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. 離子交換層析介質(zhì)的應(yīng)用 離子交換層析分離純化生物大分子的過程，主要是利用各種分子的可離解性、離子的凈電荷、表面電荷分布的電性差異而進(jìn)行選擇分離的?，F(xiàn)已成為分離純化生化制品、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)中使用最頻繁的純化技術(shù)之一。 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography 簡(jiǎn)稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換層析是目前生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。 1.離子交換層析的基本原理： 離子交換層析是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換層析介質(zhì)中可交換離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化的方法，也可以認(rèn)為是蛋白質(zhì)分子中帶電的氨基酸與帶相反電荷的介質(zhì)的骨架相互作用而達(dá)到分離純化的方法。 離子交換層析法主要依賴電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異而進(jìn)行分離，具有較高的分離容量。幾乎所有的生物大分子都是極性的，都可使其帶電，所以離子交換層析法已廣泛用于生物大分子的分離、中等純化及精制的各個(gè)步驟中。 由于離子交換層析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域成為獨(dú)立的操作單元，也已成為蛋白質(zhì)、多肽、核酸及大部分發(fā)酵產(chǎn)物分離純化的一種重要的方法。目前，在生化分離中約有75%的工藝采用離子交換層析法。 2.離子交換層析介質(zhì)： 離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。在一定條件下，溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團(tuán)結(jié)合到固定相上，而平衡離子則進(jìn)入流動(dòng)相，這就是離子交換層析的基本置換反應(yīng)。通過在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對(duì)溶液中不同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。下面以陰離子交換劑為例簡(jiǎn)單介紹離子交換層析的基本分離過程。 陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，裝柱平衡后，與緩沖溶液中的帶負(fù)電的平衡離子結(jié)合。待分離溶液中可能有正電基團(tuán)、負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)。加樣后，負(fù)電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交換劑上。而正電基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交換劑結(jié)合，隨流動(dòng)相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)進(jìn)行交換，而將各種負(fù)電基團(tuán)置換出來，隨洗脫液流出。與離子交換劑結(jié)合力小的負(fù)電基團(tuán)先被置換出來，而與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的需要較高的離子強(qiáng)度才能被置換出來，這樣各種負(fù)電基團(tuán)就會(huì)按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，從而達(dá)到分離目的。 各種離子與離子交換劑上的電荷基團(tuán)的結(jié)合是由靜電力產(chǎn)生的，是一個(gè)可逆的過程。結(jié)合的強(qiáng)度與很多因素有關(guān)，包括離子交換劑的性質(zhì)、離子本身的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結(jié)合力的差異，并通過改變離子強(qiáng)度、pH 等條件改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力而達(dá)到分離的目的。離子交換劑的電荷基團(tuán)對(duì)不同的離子有不同的結(jié)合力。一般來講，離子價(jià)數(shù)越高，結(jié)合力越大；價(jià)數(shù)相同時(shí)，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越大。如陽離子交換劑對(duì)離子的結(jié)合力順序?yàn)椋? Li+＜Na+＜ K+＜ Rb+＜ Cs+； Na+＜ Ca2+＜ Al3+＜ Ti4+ 蛋白質(zhì)等生物大分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結(jié)合與它們的性質(zhì)及pH 有較大關(guān)系。