)酵效率高、操作方便、易于機(jī)械化相自動(dòng)化生產(chǎn)、降低勞動(dòng)強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)。所以，發(fā)酵工業(yè)中大多采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)種子和進(jìn)行液體發(fā)酵，并根據(jù)微生物對(duì)氧氣的要求，分別作表面靜止培養(yǎng)或深層通氣培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室或制種車間進(jìn)行固體培養(yǎng)常采用試管、扁瓶和培養(yǎng)皿。工業(yè)生產(chǎn)中也常采用固體原料，如小米、大米、鐵皮、馬鈴署等直接制作斜面，或在茄子瓶表面培養(yǎng)霉菌、放線菌。具有設(shè)備簡(jiǎn)單、投資少、易推廣等優(yōu)點(diǎn)。大規(guī)模生產(chǎn)中，固體培養(yǎng)的缺點(diǎn)是占地面積多，勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)穩(wěn)定性差。(7)根據(jù)經(jīng)濟(jì)效益選擇培并基原料考慮經(jīng)濟(jì)節(jié)約，盡量少用或不用主糧，努力節(jié)約用糧，或以其他原料代糧。糖類是主要的碳源。碳源的代用方向主要是尋找植物淀粉、纖維水解物，以廢糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工業(yè)葡萄糖代替食用葡萄糖。同時(shí)，使用稀薄的培養(yǎng)基，適當(dāng)減少碳氮配比石油作為碳源的微生物發(fā)酵不但可以生產(chǎn)以糧食為碳源的發(fā)酵產(chǎn)品。有機(jī)氮源的節(jié)約和代替主要為減少或代替黃豆餅粉、花生餅粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有豐富蛋白質(zhì)的原料。代用的原料可以是棉籽餅粉、玉米漿、蠶蛹粉、雜魚粉、黃漿水或麩汁、飼料酵母、石油酵母、骨膠、菌體、酒糟，以及各種食品工業(yè)下腳料等。這些代用品大多蛋白質(zhì)含量豐富，貸源充足，價(jià)格低廉，便于就地取材，方便運(yùn)輸。正交試驗(yàn)在培養(yǎng)基確定中的應(yīng)用因素水平玉米粉（）A豆餅粉（）B蛋白胨（）CPHD10.540.55.021.050.65.531.560.76.0正交表因素水平因素水平玉米粉（）A豆餅粉（）B蛋白胨（）CPHD10.540.55.021.050.65.531.560.76.0第二節(jié) 培養(yǎng)工藝的確定方法一、培養(yǎng)條件二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)溫度pH值氧氧種齡種齡接種量接種量一、培養(yǎng)條件1溫度通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10，生長(zhǎng)速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來說，溫度直接影響其生長(zhǎng)和合成酶。機(jī)體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸等都對(duì)溫度較敏感，隨著溫度的增高有可能遭受不可逆的破壞。微生物可生長(zhǎng)的溫度范圍較廣，總體說在-1095。溫度任何微生物的牛長(zhǎng)都需要有最適的生長(zhǎng)溫度，在此溫度范圍內(nèi)微生物生長(zhǎng)繁殖最快。如果所培養(yǎng)的微生物能承受稍高一些的溫度進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，這對(duì)生產(chǎn)有很大的好處，即可減少污染雜菌的機(jī)會(huì)和夏季培養(yǎng)所需降溫的輔助設(shè)備，因此培養(yǎng)耐高溫的菌種有一定的生產(chǎn)現(xiàn)實(shí)意義。2pH值培養(yǎng)基中的pH值與微生物生命活動(dòng)有著密切關(guān)系，各種微生物有其可以生長(zhǎng)的和最適生長(zhǎng)的pH范圍。微生物通過其活動(dòng)也能改變環(huán)境的pH值。