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,L-Arg，L-OH-Arg和含精氨酸的小分子多肽是合成NO的前體。 在組織中，L-Arg以還原型輔酶II（NADPH）作為電子供體。 生成的NO以擴(kuò)散的形式到達(dá)并進(jìn)入靶細(xì)胞。,化學(xué)性質(zhì)活潑：其T1/2僅2-5sec； 易與氧反應(yīng)，生成新的毒性自由基 可被O2-滅活而生成過氧化亞硝酸陰離子(ONOO-)。 在酸性條件下： ONOO- ??? ? + 氧化性及對細(xì)胞的毒性作用均明顯強(qiáng)于NO。,1,NO合成和釋放的影響因素,引起NO合成和釋放的刺激主要有兩種： 化學(xué)性刺激（如Ach、緩激肽等）； 機(jī)械性刺激（如血管張力、剪應(yīng)力、EC變形及血液脈沖流動等）： 剪應(yīng)力加大可激活位于EC表面的機(jī)械性感受器，使NOS活性增強(qiáng)。 *NO及NO前體可以反饋性抑制主動脈EC中的NOS，而不影響NO對VSM的直接舒張作用,NO彌散進(jìn)入VSM細(xì)胞內(nèi)，通過與鳥苷酸環(huán)化酶(GC)中血紅素卟啉環(huán)中的Fe2+結(jié)合，將卟啉環(huán)中的Fe2+ 拉出表面，引起GC構(gòu)型發(fā)生改變而激活，從而使三磷酸鳥苷（GTP）轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)磷酸鳥苷（cGMP），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高。 cGMP水平升高 —調(diào)節(jié)離子通道 —依賴于cGMP的蛋白激酶 —激活cGMP的磷酸二酯酶 —抑制cGMP的磷酸二酯酶,NO作用機(jī)制,2,NO的細(xì)胞毒性,病理狀態(tài)下，NO短暫升高，一方面，它對人體可起到有益作用（抗菌、抗寄生蟲、抗病毒或殺傷腫瘤）；另一方面，不加控制的高水平NO則對人體有害： —ONOO- ??? ? + —與一些酶的鐵-硫中心結(jié)合，影響線粒體電子傳遞、檸檬酸循環(huán)和DNA合成。,3,NOS分類及分布,應(yīng)用蛋白質(zhì)生化和分子克隆技術(shù)已分離出至少3種獨(dú)立的NOS基因，并以組成或克隆的先后順序命名為： ①神經(jīng)型（ncNOS）或稱I型NOS：腦、平滑肌、骨骼肌、肝細(xì)胞以及胰、胃、腎等 ②巨噬細(xì)胞型（iNOS）又稱免疫型或II型NOS：巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及心肌細(xì)胞 ③內(nèi)皮型（ecNOS）或III型NOS：血管內(nèi)皮細(xì)胞,4,NOS在細(xì)胞內(nèi)存在形式,NOS是一種含鐵的單胺氧化酶，根據(jù)對Ca2+的依賴性，在細(xì)胞內(nèi)的存在形式分為： 結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)：活性受Ca2+和CaM濃度的調(diào)控；主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板，神經(jīng)組織中次之。 誘導(dǎo)型NOS (iNOS)：活性與Ca2+濃度無關(guān)，但需要脂多糖（LPS）和細(xì)胞因子如IL-1和IFN-?激活后才能表達(dá)。也可被塞米松、皮質(zhì)類固醇、雌激素、生長轉(zhuǎn)化因子、IL-4、IL-8及IL-10所抑制。,5,NOS抑制劑研究進(jìn)展,左旋精氨酸(L-arg)類似物：如 L-NMA, L-NCPA，L-NAA, L-NAHA, L-NAME, L-NMME等都是NOS的競爭性抑制劑。 其中L-NAME和L-NAA是iNOS的選擇性抑制劑，對白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)產(chǎn)生的心肌收縮能力衰退具有明顯的保護(hù)作用。,6,糖皮質(zhì)激素： —能抑制各種細(xì)胞中由內(nèi)毒素或細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NOS的活性，包括內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肝細(xì)胞等。 —能顯著地抑制心肌梗塞中iNOS的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，降低心肌細(xì)胞中cGMP水平，降低過量NO對心肌細(xì)胞的毒性作用，對心肌的收縮功能起代償作用。 —對cNOS無抑制作用。,7,氨基胍 (aminoguanidine) 是一種iNOS的選擇性抑制劑，抑制作用大于精氨酸類似物， 它對iNOS的抑制作用明顯大于cNOS。 它能明顯延緩內(nèi)毒素休克引起的循環(huán)衰竭，改善內(nèi)毒素血癥中老鼠的成活率； 通過抑制iNOS的活性，使NO的合成減少，抑制內(nèi)毒素血癥引起的血壓下降和對去甲腎上腺素的血管低反應(yīng)性,8,異硫脲類似物（被硫替代的）：如 硫-甲基異硫脲(SMT)、硫-氨乙基異硫脲(SAETU)、硫-乙基異硫脲(SETU)、硫-異丙基異硫脲( SIPTU) 都是NOS抑制劑。 前兩者是iNOS的強(qiáng)大抑制劑。抑制作用明顯L-NMA，但對血管內(nèi)皮細(xì)胞NOS的抑制作用?L-NMA 顯著地改善急性心肌梗塞后的左室功能，增加心肌的血流供應(yīng)。,9,其它NOS抑制劑 雙氫吡啶拮抗劑和鈣通道激動劑(BYk8644)是一種非鈣依賴性NOS抑制劑。能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NOS。鈣拮抗劑硝苯吡啶同樣能夠抑制體內(nèi)和體外非鈣依賴性NOS的活性。 轉(zhuǎn)移生長因子-β2劑量依賴性地抑制白介素-1β和TNF-α刺激GC的形成和NOS的誘導(dǎo)。 亞甲藍(lán)，一種GC抑制劑，它同樣抑制NOS的活性，改善膿毒性休克的血流動力學(xué)。 環(huán)胞霉素，一種免疫抑制劑，可有效地抑制iNOS基因和iNOS酶活性。,10,3、一氧化氮（NO） 大量研究表明， NO在腦缺血或缺血再灌注損傷中有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒兩種傾向。 少量的NO→激活鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC) → cGMP↑ → 調(diào)節(jié)腦血流量和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育； 過量的NO →細(xì)胞損傷。當(dāng)突觸前膜受刺激釋放Glu →激活突觸后膜上的NMDA受體→ Ca2+內(nèi)流↑↑ →激活一氧化氮合酶→產(chǎn)生過量的NO →細(xì)胞毒性。,11,1、γ-氨基丁酸(GABA),GABA在神經(jīng)組織中的形成是通過突觸中的谷氨酸脫羧酶的脫羧作用而產(chǎn)生的, 其降解是氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶催化實(shí)現(xiàn)的。,作用機(jī)制：使細(xì)胞膜對Cl- 的通透性↑→突觸后神經(jīng)元放電速率↓→神經(jīng)元活動↓ 。 史嘉偉等在研究GABA對血管平滑肌的作用時發(fā)現(xiàn)： 5-HT可使血管收縮；而GABA可使收縮的血管舒張,此作用對腦血管較外周血管明顯,可能與受體的密度有關(guān)。,12,（一）GABA受體,根據(jù)受體對激動劑及拮抗劑的敏感性, 可將GABA 受體主要分為A 、B 、C 三個亞型。 GABA與GABAA受體結(jié)合,引起突觸后膜Cl-通道啟開,產(chǎn)生IPSP,抑制神經(jīng)元放電。 其突觸后抑制效應(yīng)可被荷包牡丹堿(Bicuculline, Bic)特異地阻斷。 GABAB受體對Bic不敏感,但可與GABA和苯氯丁氨酸發(fā)生高親和性地結(jié)合, 通過激動位于膜上的G蛋白, 抑制Ca2+內(nèi)流,在突觸前抑制其他興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而產(chǎn)生抑制效應(yīng)。 因此GABA與A、B受體都可結(jié)合,而苯氯丁氨酸是B受體的激動劑。,13,（二）GABA的心血管作用,1、降血壓作用 主要通過以下幾個方面降低血壓： ①腎功能活化作用：高血壓患者往往腎功能降低, GABA有腎功能活化作用。腎功能活化后, 由于利尿作用激活,過剩鹽分可從尿中排出,使血壓降低,從而可預(yù)防高血壓。 ②GABA作用于延髓的血管運(yùn)動中樞,使血壓降低。 ③抑制加壓素的分泌,擴(kuò)張血管,降低血壓。 