以用陽離子交換劑分離蛋白質(zhì)為例，在一定的pH 條件下，等電點(diǎn)pI < pH 的蛋白帶負(fù)電，不能與陽離子交換劑結(jié)合；等電點(diǎn)pI > pH 的蛋白帶正電，能與陽離子交換劑結(jié)合，一般pI 越大的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。但由于生物樣品的復(fù)雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結(jié)合情況較難估計(jì)，往往要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。 3.離子交換層析介質(zhì)的種類和性質(zhì)： 3.1離子交換劑的基質(zhì)： 離子交換劑的大分子聚合物基質(zhì)可以由多種材料制成，苯乙烯系離子交換劑是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯為基質(zhì)。苯乙烯系離子交換劑機(jī)械強(qiáng)度大、流速快。但它與水的親和力較小，具有較強(qiáng)的疏水性，容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機(jī)離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素、球狀纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質(zhì)的離子交換劑都與水有較強(qiáng)的親和力，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。 3.2離子交換劑的電荷基團(tuán)： 根據(jù)與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)的性質(zhì)，可以將離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，可以交換陽離子物質(zhì)。根據(jù)電荷基團(tuán)的解離度不同，又可以分為強(qiáng)酸型、中等酸型和弱酸型三類。它們的區(qū)別在于它們電荷基團(tuán)完全解離的pH 范圍，強(qiáng)酸型離子交換劑在較大的pH 范圍內(nèi)電荷基團(tuán)完全解離，而弱酸型完全解離的pH 范圍則較小，如羧甲基在pH小于6時(shí)就失去了交換能力。一般結(jié)合磺酸基團(tuán)，如磺酸甲基、磺酸乙基等為強(qiáng)酸型離子交換劑，結(jié)合磷酸基團(tuán)和亞磷酸基團(tuán)為中等酸型離子交換劑，結(jié)合酚羥基或羧基，如羧甲基為弱酸型離子交換劑。一般來講強(qiáng)酸型離子交換劑對(duì)H 離子的結(jié)合力比Na+離子小，弱酸型離子交換劑對(duì)H 離子的結(jié)合力比Na+離子大。 陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，可以交換陰離子物質(zhì)。同樣根據(jù)電荷基團(tuán)的解離度不同，可以分為強(qiáng)堿型、中等堿型和弱堿型三類。一般結(jié)合季胺基團(tuán)，如季胺乙基為強(qiáng)堿型離子交換劑，結(jié)合叔胺、仲胺、伯胺等為中等或弱堿型離子交換劑，如結(jié)合二乙基氨基乙基為弱堿型離子交換劑。一般來講強(qiáng)堿型離子交換劑對(duì)OH-離子的結(jié)合力比Cl-離子小，弱酸型離子交換劑對(duì)OH-離子的結(jié)合力比Cl-離子大。 3.3交換容量： 交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力。通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱為總交換容量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中關(guān)心的是層析柱與樣品中各個(gè)待分離組分進(jìn)行交換時(shí)的交換容量，它不僅與所用的離子交換劑有關(guān)，還與實(shí)驗(yàn)條件有很大的關(guān)系，一般又稱為有效交換容量。后面提到的交換容量如未經(jīng)說明都是指有效交換容量。 影響交換容量的因素很多，主要可以分為兩個(gè)方面，一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進(jìn)行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當(dāng)然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應(yīng)盡量能夠讓樣品組分進(jìn)入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因?yàn)樾》肿涌梢宰杂傻倪M(jìn)入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。對(duì)于較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因?yàn)閷?duì)于很大的分子，一般不能進(jìn)入孔隙內(nèi)部，交換只限于顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑表面積大。 