發(fā)酵過程中，控制發(fā)酵液的pH值是控制生產(chǎn)的指標(biāo)之一，pH值過高、過低都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖以及代謝產(chǎn)物的積累。控制pH值不但可以保證微生物良好的生長(zhǎng)，而且可以防止雜菌的污染。培養(yǎng)基pH在發(fā)酵過程中能被菌體代謝所改變。若陰離子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后產(chǎn)生NH3，則pH上升；陽(yáng)離子(如NH4、K+)被吸收或有機(jī)酸的積累，使pH下降。一般來說，高碳源培養(yǎng)基傾向于向酸性pH轉(zhuǎn)移，高氮源培養(yǎng)基傾向于向堿性pH轉(zhuǎn)移，這都跟碳氮比直接有關(guān)。3氧微生物對(duì)氧的需要不同，是由于依賴獲得能量的代謝方面的差異。好氣性菌主要是有氧呼吸或氧化代謝，厭氣菌為厭氣發(fā)酵(分子間呼吸)，兼性厭氣菌則兩者兼而有之。不同微生物或同一微生物的不同生長(zhǎng)階段對(duì)通風(fēng)量的要求也不相同。通風(fēng)和攪拌通氣可以供給大量的氧。通氣量與菌種、培養(yǎng)基性質(zhì)、培養(yǎng)階段有關(guān)。通氣量的多少，最好按氧溶解的多少來決定。只有氧溶解的速度大于菌體的吸氧量時(shí)，菌體才能正常地生長(zhǎng)和合成酶。因此隨著菌體繁殖，呼吸增強(qiáng)，必須按菌體的吸氧量加大通氣量，以增加溶解氧的量。攪拌則能使新鮮氧氣更好地與培養(yǎng)液混合，保證氧的最大限度溶解，并且攪拌有利于熱交換，使培養(yǎng)液的溫度一致，還有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的分散。此外，擋板則有助于攪拌，使其效果更好。一般來說，若培養(yǎng)罐深，攪拌轉(zhuǎn)速大，通氣管開孔小或多，氣泡在培養(yǎng)液內(nèi)停留時(shí)間就長(zhǎng)，氧的溶解速度就大，而且在這些因素確定下，培養(yǎng)基的粘度越小，氧的溶解速度也越大。攪拌可以提高通氣效果，但是過度地劇烈攪拌會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液大量涌泡，容易增加雜菌污染的機(jī)會(huì)，液膜表層的酶容易氧化變性，微生物細(xì)胞也不宜劇烈攪拌。種齡與接種量種子培養(yǎng)期應(yīng)取菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為宜，菌種過嫩或過老，不但延長(zhǎng)發(fā)酵周期，而且會(huì)降低產(chǎn)量。接種量的大小直接影響發(fā)酵周期。大量地接入培養(yǎng)成熟的菌種的優(yōu)點(diǎn)：1.可以縮短生長(zhǎng)過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率，2.節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動(dòng)力消耗，3.并有利于減少染菌機(jī)會(huì)，一般都將菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行兩級(jí)發(fā)酵或三級(jí)發(fā)酵。接種量和培養(yǎng)物的生長(zhǎng)過程的延緩期長(zhǎng)短呈反比。接種量過多也無必要。因培養(yǎng)種子費(fèi)時(shí)，而且過多地移人代謝廢物，反而會(huì)影響正常發(fā)酵。二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)工業(yè)微生物菌種培養(yǎng)的類型工業(yè)微生物的培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩大類型。靜置培養(yǎng)法即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行發(fā)酵，又稱為嫌氣性發(fā)酵。通氣培養(yǎng)法的生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長(zhǎng)的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長(zhǎng)和發(fā)酵，又稱為好氣性發(fā)酵。