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1、CRISPR-Cas 9，目標(biāo)基因操作技術(shù)，術(shù)語解釋，1 crispr:群集regularly interspaced short palindromic repeat sequences群集，規(guī)則間隔的短回文重復(fù)2 cc宿主細(xì)胞基因組藥物分子有效果目標(biāo)組織或細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移或作用。根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，1 CRISPR-Cas特別識別入侵許多細(xì)菌和大部分古生菌天然免疫系統(tǒng)的病毒和核酸，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，達(dá)到自身免疫。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞以間隔素決定的外源DNA特異性免疫。在宿主防御噬菌體攻擊中，細(xì)菌對自然界龐大的噬菌體群體進(jìn)化出了CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)免

2、疫。牙齒免疫功能的發(fā)揮是通過添加或刪除CRISPR間隔序列的動態(tài)變化，即間隔。CRISPR-Cas概述，CRISPR-Cas:一種茄子來源是細(xì)菌獲得免疫的RNA引導(dǎo)Cas蛋白，修飾目標(biāo)基因的技術(shù)。CRISPR-Cas概述，CRISPR-Cas主要由兩部分組成。標(biāo)識CRISPR位通常為2148 BP長度，重復(fù)序列由短而保守的重復(fù)序列(以2672 BP間隔序列(spacer)分隔)組成。CRISPR是通過這些間隙序列和目標(biāo)基因識別的。Cas家族，CRISPR associated(Cas):在CRISPR部位附近的雙鏈DNA核酸酶，在guide RNA的引導(dǎo)下，可以切割靶部位。它類似于滑石粉酶功能

3、，但不需要形成二聚體。(阿爾伯特愛因斯坦、美國電視電視劇(Northern Exposure，Northern Exposure)、Cas分類、Cas基因多樣性非常豐富，因此簡單的分類是動員但功能不相關(guān)的30多個Cas蛋白質(zhì)研究小組考慮了若干茄子因素，包括保守的Cas蛋白質(zhì)之間的進(jìn)化關(guān)系和Cas基因操作員的組成方式第一級主要是對外。第二個級別主要是識別和分解初級CRISPR RNA成熟和入侵的外源遺傳物質(zhì)，可以將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為三種茄子類型：Type、Type和Type。Cas 9，Type系統(tǒng)的主要特征是包含代表性的CAS9蛋白質(zhì)(分子質(zhì)量大的多功能蛋白質(zhì))。Cas9蛋白包含兩個

4、功能域，一個在N端，一個與Ruc核酸酶具有相似的活性，一個在中部具有與HNH核酸酶類似的活性。隱性鏈球菌具有典型的Type CRISPR/Cas系統(tǒng)，CRISPR/Cas系統(tǒng)對trans-activating crRNA(tracrRNA)進(jìn)行編碼，指導(dǎo)RNase和Cas9完成燈泡crRNA的成熟。然后，tracrRNA可以與成熟crRNA的重復(fù)序列配對，形成RNA二聚體，與Cas9蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合體，發(fā)揮識別和分解入侵的外源DNA功能36，CRISPR-Cas9原理。牙齒系統(tǒng)的運作方式是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基對與trans-activating R

5、NA(TRAC RNA)結(jié)合，形成TRAC RNA/crRNA復(fù)合物，誘導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白以RNA為導(dǎo)向的dsDNA結(jié)合蛋白Cas9效應(yīng)核酸酶是第一個能夠攻克RNA、DNA、蛋白質(zhì)的統(tǒng)一因子，具有巨大的改造潛力?？梢詫⒌鞍踪|(zhì)與沒有核酸酶的Cas9(Cas9核酶-空)融合，表達(dá)適當(dāng)?shù)膕gRNA，以所有dsDNA序列為目標(biāo)，sgRNA的末端可以連接到目標(biāo)DNA，而不會影響Cas9的結(jié)合。因此，Cas9可以從所有dsDNA序列中帶來融合蛋白和RNA，這給生物體的研究和改造帶來了很大的潛力。應(yīng)用，基因敲除動物模型一直是在活動物上進(jìn)行基因功能研究，尋找適當(dāng)藥物作用目標(biāo)的重要工具。但是傳統(tǒng)的基因敲除方法

6、需要經(jīng)過復(fù)雜的目標(biāo)向量構(gòu)建、ES細(xì)胞篩選、嵌合鼠標(biāo)選育等一系列階段，程序繁瑣，對技術(shù)的要求高，不僅成本高，時間長，成功率也受到多種茄子因素的限制。即使在技術(shù)比較成熟的實驗室，利用傳統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建基因敲除、老鼠通常也需要一年以上的時間。2 2013年1月，美國兩個研究所在科學(xué)雜志上發(fā)表了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的細(xì)胞株基因敲除的新方法。與以前的技術(shù)不同，牙齒技術(shù)利用目標(biāo)特異性RNA將Cas9核酸酶引入基因組的特定目標(biāo)，切割特定基因部位，使其突變。牙齒技術(shù)迅速應(yīng)用于基因敲除小鼠和松鼠動物模型的構(gòu)建。通過一系列研究，首先通過RNA注射將CRISPR-Cas系統(tǒng)導(dǎo)入大鼠受精卵，證明在胚胎中發(fā)生點突變

7、比DNA注射更有效。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)牙齒方法沒有老鼠遺傳系統(tǒng)的限制，可以刪除大塊基因組DNA，同時注射不同基因的RNA序列，從而達(dá)到在同一老鼠或老鼠上引起多個基因突變的效果。另外，事實證明，利用CRISPR-Cas技術(shù)制作的基因敲除大鼠模型與傳統(tǒng)方法制作的相同基因(肥胖相關(guān)G蛋白結(jié)合受體Mc4R)突變大鼠相比，具有一致的表現(xiàn)形式。用牙齒方法制作的基因突變動物具有比現(xiàn)有方法高得多的生殖系統(tǒng)遷移能力，是建立可靠、高效、快速挖空動物模型的新方法。2 CRISPR-Cas技術(shù)要求鋅脂核酸酶(ZFN)、ES細(xì)胞目標(biāo)、RNA目標(biāo)序列和基因組序列完全一致，這樣Cas9才能切割DNA。2、可以同時敲目標(biāo)基因的多個部位。3.實驗周期短，最多只需2個月，可以節(jié)省很多時間和金錢。4.無宗限制缺點：牙齒系統(tǒng)是否有脫果效果需要進(jìn)一步研究。視頻，crispr cas 9，再見。