另一些影響因素如實(shí)驗(yàn)中的離子強(qiáng)度、pH 值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般pH 對(duì)弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對(duì)于弱酸型離子交換劑在pH 較高時(shí)，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH 時(shí)，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量小。同時(shí)pH 也影響樣品組分的帶電性。尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在離子交換層析中要選擇合適的pH 以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結(jié)合。一般來說，離子強(qiáng)度增大，交換容量下降。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要降低交換容量以將結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)（mmol/g或mmol/mL）來表示。通?？梢杂傻味ǚy(cè)定。陽離子交換劑首先用HCl 處理，使其平衡離子為H+。再用水洗至中性，對(duì)于強(qiáng)酸型離子交換劑，用NaCl 充分置換出H+，再用標(biāo)準(zhǔn)濃度的NaOH 滴定生成的HCl，就可以計(jì)算出離子交換劑的交換容量；對(duì)于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將H+充分置換出來，再用酸滴定，計(jì)算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測(cè)定。 對(duì)于一些常用于蛋白質(zhì)分離的離子交換劑也通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質(zhì)的量來表示，一般這種表示方法對(duì)于分離蛋白質(zhì)等生物大分子具有更大的參考價(jià)值。實(shí)驗(yàn)前可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹了解各種離子交換劑的交換容量。 1.離子交換劑的選擇 在進(jìn)行分離純化時(shí)，要求層析柱具有高負(fù)載量、易于操作及使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，其中分離介質(zhì)是最主要的影響因素，因此，分離介質(zhì)的選擇尤為重要。 1.1品種的選擇： 應(yīng)根據(jù)被分離純化目標(biāo)產(chǎn)物所帶電荷的種類、分子的大小、物理化學(xué)性質(zhì)及所處的微環(huán)境等因素，選擇適宜的離子交換層析介質(zhì)。對(duì)于無機(jī)小分子而言，分離介質(zhì)的選擇相對(duì)容易，但對(duì)于生物大分子就必須考慮更多的因素。 蛋白質(zhì)等生物大分子是由多種氨基酸所組成的，在不同的pH條件下顯示不同的電性，而生物大分子對(duì)最適宜的pH環(huán)境具有特定的要求，因此，必須首先了解目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)及適宜的微環(huán)境，根據(jù)這些條件選擇合適的離子交換劑種類。 是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑，主要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH 下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點(diǎn)為4，穩(wěn)定的pH 范圍為6~9，由于這時(shí)蛋白帶負(fù)電，故應(yīng)選擇陰離子交換劑進(jìn)行分離。 1.2骨架的選擇： 應(yīng)根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量、要求達(dá)到的純度及經(jīng)濟(jì)價(jià)值等因素，選擇合適骨架（基質(zhì)）的離子交換劑。 通用型的聚苯乙烯離子交換樹脂具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、全交換容量高等特點(diǎn)，適用于如抗生素、有機(jī)酸、動(dòng)物資源或植物資源的有效成分等一般生化制品的提取分離工藝。而對(duì)于要求分辨率高、制品純度高的一些高附加值的基因工程產(chǎn)品，仍需使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質(zhì)的生化分離專用介質(zhì)。 纖維素離子交換劑價(jià)格較低，但分辨率和穩(wěn)定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價(jià)格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強(qiáng)度和pH 變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機(jī)械穩(wěn)定性較好，分辨率也較高，但價(jià)格較貴。 