在靜置和通氣培養(yǎng)兩類方法中又可分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩大類型，其中每一類型又有表面培養(yǎng)與深層培養(yǎng)之分。(三）主要培養(yǎng)方法及特點(diǎn)1種子擴(kuò)大培養(yǎng)階段(1)液體培養(yǎng)法包括液體試管、三角瓶搖床振蕩或回旋式培養(yǎng)。搖瓶通氣量大小與搖瓶機(jī)型式、轉(zhuǎn)數(shù)、振程(或偏心距)、三角瓶容量、裝料量有關(guān)。(2)表面培養(yǎng)法包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培養(yǎng)。(3)固體培養(yǎng)法包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培養(yǎng)皿等麩皮培養(yǎng)。2大規(guī)模生產(chǎn)階段(1)表面培養(yǎng)(2)固體培養(yǎng)(3)液體深層培養(yǎng)(4)載體培養(yǎng)(1)表面培養(yǎng)表面培養(yǎng)是一種好氧靜置培養(yǎng)方法針對(duì)容器內(nèi)培養(yǎng)基物態(tài)又分為液態(tài)表面培養(yǎng)和固態(tài)表面培養(yǎng)。相對(duì)于容器內(nèi)培養(yǎng)基體積而言，表面積越大，越易促進(jìn)氧氣由氣液(氣固界面向培養(yǎng)基內(nèi)傳遞，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方法菌的生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)基深度有關(guān)，單位體積的表面積越大，生長(zhǎng)速度也越快。氧的供給常成為發(fā)酵的限速因素，所以發(fā)酵周期長(zhǎng)，占地面積大。優(yōu)點(diǎn)是不需要深層培養(yǎng)時(shí)的攪拌和通氣，節(jié)省動(dòng)力。如醋酸、檸檬酸發(fā)酵和曲盤制曲。固體培養(yǎng)又分為淺盤固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)，統(tǒng)稱曲法培養(yǎng)。它起源于我國(guó)釀造生產(chǎn)特有的傳統(tǒng)制曲技術(shù)。其最大特點(diǎn)是固體曲的酶活力高。(2)固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：原料：以谷物和農(nóng)業(yè)廢物為主要原料，只需外加適量水分、無機(jī)鹽等。培養(yǎng)基組成簡(jiǎn)單。防止污染：利用霉菌能在水分較低的基質(zhì)表面進(jìn)行增殖的特性，在這種條件下，細(xì)菌生長(zhǎng)不好，因此不易引起細(xì)菌污染。通氣：無論淺盤或深層固體通風(fēng)制曲，可以在曲房周圍使用循環(huán)的冷卻增濕的無菌空氣來控制溫濕度，并且能根據(jù)菌種在不同生理時(shí)期的需要，靈活加以調(diào)節(jié)。在固體培養(yǎng)中，氧氣是由基質(zhì)粒子間空隙的空氣直接供給微生物，比液體培養(yǎng)時(shí)的用通氣攪拌供給氧氣節(jié)能。(3)液體深層培養(yǎng)用液體深層發(fā)酵罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對(duì)于由氣液界面靠自然擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來講，稱為深層培養(yǎng)法。特點(diǎn)是容易按照生產(chǎn)菌種對(duì)于代謝的營(yíng)養(yǎng)要求以及不同生理時(shí)期的通氣、攪拌、溫度、與培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。深層培養(yǎng)基本操作的3個(gè)控制點(diǎn)滅菌：發(fā)酵工業(yè)要求純培養(yǎng)，因此在發(fā)酵開始前必須對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行加熱滅菌。所以發(fā)酵罐具有蒸汽夾套，以便將培養(yǎng)基和發(fā)酵罐進(jìn)行加熱滅菌，或者將培養(yǎng)基由連續(xù)加熱滅菌器滅菌，并連續(xù)地輸送于發(fā)酵罐內(nèi)。