2022年高二生物人教版選修1教案:5-2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》
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1、2022年高二生物人教版選修1教案:5-2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》 一、【課題目標(biāo)】 (一)知識(shí)與技能 1、了解PCR技術(shù)的基本操作 2、理解PCR的原理 3、討論P(yáng)CR的應(yīng)用 ???(二)過(guò)程與方法 在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,應(yīng)避免外源DNA污染,嚴(yán)格控制溫度等反應(yīng)條件 (三)情感、態(tài)度與價(jià)值觀(guān) 通過(guò)對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)的操作及結(jié)果分析,培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實(shí)事求是的科研精神 二、【課題重點(diǎn)】 PCR的原理和PCR的基本操作 三、【課題難點(diǎn)】 PCR的原理 四、【教學(xué)方法】 啟發(fā)式教學(xué) 五、【教學(xué)工具】
2、 多媒體課件 六、【教學(xué)過(guò)程】 (一)引入新課 在現(xiàn)代生物技術(shù)中,DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類(lèi)基因組計(jì)劃、基因工程、基因診斷、基因檢測(cè)、古生物鑒定等都離不開(kāi)對(duì)DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列,就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢?今天我們來(lái)研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴(kuò)增技術(shù)――PCR技術(shù)。 (二)進(jìn)行新課 1.基礎(chǔ)知識(shí) PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過(guò)程,與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程類(lèi)似: 1.1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析: 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復(fù)制的模板 原料 四種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 D
3、NA聚合酶 打開(kāi)DNA雙螺旋 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3’端起點(diǎn) 1.2細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程 (1)DNA的反向平行結(jié)構(gòu):(結(jié)合教材圖5-6) 核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性:(分子結(jié)構(gòu)模式圖) 由核苷酸通過(guò)3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長(zhǎng)鏈:(模式圖,體現(xiàn)方向性)。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu): (2)DNA的復(fù)制過(guò)程: 解 旋:解旋酶、ATP,DNA兩條鏈打開(kāi),,形成兩條DNA單鏈。 引物結(jié)合:在DNA單鏈3’端與DNA反向配對(duì)結(jié)合,確保引物3’端與DNA單鏈準(zhǔn)確配對(duì)。 DNA聚
4、合酶結(jié)合: 子鏈合成:DNA聚合酶從引物3’端開(kāi)始,將配對(duì)的脫氧核苷酸連接起來(lái)。 后續(xù)加工:DNA聚合酶I將引物切去,并合成空缺處的DNA單鏈,再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來(lái)(半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈,滯后鏈) 子鏈合成特點(diǎn):不能從頭合成;合成方向?yàn)椤?’→3’合成”。 感悟生命的神秘:DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成,還具有校對(duì)功能。它在每引入一個(gè)核苷酸后都要復(fù)查一次,只有堿基配對(duì)無(wú)誤后才能繼續(xù)往下聚合,它不能從頭合成。RNA聚合酶沒(méi)有校對(duì)功能,因此RNA的合成不需要引物,而是從頭合成的,它的錯(cuò)配可能性較大,在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去,代之以高保真
5、的DNA鏈。 思考]DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些? DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板;堿基互補(bǔ)配對(duì);DNA聚合酶的復(fù)查功能。 思考]細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的?RNA合成、蛋白質(zhì)合成。 1.3DNA分子復(fù)制的人工控制 解開(kāi)螺旋:在80~100℃時(shí),DNA雙螺旋打開(kāi),形成兩條DNA單鏈,稱(chēng)為變性。 恢復(fù)螺旋:在50℃左右時(shí),兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu),稱(chēng)為復(fù)性。 復(fù)制條件:緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。 反應(yīng)場(chǎng)所:PCR儀(自動(dòng)溫度周期性調(diào)節(jié))。 思考]緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分?(核基質(zhì))4.PCR的反應(yīng)過(guò)程 變性 復(fù)性 延伸