2、GABA對腦缺血缺氧的保護(hù)作用 GABA對腦缺血缺氧有保護(hù)作用： 研究表明，給予GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿以及Cl-通道拮抗劑NPPB可阻斷GABA 的保護(hù)作用。 因此，GABA可提高海馬腦片耐缺氧能力, 其機(jī)制可能與GABA通過GABAA受體↑Cl-內(nèi)流有關(guān)。,14,細(xì)胞內(nèi)主要的氧化還原對,氧化型與還原型輔酶II (NADPH/NADP+)：輔酶Ⅱ則是維持谷胱甘肽于還原狀態(tài)的還原當(dāng)量提供者，NADPH是機(jī)體內(nèi)生成的基本的抗氧化劑 氧化型與還原型硫氧還原蛋白(TRXRED/TRXOX) 氧化型與還原型谷光甘肽(GSH/GSSG)。 機(jī)體內(nèi)的氧化劑 活性氧(reactive oxygen species,ROS) 主要是超氧陰離子(O2-或HO2-) 與羥自由基(-OH)及其活性衍生物如過氧化氫H2O2)、-O2及LO、LOO及LOOH等脂質(zhì)過氧化物。 活性氮(reactive nitrogen species,RNS) , 主要是NO及NO/O2、NO/O2-反應(yīng)生成的系列含氮化合物,15,,體內(nèi)主要的氧化還原對：谷胱甘肽還原型/氧化型(GSSG/GSH)和輔酶Ⅱ(NADPH/NADP）為機(jī)體的氧化還原反應(yīng)提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。 GSH/GSSG所起的作用最大,其含量要比其他兩個高出100倍以上，細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化在很大程度上受到GSH/GSSG 的影響。是機(jī)體的主要內(nèi)源性氧化-還原調(diào)控因子，其-SH和-S-S-間的轉(zhuǎn)換調(diào)控著許多生物大分子的活性，被稱為“分子開關(guān)” 。谷胱甘肽在體內(nèi)含量非常豐富，是機(jī)體的主要抗氧化防御機(jī)制之一。 通過檢測谷胱甘肽(glutathione)氧化型/還原型(GSSG/GSH)及其氧化-還原電位和NADP+/NADPH氧化型/還原型及其氧化-還原電位可以了解機(jī)體的氧化-還原狀態(tài)，進(jìn)而了解其與疾病的關(guān)系。,16,自由基的有益作用,吞噬作用：活性氧有助于吞噬細(xì)胞殺滅細(xì)菌。當(dāng)吞噬細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用時常與氧代謝突然增長聯(lián)系在一起，這一現(xiàn)象稱為“呼吸爆發(fā)”。氧代謝首先產(chǎn)生大量的H2O2，其次產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，另外還產(chǎn)生一定量的羥自由基和單線態(tài)氧。機(jī)體內(nèi)的葡萄糖提供了產(chǎn)生超氧陰離子自由基所需的能量，而氧呼吸突發(fā)中產(chǎn)生的各類活性氧中以H2O2的殺菌作用最強(qiáng)，并且其殺菌能力在有鹵素離子及過氧化物酶存在時能增強(qiáng)數(shù)倍。 參與花生四烯酸氧化成前列腺素。抗氧化劑在體內(nèi)一方面可使膜磷脂在磷脂酶A2和鈣存在的條件下生成足夠的花生四烯酸，使之在環(huán)氧合酶作用下生成前列腺素；另一方面抗氧化劑又能清除[OX]，保護(hù)環(huán)氧合酶和其他氧化酶不失活，使前列腺素代謝正常進(jìn)行?？寡趸瘎┻€能使膜脂過氧化物的形成減少，保護(hù)前列腺環(huán)素合成酶，使PGH2在前列腺環(huán)素合成酶作用下生成PGI2。PGI2又能對抗凝血惡烷，以減少TXA2所引起的血小板聚集和黏附，減輕機(jī)體微循環(huán)障礙。,17,自由基的有益作用,參與凝血酶原的生物合成：超氧陰離子自由基通過參與形成羧化劑，羧化劑催化凝血酶原前體生成凝血酶原。 解毒作用：機(jī)體對外來物質(zhì)的解毒作用主要在肝臟中進(jìn)行，是通過肝微粒體細(xì)胞色素P450催化各類外來物質(zhì)羧化作用實(shí)現(xiàn)的。肝微粒體解毒系統(tǒng)包括3個部分，即細(xì)胞色素P450，需NADPH的細(xì)胞色素P450還原酶和卵磷脂。SOD可抑制這3部分重建的系統(tǒng)，并且其中NADPH 和還原酶部分可被另一產(chǎn)生超氧陰離子（O2-.）的系統(tǒng)所代替，說明反應(yīng)中有O2-.參加。