理想的分離介質(zhì)應(yīng)該不但易于吸附，還要易于洗脫，如果目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)于離子強(qiáng)度和pH值的變化不敏感，可以考慮采用高電荷密度的強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的強(qiáng)型介質(zhì)。如果對(duì)這些因素比較敏感，則應(yīng)采用弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)。如果大分子物質(zhì)被吸附后，結(jié)合比較牢固，往往難以洗脫，采用苛刻的條件又容易引起大分子的變性，則應(yīng)選用功能基團(tuán)密度低的介質(zhì)。 強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的強(qiáng)型介質(zhì)，適用的pH 范圍廣，常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH 下的分離，但由于電性較強(qiáng)，有時(shí)易使一些敏感的生物分子變性或失活。弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)，其選擇性有較大的范圍，且不易使蛋白質(zhì)失活，故一般適用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，但其適用的pH范圍較窄。 1.3粒徑的選擇： 分離介質(zhì)粒徑的大小對(duì)離子交換層析柱的分辨率和流速有明顯的影響。一般來說分離介質(zhì)的粒徑小，分辨率高，但平衡離子的平衡時(shí)間長(zhǎng)，流速慢；粒徑大則柱的流速較快，壓降小，但分辨率低，負(fù)載量也較小。所以大顆粒的分離介質(zhì)適合于對(duì)分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離，而小顆粒的分離介質(zhì)適合于需要高分辨率的精細(xì)分離或產(chǎn)品的精制階段。 2.操作中注意事項(xiàng) 2.1預(yù)處理： 在離子交換劑的工業(yè)產(chǎn)品中，常含有少量的有機(jī)低聚物及一些無機(jī)雜質(zhì)，在使用初期會(huì)逐漸溶解釋放，影響目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，工業(yè)級(jí)離子交換劑在使用前必須進(jìn)行預(yù)處理。 通用型的離子交換樹脂通常使用酸、堿進(jìn)行處理，可采用1~2 mol/L的鹽酸及氫氧化鈉溶液，以4~6倍樹脂床體積交替進(jìn)行處理，在酸及堿處理之間須用去離子水洗至中性。對(duì)于大孔型的樹脂，還需要用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行處理，以除去生產(chǎn)過程中所用的有機(jī)物殘余物。對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，不但能提高其工作容量，更可提高被分離產(chǎn)品的純度。經(jīng)預(yù)處理后的樹脂，最后應(yīng)轉(zhuǎn)為分離過程中適用的離子型態(tài)。 對(duì)于生化專用的離子交換劑，以多糖類骨架為主的介質(zhì)，一般貯存在20%的乙醇中。為了分離介質(zhì)在分離過程中盡量減少pH值的變化，需要用大量的去離子水進(jìn)行清洗，然后用緩沖液進(jìn)行平衡。 分離介質(zhì)的預(yù)處理可以在柱內(nèi)進(jìn)行，也可以在燒杯等容器中進(jìn)行。在柱內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，或溶液體系改變及操作溫度變化時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)氣泡，尤其在使用內(nèi)徑較小的柱時(shí)。氣泡一經(jīng)出現(xiàn)，必須及時(shí)清除，否則對(duì)層析工藝有明顯的影響。 2.2緩沖液平衡介質(zhì)： pH值是離子交換層析的操作中的一個(gè)重要因素，而pH的穩(wěn)定及改變通常是用緩沖液來實(shí)現(xiàn)的，所以緩沖液的選擇是影響分離效果的重要因素。 在選擇緩沖液時(shí)，pH和離子強(qiáng)度是兩個(gè)關(guān)鍵性的因素，它不僅影響到分離介質(zhì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離效果，而且還影響到產(chǎn)品的收率。選用的pH值取決于目標(biāo)產(chǎn)物的等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和溶解度，不但要使被分離的物質(zhì)成為可以進(jìn)行交換的離子，還要維持其較高的活性。同時(shí)也應(yīng)該考慮到離子交換劑的pK值。 由于緩沖液本身帶電，所以也會(huì)與離子交換層析介質(zhì)結(jié)合。這種結(jié)合將帶來兩方面的干擾，一方面降低緩沖液的濃度，進(jìn)而降低了緩沖能力；另一方面是與分離介質(zhì)進(jìn)行交換，從而與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)介質(zhì)的交換容量。