6、 變性:在95℃時(shí)DNA解旋 復(fù)性:在50℃時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合 延伸:在72℃時(shí)合成DNA子鏈(兩個(gè)引物間的序列) 2.實(shí)驗(yàn)操作 2.1 PCR反應(yīng)體系:緩沖液、DNA模板,四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物,水 2.2 實(shí)驗(yàn)操作步驟 2.3 按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液; (2)將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管(0.5mL)中; (3)將微量離心管放到PCR儀中; (4)設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。 (5)DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。 2.4 水浴法:將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時(shí)間。
7、 3.實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 3.1避免外源DNA污染:所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。 3.2緩沖液和酶分裝成小份,-20℃低溫保存。 3.3每添加一種反應(yīng)成分,更換一個(gè)移液器的槍頭。 3.4混勻后離心處理,使反應(yīng)液集中在離心管底部。 4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 4.1反應(yīng)液稀釋?zhuān)喝?μLPCR反應(yīng)液,添加98μL蒸餾水;2.分光光度計(jì)調(diào)零:將100μL蒸餾水添加到比色杯中,在260nm處將分光光度計(jì)調(diào)整讀數(shù)為零。 4.2將100μL反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中,測(cè)定在260nm處的光吸收值。 4.3計(jì)算:DNA含量=50×光吸收值×稀釋倍數(shù) (三)課堂總結(jié)、點(diǎn)評(píng) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增
8、DNA片段 PCR原理 DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物 DNA的變性和復(fù)性受溫度影響 PCR過(guò)程 變性 復(fù)性 延伸 操作步驟 配制PCR反應(yīng)體系 移入離心管 放入PCR 設(shè)置工作參數(shù) DNA擴(kuò)增 測(cè)定含量 稀釋 調(diào)零 測(cè)定并讀數(shù) 計(jì)算 (四)實(shí)例探究 例1 在( )的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi) A. 10-20℃ B. 80-100℃ C. 20-30℃ D. 40-60℃ 解析:蛋白質(zhì)大多不能忍受60-80℃的高溫,而DNA在80℃以上才會(huì)變性。 答案:B
9、 例2 關(guān)于DNA的復(fù)制,下列敘述正確的是( ) A. DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA,只能從5’端延伸DNA鏈 B. DNA復(fù)制不需要引物 C. 引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合 D. DNA的合成方向總是從子鏈的3’端向5’端延伸 解析:由于DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA,只能從引物的3’端即復(fù)制方向由3’端向5’端延伸;由于DNA分子是反向平行的,子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,在DNA聚合酶作用下合成的,其合成方向是從子鏈5’端向3’端延伸。 答案:C ☆綜合應(yīng)用 例3 下列有關(guān)PCR描述,不正確的是( ) A. 是一種酶促反應(yīng) B. 引物
10、決定了擴(kuò)增的特異性 C. 擴(kuò)增產(chǎn)量按y=(1+X)n D. 擴(kuò)增對(duì)象是氨基酸序列 E. 擴(kuò)增對(duì)象是DNA序列 解析:PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù),它以極少量的DNA為模板,以四種脫氧核苷酸為原理,在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3’端連接脫氧核苷酸,短時(shí)間內(nèi)迅速?gòu)?fù)制上百萬(wàn)份的DNA拷貝,其擴(kuò)增產(chǎn)量為y=(1+X)n,y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù),x表示平均每次的擴(kuò)增效率,n代表循環(huán)次數(shù),因此答案選D。 答案:D (五)鞏固練習(xí) 1.DNA分子復(fù)制時(shí),解旋的兩條鏈中( ) A僅一條作為復(fù)制模板 B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA分子 C兩條鏈