溫度控制：培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至培養(yǎng)溫度進(jìn)行發(fā)酵，由于隨著微生物的增殖和發(fā)酵會(huì)發(fā)熱、攪拌產(chǎn)熱等，所以為維持溫度恒定，須在夾套中以冷卻水循環(huán)流過。通氣、攪拌：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐前先經(jīng)空氣過濾器除去雜菌，制成無菌空氣，而后由罐底部進(jìn)人，再通過攪拌將空氣分散成微小氣泡。為了延長(zhǎng)氣泡滯留時(shí)間，可在罐內(nèi)裝擋板產(chǎn)生渦流。攪拌的目的除了溶解氧之外，可使培養(yǎng)液中微生物均勻地分散在發(fā)酵罐內(nèi)，促進(jìn)熱傳遞，以及為調(diào)節(jié)pH而使加入的酸和堿均勻分散等。幾種深層培養(yǎng)法放大法兩步法控制培養(yǎng)法 分批發(fā)酵法(間歇發(fā)酵法)連續(xù)培養(yǎng)法補(bǔ)料分批培養(yǎng)法(流加法)放大法：將微生物在搖瓶基礎(chǔ)上逐級(jí)放大以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。在厭氣發(fā)酵時(shí)問題歸結(jié)為如何從大型發(fā)酵罐中除去發(fā)酵熱。為此考慮到如何利用發(fā)酵時(shí)生成的二氧化碳引起的液體流動(dòng)和輔助攪拌，以提高冷卻效率，這只需進(jìn)行發(fā)酵罐傳熱面積的設(shè)計(jì)即可。但在好氧培養(yǎng)中，大多以氧的供給為基準(zhǔn)進(jìn)行放大。一般從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到工廠生產(chǎn)要經(jīng)過35級(jí)放大步驟。放大過程中應(yīng)考慮：a氧傳遞速度相等。b比較攪拌槳葉頂端速度。c比較單位液量所需的攪拌動(dòng)力。d混合時(shí)間相同。e雷諾準(zhǔn)數(shù)相同。f通過反饋控制盡量能使重要環(huán)境因子一致。兩步法兩步法：酶制劑生產(chǎn)兩步法的特點(diǎn)是將菌體生長(zhǎng)條件(營(yíng)養(yǎng)期)與產(chǎn)酶條件(自我繁殖期)區(qū)分開來。菌種先在豐富的培養(yǎng)基上大量繁殖，然后收集菌體濃縮物，洗滌后再轉(zhuǎn)入添加誘導(dǎo)物的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在此期間，菌體積累大量的酶，一般不再繁殖，營(yíng)養(yǎng)成分或誘導(dǎo)物得到充分利用。在氨基酸的兩步法液體深層培養(yǎng)中，每一步菌種和培養(yǎng)基等均不相同。第一步屬有機(jī)酸發(fā)酵或氨基酸發(fā)酵。第二步是在微生物產(chǎn)生的某種酶作用下把第一步的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為所需的氨基酸，這種生產(chǎn)方法又稱為酶轉(zhuǎn)化法。控制培養(yǎng)法了解發(fā)酵罐內(nèi)部的變化情況，掌握短暫時(shí)間內(nèi)狀態(tài)變量的變化以及可能測(cè)定的環(huán)境因子對(duì)微生物代謝活動(dòng)的影響，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行控制培養(yǎng)，以達(dá)到產(chǎn)物生成的最優(yōu)培養(yǎng)條件。用測(cè)定狀態(tài)變量的傳感器取得數(shù)據(jù)，經(jīng)電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行綜合分析，再將其結(jié)果作為反饋調(diào)節(jié)的信號(hào)，將環(huán)境(培養(yǎng)條件)控制于給定的基準(zhǔn)內(nèi)。這就叫做電子計(jì)算機(jī)控制發(fā)酵。目前已大量用于露天大罐啤酒發(fā)酵。分批發(fā)酵法(間歇發(fā)酵法)先將空罐殺菌，培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，接種之后進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基成分減少，微生物增殖。微生物周圍的環(huán)境隨時(shí)間而變化，是一種非穩(wěn)態(tài)操作法。