因此，在使用陰離子交換層析介質(zhì)時(shí)，要避免采用磷酸鹽之類的帶負(fù)電的緩沖液，在使用陽離子交換層析介質(zhì)時(shí)，則要避免采用Tris之類的帶正電的緩沖液。由于分離介質(zhì)的種類不同，起始過程也略有不同，在通常情況下，使用陰離子交換層析介質(zhì)時(shí)，起始緩沖液要高于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5 ~ 1 pH值；使用陽離子交換層析介質(zhì)時(shí)，則起始緩沖液要低于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5 ~ 1 pH值。 2.3層析柱的操作： 2.3.1操作方式： 由于生化分離的樣品、緩沖液和洗脫液都是流動(dòng)相，可在流經(jīng)柱時(shí)進(jìn)行分離，因此，離子交換可以采用柱式操作，以層析形式進(jìn)行分離。在分離過程中，未被吸附的物質(zhì)不斷流出反應(yīng)體系，使平衡不斷右移，是一種動(dòng)態(tài)平衡，所以也稱為動(dòng)態(tài)操作。動(dòng)態(tài)操作方式分離效果好，適用于各類樣品，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。在層析分離的操作中，層析柱的裝填情況對(duì)分離有一定的影響，介質(zhì)在柱內(nèi)要分布均勻，尤其不允許氣泡的存在，也應(yīng)防止介質(zhì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象。 對(duì)于一些粘度較大的樣品，進(jìn)行初步提取分離時(shí)，也可以采用“靜態(tài)”處理方法，經(jīng)離子交換劑與需處理的工作液在反應(yīng)容器中進(jìn)行攪拌，當(dāng)達(dá)到吸附平衡后，將介質(zhì)與殘液分離，裝入柱中進(jìn)行洗脫。這種靜態(tài)分批操作的方法，工藝設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，如肝素鈉等一些天然產(chǎn)物的初步分離，往往采用這種靜態(tài)分離方式。在靜態(tài)分離方式的操作中，應(yīng)適當(dāng)控制離子交換劑在工作液中的攪拌速度，若攪拌速度過快，剪切力過大，會(huì)造成離子交換顆粒的破碎，難以進(jìn)行過濾分離；但若攪拌速度過慢，則影響介質(zhì)與工作液的接觸，也影響交換速率。 2.3.2柱式操作的種類： 固定床分離：在柱式操作中，料液作為流動(dòng)相，在柱內(nèi)自上而下地流動(dòng)，在流動(dòng)的過程中進(jìn)行吸附。為了得到較好的分離效果，對(duì)分離柱有三點(diǎn)最基本的要求：分離柱底部要有孔徑分布均勻的篩板，以防止流動(dòng)相產(chǎn)生偏流；分離柱支持層下端的死角體積要盡量地小，以防止分離過程中色譜帶混合或擴(kuò)展；無論大小，分離柱都必須保持垂直。在固定床操作中，可以進(jìn)行正向洗脫，也可以進(jìn)行逆向洗脫，一般情況下，逆向洗脫或再生可獲得較好的效果，但對(duì)操作有較為嚴(yán)格的要求。 流態(tài)床：流動(dòng)的料液從柱的下端流入，從上端流出，分離介質(zhì)在柱內(nèi)呈流態(tài)狀。此種分離方法對(duì)操作有嚴(yán)格的要求，一般較少應(yīng)用，洗脫方式以采用正向洗脫為好。 2.3.3工作液對(duì)分離效果的影響： 為了使生化分離達(dá)到高分辨率及高負(fù)載量，工作液的制備及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影響離子交換劑的分離效果，還影響到分離介質(zhì)的使用壽命。生化分離往往是一個(gè)比較復(fù)雜的體系，其中有多種雜質(zhì)存在，不但有簡(jiǎn)單的小分子，還有一些膠體物質(zhì)、脂類物質(zhì)等，尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆蓋了介質(zhì)的功能基團(tuán)，或堵塞了介質(zhì)的孔道，造成不可逆污染，縮短分離介質(zhì)的使用壽命。因此，在分離操作前，應(yīng)盡量將工作液進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以確保分離的效果。 在生化分離純化過程中，由于淋洗過程帶走了一些目標(biāo)產(chǎn)物，或因洗脫不完全而使目標(biāo)產(chǎn)物滯留在介質(zhì)上，造成產(chǎn)物的損失，是影響產(chǎn)品收率的重要因素，同時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化引起失活，也將影響活化收率。在離子交換過程中加入一些穩(wěn)定劑或保護(hù)劑，不但可以提高收率，還可提高分離介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性。 2.3.4流速對(duì)分離效果的影響： 離子交換層析分離中，流速是影響分離效果的一個(gè)重要因素。為了獲取優(yōu)良的分離效果，應(yīng)根據(jù)離子交換劑的種類、粒徑、工作液中有效成分的分子結(jié)構(gòu)等因素，進(jìn)行試驗(yàn)，以確立較佳的試驗(yàn)參數(shù)。若目標(biāo)產(chǎn)物的分子量相對(duì)比較小，且介質(zhì)的孔徑比較大時(shí)，因?yàn)橛欣趥髻|(zhì)作用，可采用較高的流速。