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1、課后限時集訓40 基因工程 1．科學工作者將某種海蜇的DNA分子上一段長度為5 170個堿基對的片段——綠色熒光蛋白基因，轉入到夾竹桃細胞中，培育出一種夜間發(fā)光的夾竹桃。培育過程如圖所示，回答有關問題。 (1)構建圖中的重組Ti質粒，還需用到的基因工程基本工具是____________________。作為受體農桿菌應________________，以方便篩選已導入重組Ti質粒的受體農桿菌。在將重組Ti質粒轉入農桿菌之前，先要用Ca2＋處理農桿菌，其目的是使其成為__________________細胞。 (2)圖中將綠色熒光蛋白基因導入夾竹桃細胞的方法稱為__________

2、____。轉基因夾竹桃幼苗對青霉素__________(填“具有”或“不具有”)抗性，原因是______________________________________。 (3)綠色熒光蛋白基因含有____________，因此在農桿菌細胞中不能正常表達，而在夾竹桃細胞中能正常表達。 [解析]　(1)構建圖中的重組Ti質粒，還需用到的基因工程基本工具是限制性核酸內切酶(或限制酶)、DNA連接酶。由于Ti質粒上含有抗青霉素基因，故作為受體農桿菌應不含抗青霉素基因(或對青霉素敏感)，以便根據(jù)質粒上的標記基因篩選導入重組質粒的農桿菌。在將重組Ti質粒轉入農桿菌之前，先要用Ca2＋處理農桿菌，其目

3、的是使其成為感受態(tài)細胞，易于吸收周圍環(huán)境中的外源DNA分子。 (2)圖示中將綠色熒光蛋白基因導入夾竹桃細胞的方法稱為農桿菌轉化法。根據(jù)圖示可知目的基因插入在了質粒上的T-DNA片段，由于T-DNA可轉移至受體細胞并且整合到受體細胞的染色體DNA上，所以插入在T-DNA中的目的基因被導入夾竹桃細胞并整合到了染色體DNA上，而抗青霉素基因沒有進入夾竹桃細胞，故轉基因夾竹桃幼苗對青霉素不具有抗性。 (3)綠色熒光蛋白基因來自真核生物，含有內含子，轉錄后需要將內含子轉錄的部分在細胞核進行剪切，而農桿菌為原核生物，不具備該剪切功能，因此在農桿菌細胞中不能正常表達，而在夾竹桃細胞中能正常表達。 [答

4、案]　(1)限制性核酸內切酶(或限制酶)、DNA連接酶　不含有抗青霉素基因(或對青霉素敏感)　感受態(tài)　(2)農桿菌轉化法　不具有　農桿菌(或重組Ti質粒)中只有T-DNA才能進入夾竹桃細胞，而抗青霉素基因沒有進入夾竹桃細胞　(3)內含子 2．幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內，可增強其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}： (1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是__________________。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是________

5、_________。 (2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是_______________________。 (3)若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是__________________________________(答出兩點即可)。 (4)當幾丁質酶基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是____________________________________________________。 (5)若獲得的轉基因植株(幾丁質酶基因已經整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的

6、原因是______________。 (6)目前關于轉基因生物安全性的爭論主要集中在________安全、________安全和________安全三個方面，而這三個方面的爭論發(fā)生的原因主要還是因為轉基因生物的特性及其對現(xiàn)存生物和自然環(huán)境的影響具有很大的不確定性。例如，由于________________________________________，因此在轉基因生物中，有時候會出現(xiàn)一些人們意想不到的后果。 [解析]　(1)與老葉相比，嫩葉組織細胞易破碎，容易提取到幾丁質酶的mRNA。提取RNA時，提取液中添加RNA酶抑制劑可防止RNA被RNA酶催化降解。 (2)以mRNA為模板，按照

7、堿基互補配對原則，在逆轉錄酶的作用下，通過逆轉錄(反轉錄)可以獲得cDNA。 (3)因該目的基因是通過逆轉錄形成的，無表達所需的啟動子，也無在受體細胞內進行復制所需的復制原點等，所以在受體細胞內不能穩(wěn)定存在和表達，也不能遺傳下去。 (4)構建基因表達載體時，DNA連接酶能催化目的基因和質粒載體這兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。 (5)轉基因植株的基因組中含有幾丁質酶基因，但該植株抗真菌的能力并沒有提高，可能是由于轉錄或翻譯異常，即幾丁質酶基因未能正常表達。 (6)目前關于轉基因生物安全性的爭論主要集中在食物安全、生物安全和環(huán)境安全三個方面。由于外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機的