實(shí)際上連接于細(xì)胞色素P450上的O2-.是真正起羥化作用的物質(zhì)。,18,自由基的有益作用,參與膠原蛋白合成。Myllyla等（1978）報(bào)道膠原蛋白的前體為原膠原蛋（procollagen），在膠原蛋白的生物合成中，原膠原蛋白轉(zhuǎn)變成膠原蛋白的關(guān)鍵步驟是：原膠原蛋白的脯氨酸和賴氨酸經(jīng)脯氨酸羧化酶和賴氨酸羧化酶的羧化作用，而羧化作用需要超氧陰離子自由基、羧自由基、H2O2或1O2的參與。 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，研究證實(shí)低濃度的活性氧如超氧陰離子自由基和H2O2可以促進(jìn)細(xì)胞的生長，是細(xì)胞維持生存和生長不可缺少的因子，若缺乏細(xì)胞將無法增殖，甚至死亡。Bravard A等運(yùn)用典型的非分化和分化細(xì)胞系研究了增殖與分化過程中抗氧化代謝的變化情況，結(jié)果顯示，SOD活性升高與分化密切相關(guān)，甚至可以看作分化的標(biāo)志。 環(huán)核苷酸的生物合成，鳥苷酸環(huán)化酶的環(huán)一磷酸鳥苷（cGMP）的生物合成也需要氧自由基的參與，并可被巰基化合物抑制。 一氧化氮、超氧陰離子、過氧化氫等活性氧在需氧生物體的神經(jīng)、內(nèi)分泌、循環(huán)、免疫等生理活動中作為信號傳導(dǎo)分子發(fā)揮著重要的作用，并且在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)等細(xì)胞生命活動中作為第二信使參與多種因子的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的啟動。大量的研究顯示：NO與機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)關(guān)系密切。MacCmiking等（1992）研究發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞均可產(chǎn)生NO，NO與免疫細(xì)胞生長調(diào)節(jié)密切相關(guān)。,19,自由基的有益作用,脂肪加氧化酶產(chǎn)物。血小板脂肪加氧化酶作用于它的天然底物花生四烯酸則形成12-氫過氧化-5,8,11,14-二十碳四烯酸（12-HPETE），該化合物不穩(wěn)定，很快地在體內(nèi)還原成12-羥衍生物（12-HETE）（皮膚中）、11-HETE（肺和肥大細(xì)胞中）、5-HETE、15-HETE和12-DHETE（兔和人白細(xì)胞中）。HPETE類化合物是一系列具有強(qiáng)生物學(xué)活性的白三烯類（1eukotri-enes，LT）的前體，它們能增加血管通透性和使支氣管肌肉收縮。在體外，15-HPETE和12-HPETE兩者都是環(huán)加氧酶中過氧化物酶的底物，并能導(dǎo)致氧化性自由基[0]X-的形成。 生殖和胚胎發(fā)育。Nissen等（1983）認(rèn)為海膽卵的受精作用與活性氧有關(guān)，當(dāng)受精作用進(jìn)行時就會誘導(dǎo)氧消耗的突發(fā)并在卵的表面立即形成一層受精膜，該膜含有交聯(lián)的酪氨酸殘基。膜的形成可阻止更多的精子進(jìn)入，交聯(lián)是由存在于卵中的卵過氧化物酶催化完成的。大部分額外吸收的氧被用來產(chǎn)生上述反應(yīng)所需的過氧化氫。并且發(fā)現(xiàn)人的精液具有SOD活性，它與精子的活動能力有直接關(guān)系。Holland等（1982）發(fā)現(xiàn)兔精子能自發(fā)地產(chǎn)生O2-. 并進(jìn)行脂類過氧化，所以SOD對精子起保護(hù)作用。胚胎在子宮內(nèi)的環(huán)境也許是缺氧的，因?yàn)樵谶@個階段還沒有發(fā)生能抵御高濃度O2的系統(tǒng)。在妊娠的晚期才見到抗氧化酶類水平的提高。妊娠時胎盤的SOD、CAT和過氧化物酶的活性也持續(xù)升高，這有力地保護(hù)了胎盤。,20,抗氧化系統(tǒng)-酶類與非酶類抗氧化劑,酶類包括有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathione Stransferase,GST)等等。 非酶類抗氧化劑主要提供還原當(dāng)量的各種脂溶性、水溶性化合物,主要包括有谷胱甘肽(glutathione,GSH)、硫氧還蛋白(Thioredoxin,TRX)、胡蘿卜素以及維生素C與E。