此法不易染菌，但很難采用控制基質(zhì)等濃度的方法來增大發(fā)酵生產(chǎn)能力。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生產(chǎn)中。連續(xù)培養(yǎng)法在往發(fā)酵罐中連續(xù)供給新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，將含有微生物和產(chǎn)物的培養(yǎng)液，從發(fā)酵罐中連續(xù)放出，叫做連續(xù)培養(yǎng)法。其特點(diǎn)是能使微生物處于恒定不變的環(huán)境中進(jìn)行長(zhǎng)期持續(xù)的培養(yǎng)，該系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)被叫做恒化器。同時(shí)包含了流入和流出，屬開放系統(tǒng)，故變異菌株和雜菌污染隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。從技術(shù)上也很難保證流入和流出速度的一致。連續(xù)培養(yǎng)用于廢水處理、葡萄糖酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵等工業(yè)中。補(bǔ)料分批培養(yǎng)法(流加法)在分批培養(yǎng)時(shí)，不斷地供給培養(yǎng)基，但所需產(chǎn)物不到一定時(shí)刻不放出的方法，稱為補(bǔ)料分批培養(yǎng)法。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工業(yè)。(4)載體培養(yǎng)載體培養(yǎng)脫胎于曲法培養(yǎng)，同時(shí)又吸收了液體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是近年來新發(fā)展的一種培養(yǎng)方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麩皮之類的固態(tài)基質(zhì)作為微生物的載體，營(yíng)養(yǎng)成分可以嚴(yán)格控制，發(fā)酵結(jié)束，只需將菌體和培養(yǎng)液擠壓出來進(jìn)行抽提，載體又可以重新使用。載體的取材必須耐蒸汽加熱或藥物滅菌，多孔結(jié)構(gòu)既有足夠的表面積，又能允許空氣流通。3影響種子培養(yǎng)的條件菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的關(guān)鍵就是搞好種子罐的擴(kuò)大培養(yǎng)。影響種子罐培養(yǎng)的主要因素包括營(yíng)養(yǎng)條件、培養(yǎng)條件、染菌的控制、種子的級(jí)數(shù)和接種量控制等。泡沫（1）泡沫的作用：培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的泡沫與微生物的生長(zhǎng)和合成酶有關(guān)，泡沫的持久存在影響著微生物對(duì)氧的吸收；妨礙二氧化碳的排除，因而破壞其生理代謝的正常進(jìn)行，不利于發(fā)酵；由于泡沫大量生成，致使培養(yǎng)液的容量一般只能等于種子罐容量的一半左右，大大影響了設(shè)備的利用率，甚至發(fā)生跑料，招致染菌，造成巨大損失。（2）產(chǎn)生泡沫的原因通氣和機(jī)械攪拌使液體分散和空氣竄入，形成氣泡；培養(yǎng)基中某些成分的變化或微生物的代謝活動(dòng)產(chǎn)生氣泡；培養(yǎng)基中某些成分(如蛋白質(zhì)及其他膠體物質(zhì))的分子，在氣泡表面排列形成堅(jiān)固的薄膜。因此，氣泡不易破裂，聚成泡沫層。（3）培養(yǎng)過程的消泡措施機(jī)械法化學(xué)法。發(fā)酵工業(yè)常用的消泡劑，有各種天然的動(dòng)植物油及來自石油化工生產(chǎn)的礦物油、改性油、表面活性劑等。而新型的有機(jī)硅聚合物如硅油、硅樹脂等，則具有效率高、用量省、無毒性、無代謝性，同時(shí)兼有提高微生物合成酶等多種優(yōu)良特性，是一類有發(fā)展前途的消泡劑。泡沫的控制除了添加消泡劑外，改進(jìn)培養(yǎng)基成分也是相輔相成的一個(gè)重要方面。染菌的控制（1）染菌的原因歸結(jié)起來是：設(shè)備、管道、閥門漏損、滅菌不徹底；空氣凈化不好；無菌操作不嚴(yán)或菌種不純等。