而對(duì)于目標(biāo)產(chǎn)物為生物大分子，且介質(zhì)的孔徑相對(duì)于被分離物質(zhì)分子較小時(shí)，由于分子的擴(kuò)散速率較慢，則宜采用較慢的流速。在工作液的粘度較大時(shí)，因傳質(zhì)速率較低，也應(yīng)采用較低的流速。 流速不但影響交換吸附的效果，也影響洗脫的效果，通常情況下，洗脫時(shí)的流速要比交換吸附時(shí)慢些。 2.4介質(zhì)的洗脫、再生方式： 當(dāng)離子交換劑失效后，應(yīng)進(jìn)行洗脫，其基本原理是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子或基團(tuán)，把交換吸附到介質(zhì)顆粒外表面和內(nèi)部的目標(biāo)產(chǎn)物解吸下來。吸著物不同，其活潑性不同，因此，應(yīng)選擇合適的洗脫劑，將蛋白質(zhì)從介質(zhì)上洗脫下來，收集分離純化的產(chǎn)物。 離子交換層析大致有三種洗脫方式： 一種為同步洗脫。洗脫劑是同一種物質(zhì)，可采用稀的酸、堿或鹽類溶液，也可選用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑，其中以鹽溶液為主，依據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)及最終得到產(chǎn)物的劑型進(jìn)行選擇。由于被吸著的物質(zhì)往往不是單一的品種，各種物質(zhì)所帶的電荷電量不同，與介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度不同，即使使用同一種洗脫劑，容易被替換的物質(zhì)先脫離介質(zhì)流出，結(jié)合力較強(qiáng)的物質(zhì)后流出，只要通過分級(jí)收集，就可以把各種物質(zhì)分離，得到較純凈的產(chǎn)物。這種方法多用于對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的性能了解很清楚時(shí)的分離，或用于分析類的分離。 第二種為分步洗脫，即分別用不同濃度的鹽溶液進(jìn)行洗脫。分離介質(zhì)在交換吸附過程中，會(huì)有多種蛋白質(zhì)被吸附，如果采用一個(gè)恒定的洗脫條件，有時(shí)不能將所有的組分適當(dāng)?shù)胤珠_，需要改變洗脫條件?？梢允请A段式的改變，即選用不同的洗脫劑或不同pH值的洗脫劑分階段進(jìn)行洗脫，可以根據(jù)洗脫液不同的濃度、不同的酸度得到不同的洗脫峰。即一種鹽濃度可以得到一種目標(biāo)蛋白，不同的鹽濃度可以得到不同的目標(biāo)蛋白。這種分步洗脫的方式，適用于已知性質(zhì)蛋白的分離，尤其適用于規(guī)模生產(chǎn)中，操作方便，易于控制。 第三種為連續(xù)的梯度洗脫，即按一定的線性變化改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH值（一般只在特殊情況下使用改變pH值的洗脫方式），在洗脫劑漸變的過程中，將不同的蛋白質(zhì)逐一置換，可得到各種不同的蛋白組分，同時(shí)，蛋白質(zhì)一般不拖尾。梯度洗脫是離子交換層析中最常用的洗脫方式，也是洗脫能力相對(duì)最強(qiáng)的洗脫方式，適合于對(duì)電荷性質(zhì)相近組分的洗脫。 在洗脫過程中，順流洗脫或逆流洗脫均可采用，順流洗脫也稱為正向洗脫，即洗脫液的流動(dòng)方向與工作液的流動(dòng)方向相同，逆流洗脫也稱為反向洗脫，即洗脫液的流動(dòng)方向與工作液的流動(dòng)方向相反。若料液是自上而下正向通過交換柱進(jìn)行交換吸附的，則交換柱上層吸附物的濃度要比下層高，洗脫液自下而上反向解吸可以更高效地達(dá)到洗脫的目的。但由于逆向洗脫的操作要比正向洗脫復(fù)雜得多，故目前多以正向洗脫為主。 洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離的效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說，慢速洗脫的分辨率要比快速洗脫好，但洗脫速度過慢，會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)，樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中于某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率。如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則應(yīng)適當(dāng)提高洗脫速度。 2.5介質(zhì)的消毒： 在某些純度要求較高的生化產(chǎn)品制備過程中，往往要求對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行消毒處理，以防止微生物等雜質(zhì)混入目標(biāo)產(chǎn)品中。 采用高溫消毒是最常用的方法，目前大多數(shù)離子交換劑具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性能，均可進(jìn)行高溫消毒處理。但在使用多糖類介質(zhì)時(shí)，必須注意，介質(zhì)一定要處于鹽型，而且要在中性條件下才能進(jìn)行高溫消毒處理，否則將會(huì)導(dǎo)致多糖大分子骨架的降解，嚴(yán)重影響介質(zhì)的使用壽命。 NaOH也是一種很好的消毒劑，但要根據(jù)介質(zhì)的耐堿程度和微生物污染的種類、污染程度選用合適濃度的NaOH。