11、作為模板并復(fù)制出兩個(gè)相同的DNA分子 D兩條鏈作為模板,各自合成一條子鏈,然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來(lái)的雙螺旋分子,兩條新鏈結(jié)合成一個(gè)全新的DNA分子 2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過(guò)程的正確順序是( ) ①互補(bǔ)堿基對(duì)之間氫鍵斷裂②互補(bǔ)堿基對(duì)之間形成氫鍵③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)⑤子鏈與母鏈盤(pán)旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu) A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤ 3.下列各項(xiàng)過(guò)程中,遵循“堿基互補(bǔ)配對(duì)原則”的有( ) ①DNA復(fù)制②RNA復(fù)制③轉(zhuǎn)錄④翻譯⑤逆轉(zhuǎn)錄 A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤
12、 D①③④⑤ 4.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是( ) ①酶②游離的脫氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦適宜的溫度⑧適宜的酸堿度 A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧ 5.利用PCR技術(shù),把一個(gè)雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代,經(jīng)過(guò)3次循環(huán),在第四代DNA分子中,有幾條第一代脫氧核苷酸的長(zhǎng)鏈?( ) A 2 B 4 C 8 D 16, 6.關(guān)于DNA分子的敘述中,正確的是( ) A .DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同,同向平行 B.DN
13、A的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同,反向平行 C.DNA的兩條鏈中極性不同,反向平行的 D.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性不同,同向平行 7.假設(shè)PCR反應(yīng)中,只有一個(gè)DNA的片段作為模板,請(qǐng)計(jì)算在30次循環(huán)后,反應(yīng)物中大約有多少這樣的DNA片段( ) A 215 B 230 C 260 D 231 8.DNA的合成方向總是( )延伸。 A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端 C從子鏈的5,端向3,端 D從子鏈的3,端向5,端 9.要使PCR反應(yīng)在體外的條件下順利地進(jìn)行,需要嚴(yán)格的控制( )
14、A 氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D 大氣的濕度 10.DNA分子經(jīng)PCR反應(yīng)循環(huán)一次后,新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與( ) A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同 答案: CDADA CBCCB 七、【課余作業(yè)】 1、PCR與生物體DNA復(fù)制有何區(qū)別? 2、如果在案件偵破過(guò)程中,只收集到一根毛發(fā),但它所含的遺傳信息太少,該怎么辦呢? 八、【教學(xué)體會(huì)】 教師在教學(xué)過(guò)程中,可以鮮引導(dǎo)學(xué)生回憶必修2的有關(guān)DNA復(fù)制的知識(shí),在此基礎(chǔ)上,學(xué)生可加深對(duì)于PCR原理的認(rèn)識(shí)。對(duì)于PCR反應(yīng)過(guò)程的教學(xué),應(yīng)以
15、讀圖識(shí)圖為主。教材中反應(yīng)過(guò)程圖解詳細(xì)的描繪了參與PCR的各種組成成分;每一輪反應(yīng)的三個(gè)基本步驟—變性、復(fù)性、延伸;每一步驟的作用。教師在教學(xué)中可以請(qǐng)學(xué)生在讀圖的同時(shí),結(jié)合教科書(shū)中的文字說(shuō)明來(lái)加深理解。當(dāng)學(xué)生遇到難以理解的地方時(shí),教師要及時(shí)給予解答。 九、【資料袋】 免疫-PCR 免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測(cè)系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性來(lái)檢測(cè)抗原,尤其適用于極微量抗原的檢測(cè). 免疫-PCR試驗(yàn)的主要步驟有三個(gè):①抗原-抗體反應(yīng),②與嵌合連接分子結(jié)合,③PCR擴(kuò)增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA).該技
16、術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中,嵌合連接分子起著橋梁作用,它有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),一個(gè)與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合,一個(gè)與質(zhì)粒DNA結(jié)合,其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似,不同之處在于其中的標(biāo)記物不是酶而是質(zhì)粒DNA,在操作反應(yīng)中形成抗原抗體-連接分子-DNA復(fù)合物,通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA來(lái)判斷是否存在特異性抗原. 免疫PCR優(yōu)點(diǎn)為:①特異性較強(qiáng),因?yàn)樗⒃诳乖贵w特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上.②敏感度高,PCR具有驚人的擴(kuò)增能力,免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上,可用于單個(gè)抗原的檢測(cè).③操作簡(jiǎn)便,PCR擴(kuò)增質(zhì)粒DNA比擴(kuò)增靶基因容易得多,一般實(shí)驗(yàn)室均能進(jìn)行.
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