（2）染菌的控制必須加強(qiáng)接種室的消毒管理工作，定期檢查消毒效果，嚴(yán)格無菌操作技術(shù)。如果新菌種不純，則需反復(fù)分離，直至完全純粹為止。對(duì)于已出現(xiàn)雜菌菌落或噬菌斑的試管斜面菌種，應(yīng)予廢棄。在平時(shí)應(yīng)經(jīng)常分離試管菌種，以防菌種衰退、變異和污染雜菌。對(duì)于菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝條件要嚴(yán)格控制，對(duì)種子質(zhì)量更要嚴(yán)格掌握，必要時(shí)可將種子罐冷卻，取樣做純種試驗(yàn)，確證種子無雜菌存在，才能向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種。種子罐級(jí)數(shù)的確定種子罐的級(jí)數(shù)愈少，愈有利于簡(jiǎn)化工藝及控制并可減少種子罐污染雜菌的機(jī)會(huì)減少消毒及值班工作量減少因種子罐生長(zhǎng)異常而造成的發(fā)酵波動(dòng)。確定方法菌種的性質(zhì)(如菌種傳代后的穩(wěn)定性)孢子瓶中的孢子數(shù)，孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量種子罐與發(fā)酵罐的容積比。隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定隨著工藝條件的改變作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。第三節(jié)厭氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)在發(fā)酵工業(yè)研究上是很重要的，發(fā)酵工業(yè)中的制酒等混合發(fā)酵過程有大量厭氧微生物的有益作用，特別是對(duì)己酸菌、丁酸菌、甲烷菌等的研究。細(xì)菌在有氧環(huán)境中進(jìn)行代謝時(shí)，常產(chǎn)生超氧離子(O-)與過氧化氫(H202)，有強(qiáng)烈的殺菌作用。厭氧菌過氧化氫酶)和過氧化物酶，不能破壞超氧離子和H202，易被殺傷，-故在有氧時(shí)不能生長(zhǎng)。厭氧培養(yǎng)的方法(1)深層穿刺分離培養(yǎng)：用一根18-20mm直徑的玻璃管，截成180-200mm長(zhǎng)，洗凈烘干。一頭塞入橡皮塞，加入2/3管長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，塞上膠塞或塑料帽，滅菌，涼至凝固。穿刺接|種或待分離物。培養(yǎng)后可見到生長(zhǎng)的厭氧微生物菌落。此時(shí)拔出橡皮塞，用無菌刀切割，分離再培養(yǎng)。此法對(duì)于一般厭氧微生物適用。(2)深層穿刺與化學(xué)吸氧相結(jié)合：深層穿刺后，在培養(yǎng)基上部加一層非脫脂棉，再加一層脫脂棉，上面加入焦性沒食子酸和Na2O3粉末的混合物，用膠塞或塑料帽蓋緊。焦性沒食子酸和Na2O3在有濕氣(即水分)存在的條件下緩慢作用吸氧和放出CO2，造成厭氧狀態(tài)，強(qiáng)化了厭氧條件。(3)液體培養(yǎng)基法：液體培養(yǎng)基法主要是在培養(yǎng)基中加入一定的還原物質(zhì)并隔絕空氣。常見的有庖肉培養(yǎng)基法、硫乙醇酸鈉法、牛心腦浸液培養(yǎng)基法等。(4)厭氧罐培養(yǎng)法：堿性焦性沒食子酸法：焦性沒食子酸與Na2O3反應(yīng)可釋放出O2并吸收環(huán)境中的氧。厭氧箱培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱由厭氧環(huán)境操作箱、恒溫培養(yǎng)箱、高度真空傳遞箱、氣路控制系統(tǒng)、箱架、瓶架等部分組成。培養(yǎng)箱的溫度能自行調(diào)節(jié)控制，氣路安排合理，能任意輸入所需氣體和準(zhǔn)確調(diào)節(jié)流量。箱內(nèi)備有紫外燈，可消毒操作室內(nèi)空氣。使用厭氧培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧微生物分離培養(yǎng)時(shí)，整個(gè)操作過程可在正壓O2或氮?dú)庀逻M(jìn)行，使整個(gè)接種過程在無氧狀態(tài)。因此，厭氧培養(yǎng)箱在分離，研究極端專性厭氧菌時(shí)更有其優(yōu)勢(shì)。