,21,,維生素C(VC)、維生素E(VE)、輔酶Q10 (CoQ10)、硫辛酸(LP)和谷胱甘肽(GSH)這五種主要的抗氧化劑之間存在著動態(tài)的相互作用。這些就是網(wǎng)絡(luò)抗氧化劑。 這些特殊的抗氧化劑共同作用，支撐并加強(qiáng)整個抗氧化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。當(dāng)它們聯(lián)合作用時，可以顯著提高彼此活性，有助于機(jī)體保持良好的抗氧化平衡狀態(tài)。網(wǎng)絡(luò)抗氧化劑各自有著獨(dú)特作用，不能相互替代。網(wǎng)絡(luò)抗氧化劑所具有的獨(dú)特能力，在于淬滅自由基后它們在能夠互相“循環(huán)”或“再生”，因而極大地?cái)U(kuò)展了它們的抗氧化效力 細(xì)胞膜主要是由脂肪和脂質(zhì)組成，但細(xì)胞內(nèi)卻充滿了水。脂溶性的VE和CoQ10可以保護(hù)細(xì)胞膜的脂相部分免受自由基的進(jìn)攻。但卻不要指望它們保護(hù)主要由水組成的細(xì)胞水相部分或者血液。這些區(qū)域只能有水溶性抗氧化劑如Vc和GSH等易于到達(dá)發(fā)揮作用。 只有一種抗氧化劑既可在水相也可在脂相中作用，這就是LP。只有LP能在兩種區(qū)域中發(fā)揮作用，同時，既可再生水溶性抗氧化劑（Vc和GSH），也可再生脂溶性抗氧化劑（VE）。,22,,一個物質(zhì)的氧化必伴有另一物質(zhì)的還原，過多地偏離平衡態(tài)的氧化或還原性物質(zhì)終會促進(jìn)別的物質(zhì)被氧化或被還原，而自身則被還原或被氧化。在GSH/GSSH這對細(xì)胞中主要的氧化還原緩沖對中，GSH可清除活性氧，維持生物大分子的巰基活性中心，GSH被氧化為GSSG后，在GSSG還原酶的催化下可被重新還原為GSH，遂可重復(fù)利用[12]。又如蛋白質(zhì)分子中的巰基(-SH)保持還原態(tài)是許多蛋白質(zhì)分子活性的必備條件;但同時，許多蛋白質(zhì)分子的鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵(-S-S)又是維持其構(gòu)型的必需結(jié)構(gòu)，對其活性同樣必不可少[13]。蛋白質(zhì)氧化還原機(jī)制包括還原形成二硫鍵的二巰基機(jī)制，以及形成混合谷胱甘肽二硫化物的單巰基機(jī)制[14～16]。通過巰基(-SH)和二硫鍵(-S-S-)形式的轉(zhuǎn)換，使蛋白質(zhì)改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)功能的調(diào)控[17]。由此可見，氧化和還原還必須有一個精細(xì)的平衡，氧化與還原處于一個對立的有機(jī)體中，沒有還原就沒有氧化，沒有氧化也就無所謂還原，只有這樣才能維持機(jī)體的健康。,23,,而機(jī)體氧化還原態(tài)平衡本身就是人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的內(nèi)容之一。人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，包括酸堿平衡，水、電解質(zhì)，體溫的相對恒定等以外，還包括了氧化還原態(tài)平衡。機(jī)體從外界攝入體內(nèi)的各種物質(zhì)，都必須經(jīng)過消化吸收才能被人體所利用。但是，人體并非直接利用這些物質(zhì)，而是通過一系列復(fù)雜的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化，才能利用它們。 比如紅細(xì)胞的主要成分之一鐵離子，就必須是亞鐵離子(Fe2+)才能參與紅細(xì)胞的構(gòu)成，而鐵離子(Fe3+)是不能參與紅細(xì)胞構(gòu)成的。但是，機(jī)體從外界獲取的大多數(shù)都是Fe3+，這就要求Fe3+必須參與氧化還原反應(yīng)，通過被氧化，還原成亞Fe2+從而合成足夠多的紅細(xì)胞。因此，就必須保證鐵離子(Fe3+)和亞鐵離子(Fe2+)之間質(zhì)和量的平衡，保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)，不然就會出現(xiàn)貧血。反之，如果氧化還原態(tài)失去平衡，那么內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)也會遭到破壞。,24,