8、，加之轉移的基因不少都是異種生物的基因，因此在轉基因生物中，有時候會出現(xiàn)一些人們意想不到的后果。 [答案]　(1)嫩葉組織細胞易破碎　防止RNA降解　(2)在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA　(3)目的基因無復制原點；目的基因無表達所需啟動子　(4)磷酸二酯鍵　(5)目的基因的轉錄或翻譯異?！?6)食物　生物　環(huán)境　外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機的(轉移的基因不少都是異種生物的基因) 3．(2019·安徽省宣城市高三期末)煙草是有重要經濟價值的雙子葉植物，易受TMV(煙草花葉病毒)感染而大幅度減產。絞股藍細胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMⅤ感

9、染。研究人員利用轉基因技術培育出了抗TMⅤ煙草，操作流程如圖所示。 (1)①表示遺傳信息流動中的________過程，所需原料為________。過程③所需要的工具酶是________________________________________。 (2)大量擴增目的基因可以使用PCR技術，該技術包括變性、退火、延伸三個步驟，變性這一步驟的目的是____________________________。 (3)過程④最常用的方法是________，過程⑤用到的細胞工程技術是______________________________。 (4)過程⑥還需要進行基因工程操作步驟中的_

10、_______________，其中，在個體水平上檢驗獲得的煙草能否抗TMV的方法是_____________。 [解析]　(1)①表示以RNA為模板逆轉錄形成DNA的過程，所需原料為DNA的單體：4種脫氧核苷酸。過程③構建基因表達載體的過程需要用同種限制酶切割目的基因與運載體，用相同的DNA連接酶連接目的基因與運載體的末端。 (2)PCR技術中的變性是利用高溫使DNA發(fā)生變性，解旋形成單鏈。 (3)過程④將目的基因導入植物體細胞的方法常用農桿菌轉化法，過程⑤受體細胞通過植物組織培養(yǎng)技術得到再生植株。 (4)過程⑥從再生植株中篩選成功轉基因的抗TMV煙草植株還需要進行基因工程操作步驟中

11、的目的基因的檢測與鑒定；其中，若從個體水平鑒定獲得的煙草能否抗TMV，可通過接種煙草花葉病毒的方法來確定。 [答案]　(1)逆轉錄　四種脫氧核苷酸　限制酶和DNA連接酶　(2)使DNA解旋為單鏈(DNA解旋)　(3)農桿菌轉化法　植物組織培養(yǎng)　(4)目的基因的檢測與鑒定　用TMV感染煙草，觀察煙草是否被感染(患病) 4．國際水稻研究所人員從產量低的耐淹水稻中找到一種耐淹基因，將其移入到高產熱帶水稻中，終于培育出耐淹的高產水稻品系，其產量比高產熱帶水稻產量還要高。耐淹基因移入的方法可通過轉基因技術實現(xiàn)。請回答下列相關問題： (1)為培育耐淹的高產水稻品系，應需將耐淹基因進行體外擴增。在PC

12、R反應體系中加入了熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等，還加入耐淹基因作為________，加入__________________________________作為合成DNA的原料。 (2)質粒常被用作運載體，因為質粒具有__________________(答2點即可)。構建耐淹基因的質粒表達載體時，常用不同的限制酶對耐淹基因和質粒進行切割，目的是________________________________________________________。 (3)根據(jù)耐淹基因表達的蛋白質，研究人員通過對它的氨基酸序列設計并人工合成耐淹基因。與水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在結構上缺

13、少了__________________________________。雖然兩種基因轉錄的產物不同，但最終表達出相同的蛋白質，可能原因是_____________。 (4)蛋白質工程中，要對蛋白質結構進行設計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質的原因是____________。 [解析]　(1)利用PCR技術在體外擴增耐淹基因(目的基因)時，在PCR反應體系中除了加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等外，還加入耐淹基因作為模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)作為合成DNA的原料。 (2)質粒被用作運載體，應具備的條件有：能在宿主細胞內復制并穩(wěn)定存在

14、；具有多個限制酶切位點，方便剪切；具有標記基因，便于檢測和篩選。構建耐淹基因的質粒表達載體時，用不同的限制酶對耐淹基因和質粒進行切割，可以減少耐淹基因及質粒的自身環(huán)化、使耐淹基因定向連接到質粒上，以增大耐淹基因正向(正確)連接的概率。 (3)根據(jù)耐淹基因表達的蛋白質的氨基酸序列推測出的mRNA分子中，缺乏與基因中的啟動子、終止子和內含子相對應的堿基序列。由于密碼子具有簡并性，雖然兩種基因轉錄的產物不同，但最終能夠表達出相同的蛋白質。 (4)由于直接改造的蛋白質不能遺傳，而改造基因易于操作且改造后能夠遺傳，所以在蛋白質工程中，要對蛋白質結構進行設計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不

15、直接改造蛋白質。 [答案]　(1)模板　dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)　(2)能在宿主細胞內復制并穩(wěn)定存在；具有多個限制酶切位點，方便剪切；具有標記基因，便于檢測和篩選(答2點即可)　減少耐淹基因及質粒的自身環(huán)化、增大耐淹基因正向(正確)連接的概率　(3)啟動子、終止子和內含子　密碼子具有簡并性　(4)改造基因易于操作且改造后能夠遺傳 5．(2019·廣東省實驗中學高三聯(lián)考)CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術是近年來頗受關注的一項新技術。該基因表達系統(tǒng)主要包含引導RNA和Cas9蛋白兩個部分，引導RNA能識別并結合特定的DNA序列，從而引導Cas9蛋白結合到相應位置

16、并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。研究人員試圖用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻產量基因Q基因進行編輯，請回答下列問題： (1)研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9僅存在于原核生物，故需借助________技術才能在水稻細胞中發(fā)揮作用。Cas9蛋白與________酶的功能相似。 (2)首先依據(jù)________的部分序列設計DNA片段A(負責編碼相應引導RNA)，再將片段A與含有Cas9基因的質粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達載體(如圖所示)。位點Ⅰ、位點Ⅱ分別表示________酶切位點。 (3)質粒B大小為2.5 kb(位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60

17、 b)，經酶切后的片段A大小為0.5 kb(千堿基對)，連接形成的表達載體大小為________kb。 (4)常用農桿菌轉化法將目的基因導入水稻受體細胞，依據(jù)農桿菌的侵染特點，目的基因將插入到Ti質粒的__________上，經過轉化作用，進入水稻細胞，并將其插入到________________________________，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達。 (5)CRISRP/Cas9基因編輯技術有時存在編輯對象出錯而造成脫靶，試從引導RNA的角度分析脫靶的原因____________________________________。 [解析]　(1)根據(jù)題干信息“Cas9蛋白結合到相

18、應位置并剪切DNA”，說明Cas9蛋白與限制酶的功能相似。 (2)由于是對水稻產量基因Q基因進行編輯，故首先需要依據(jù)Q基因的部分序列設計DNA片段A(負責編碼相應引導RNA)，再將片段A與含有Cas9基因的質粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達載體(如圖所示)。根據(jù)片段A兩端的限制酶種類以及片段A連接在位點Ⅰ、位點Ⅱ之間，可知位點Ⅰ、位點Ⅱ分別表示KpnⅠ和BamHⅠ的酶切位點。 (3)質粒B大小為2.5kb(位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60 b)，經酶切后的片段A大小為0.5 kb(千堿基對)，連接形成的表達載體大小為2.5＋0.5－0.06＝2.94 (kb)。

19、(4)常用農桿菌轉化法將目的基因導入水稻受體細胞，由于農桿菌的Ti質粒的T-DNA可轉移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，故可將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，經過轉化作用，進入水稻細胞，并將其插入到水稻細胞染色體的DNA上，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達。 (5)由于其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合，從而導致CRISRP/Cas9基因編輯技術會出現(xiàn)編輯對象出錯而造成脫靶。 [答案]　(1)轉基因(DNA重組或基因工程)　限制　(2)Q基因　KpnⅠ、BamHⅠ　(3)2.94　(4)T-DNA　水稻細胞染色體的DNA上　(5)其他DNA

20、序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合而脫靶 6．(2019·河南頂級名校高三聯(lián)考)為探究M基因的功能，科研人員將克隆得到的M基因導入擬南芥植株(自交繁殖)，流程圖如圖所示，回答下列問題： (1)通過過程a、b，采用________法來獲得了大量的M基因，過程b中需先加熱至90～95 ℃然后冷卻至55～60 ℃，冷卻的目的是__________________________________________________________________。 (2)為了獲得轉基因植物，采用________法侵染擬南芥的花序?；具^程如下： ①過程d：將重組質粒導

21、入大腸桿菌，其目的是____________。 ②過程e：將重組質粒導入農桿菌，再將含有重組質粒的農桿菌離心、富集，得到含有M基因的農桿菌液。 ③過程f：在擬南芥植株產生大量花序時，將其花表面部分在農桿菌懸浮液中浸泡20～30 s，3～4周后對轉化擬南芥植株收種子(T0)，浸泡之前，需先剪去已經長成的角果(這些角果將來發(fā)育成種子)，原因是_______________________。 ④將收獲的擬南芥種子T0，播種在含有________的培養(yǎng)基上，能健康生長的幼苗含有____________。 (3)采用農桿菌花序侵染的方法轉化，一般只能將目標片段整合到一條DNA上，若要獲得M基因穩(wěn)

22、定的突變體，需______________篩選出能穩(wěn)定遺傳的突變體。 [解析]　(1)圖示中由已知RNA獲取目的基因的方法是反轉錄法(逆轉錄法)，對目的基因進行擴增采用的是PCR技術。進行PCR時需加熱至90～95 ℃然后冷卻至55～60 ℃，冷卻的目的是使引物結合到互補DNA鏈上。 (2)圖示中將基因表達載體構建完成后沒有直接導入農桿菌，而是先將其導入大腸桿菌，目的是利用大腸桿菌的增殖來獲取大量重組質粒(讓目的基因擴增)。 適合轉化植株的花卉應沒有成熟，也沒有產生已受精的角果。因為這些已受精的角果將來結的種子肯定是非轉基因的，如果不剪掉的話會降低轉化率，不利于后續(xù)操作。 由于質粒中含

23、有卡那霉素抗性基因，成功轉入重組質粒的種子能夠在卡那霉素培養(yǎng)基上正常生長，非轉基因種子不能正常生長，一般萌發(fā)后死亡。 (3)由于農桿菌介導的花序侵染法一般只能將目標片段整合到一條DNA單鏈上，為篩選出能穩(wěn)定遺傳的突變體，可將T0代連續(xù)自交。 [答案]　(1)反轉錄法(或逆轉錄法)和PCR　使引物結合到互補DNA鏈上　(2)農桿菌轉化?、佾@取大量重組質粒(讓目的基因擴增)?、圻@些已受精的角果將來結的種子是非轉基因的?、芸敲顾亍(目的)基因 (3)T0代連續(xù)自交 7．(2019·廣東省高三模擬)人參是珍貴的藥用植物，研究人員運用轉基因技術構建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人參細胞

24、表達系統(tǒng)，為珍貴藥用植物與疫苗聯(lián)合應用開辟了新思路，其構建過程如圖所示，圖中SmaⅠ、SstⅠ、 EcoRV為限制酶。請回答相關問題： (1)②的構建過程除限制酶外還需要________酶；想要從②中重新獲得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoR Ⅴ或SmaⅠ，原因是__________________________________________。 (2)將重組質粒轉入農桿菌常用________處理細胞；要使目的基因成功整合到人參細胞的染色體上，該過程所采用的質粒應含有____________。 (3)分析圖可知，②中應含有的標記基因是________；過程⑤的目的是____

25、__________________________。 (4)研究人員將HBsAg基因表達蛋白上的某位點氨基酸進行替換，通過一定的方法獲得了新HBsAg基因，進而獲得了免疫效應更強的疫苗，請按照蛋白質工程的原理寫出獲得新HBsAg基因的基本途徑_______________。 [解析]　(1)圖中②為重組質粒，其形成時需要限制酶和DNA連接酶的參與；據(jù)圖分析可知，EcoR V、SmaⅠ切割后得到的是平末端，然后用DNA連接酶連接后，所形成的重組序列不能再被EcoR V和SmaⅠ識別，因此想要從②中重新獲得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoRV或SmaⅠ。 (2)將目的基因導入農桿菌

26、等微生物的方法是用鈣離子處理細胞；農桿菌的質粒中含有一段可以轉移的DNA，即T-DNA，它能將目的基因成功整合到人參細胞的染色體上。 (3)⑤過程中是將受體細胞放入含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選出含有HBsAg基因的人參細胞，因此②中應含有的標記基因是氨芐青霉素抗性基因。 (4)據(jù)題意可知，按照蛋白質工程設計實驗的過程為從HBsAg基因表達蛋白的功能出發(fā)→設計HBsAg基因表達蛋白的結構→將HBsAg基因表達蛋白上的某位點氨基酸進行替換→找到并改造HBsAg基因的脫氧核苷酸序列。 [答案]　(1)DNA連接　兩平末端連接后的重組序列不能再被EcoR V和SmaⅠ識別(重組質粒無這種限

27、制酶的識別序列)　(2)鈣離子(Ca2＋)　T-DNA　(3)氨芐青霉素抗性基因　篩選出含有HBsAg基因的人參細胞 (4)從HBsAg基因表達蛋白的功能出發(fā)→設計HBsAg基因表達蛋白的結構→將HBsAg基因表達蛋白上的某位點氨基酸進行替換→找到并改造HBsAg基因的脫氧核苷酸序列 8．(2019·濮陽市高三二模)P450是石油降解的關鍵酶，用SalⅠ和NdeⅠ聯(lián)合酶切獲得的P450基因，與如圖所示的質粒(pCom8)重組，導入土著菌種Y9，獲得了基因工程菌P450/Y9。圖中mel是黑色素合成基因，其表達能使白色的菌落變成黑色，aacCl是慶大霉素(一種抗生素)抗性基因，限制酶NdeⅠ

28、、XhoⅠ和SspⅠ在原質粒上均只有一個酶切位點。如圖表示幾種限制酶的識別序列和切割位點，據(jù)圖回答下列問題： (1)構建pCom8重組質粒時，需用________________________(限制酶)對圖示質粒進行處理，才能與________________在DNA連接酶的作用下形成重組質粒。 (2)為了擴增重組質粒，需將其轉入用________預先處理的土著菌種Y9中，提高質粒導入率，以便獲得更多基因工程菌P450/Y9。為了篩選出轉入了重組質粒的基因工程菌P450/Y9，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________作為載體的質粒除了含有標記基因，還應該含有_____________

29、_(至少寫兩個)。 (3)為檢測基因工程菌降解石油能力的大小，可觀測的指標是________________________________________。土著菌種Y9不能降解石油，但轉入上述構建好的表達載體后則獲得降解石油的能力，這是因為__________________________________________。 [解析]　(1)根據(jù)題干信息已知，切割目的基因的限制酶是SalⅠ和NdeⅠ，而pCom8上無SalⅠ的切割位點，又因為如圖顯示SalⅠ和XhoⅠ切割后露出的黏性末端是相同的，因此可以用NdeⅠ、XhoⅠ切割質粒，然后與目的基因在DNA連接酶的作用下形成重組質粒。

30、(2)為提高質粒導入率，土著菌種Y9預先需用Ca2＋處理。因為XhoⅠ切割質粒會破壞標記基因mel，而aacCl未破壞，因此為了篩選出轉入了基因工程菌P450/Y9，應在篩選培養(yǎng)基中加入慶大霉素。質粒具備的特點有：含有標記基因、啟動子、終止子、復制原點、自我復制等。 (3)為檢測基因工程菌降解石油能力的大小，可在一定時間內觀測所取樣品石油的剩余量。P450是石油降解的關鍵酶，轉入表達載體后，P450基因得以表達，即基因工程菌P450/Y9可分泌降解石油的P450酶。 [答案]　(1)NdeⅠ、XhoⅠ　目的基因(或P450基因) (2)Ca2＋(或CaCl2)　慶大霉素　啟動子、終止子、復制原點(答出兩點即可) (3)2天后(或一定時間后)樣品中石油的含量(剩余量) 　基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶(答案合理即可) 9