這種消毒方法也可以采用柱內(nèi)浸泡法，即將一定濃度的NaOH通入柱中，關(guān)閉出液閥，浸泡幾個(gè)小時(shí)后，可達(dá)到消毒的目的。NaOH如果與乙醇合用，可以得到更佳的效果。用NaOH消毒還可將消毒和在位清洗合并處理。 2.6介質(zhì)的“復(fù)蘇”： 在生化分離過程中，由于分離體系較為復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)，因此在使用過程中常出現(xiàn)樹脂的“中毒”現(xiàn)象。中毒原因可能是由于大分子的多點(diǎn)帶電，與介質(zhì)進(jìn)行多點(diǎn)結(jié)合，致使難以洗脫，使介質(zhì)的有效功能基團(tuán)減少。也可能是一些較大的分子被“卡牢”在孔道內(nèi)，難以擴(kuò)散出來，堵塞了孔道，在以后的交換過程中影響到顆粒內(nèi)功能基團(tuán)的有效工作。除生物大分子外，色素及腐殖酸等都可使介質(zhì)中毒。有時(shí)工作液中的膠狀物質(zhì)被粘附于介質(zhì)顆粒的內(nèi)外表面，覆蓋了功能基團(tuán)，這也是影響介質(zhì)工作容量的重要因素。 由于上述原因，離子交換層析介質(zhì)在使用一段時(shí)間后，可能出現(xiàn)顏色變深、床體收縮、分辨率下降、蛋白質(zhì)收率降低、反壓升高等現(xiàn)象。此時(shí)，需要對(duì)介質(zhì)進(jìn)行凈化處理。對(duì)于介質(zhì)用量比較大，自動(dòng)化程度比較高的規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)采用在原交換柱內(nèi)進(jìn)行，即“在位清洗”。先從交換柱的下面通過適量的清水，目的是去除交換柱中的懸浮物，并將床體疏松，還可以將結(jié)塊的介質(zhì)分散，有利于以后介質(zhì)與清洗液的接觸。對(duì)于一般的污染，采用逆流清洗，可減少污染物對(duì)下層介質(zhì)的污染。應(yīng)根據(jù)介質(zhì)種類及污染程度的不同，分別選用不同種類的清洗劑及不同的清洗步驟。一般的介質(zhì)是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分階段清洗或浸泡，各試劑交替之間須用去離子水洗至中性。若經(jīng)過上述處理后仍無明顯改善，尤其是流速無明顯提高，則要檢查交換柱布水器的紗網(wǎng)是否出現(xiàn)堵塞。 上述過程即為通常所說的“復(fù)蘇”過程。不同的介質(zhì)應(yīng)選用不同的復(fù)蘇方法，主要取決于介質(zhì)的物理化學(xué)性能及污染物質(zhì)的性質(zhì)。對(duì)于多糖類的離子交換劑，每當(dāng)使用一段時(shí)間后，可采用離子濃度較大的緩沖液通過交換柱或浸泡介質(zhì)，因?yàn)榫彌_液的離子強(qiáng)度較大時(shí)，有利于蛋白質(zhì)大分子脫離介質(zhì)，達(dá)到復(fù)蘇的效果。對(duì)于物化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的介質(zhì)，也可使用NaCl溶液通過交換柱或浸泡介質(zhì)。對(duì)于物化結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的介質(zhì)，可用30℃~40℃的乙醇或丙酮進(jìn)行洗脫或浸泡，在高溫下可使吸附在介質(zhì)上的蛋白變性或加快擴(kuò)散速度，也有利于膠體物質(zhì)的破壞，從而使污染物脫離介質(zhì)。還可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl，更有利于介質(zhì)的復(fù)蘇。 清除沉淀蛋白、脂類、疏水性的蛋白及脂蛋白，處理步驟更為復(fù)雜。可采用100%的異丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的鹽酸胍、陽離子或非離子洗滌劑等作為處理液。在用過這些清洗劑后，都要用至少2倍體積的蒸餾水進(jìn)行清洗。使用有機(jī)溶劑后，交換柱要采用鋸齒形的梯度洗滌進(jìn)行清洗，即可以在5倍床體積內(nèi)，使溶劑的含量從0增至100%，然后在下一個(gè)5倍床體積中，使溶劑的含量從100%降到0。 如果經(jīng)過上述處理，交換柱的工作情況仍沒有恢復(fù)，可以使用蛋白水解酶，將仍滯留在介質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，使其脫離介質(zhì)?？梢圆捎煤?mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交換柱中，在室溫下浸泡過夜，或在37℃下浸泡一小時(shí)。根據(jù)污染物的情況，也可以采用DNA酶等其它的酶類。無論使用哪一種酶處理后，都要重復(fù)上述清除污染物的清洗步驟，把酶清洗干凈。 脂蛋白對(duì)分離介質(zhì)的污染比較嚴(yán)重，因?yàn)橹鞍准捌渌愇镔|(zhì)，很容易粘附在層析柱內(nèi)，最好在進(jìn)行分離工藝前先將其去除。推薦使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀劑，可去除高含量的脂蛋白。 2.6介質(zhì)的貯存： 各種分離介質(zhì)在使用后都要進(jìn)行清洗后再貯存，這對(duì)于多糖類分離介質(zhì)尤為重要。分離介質(zhì)在使用后，先用2個(gè)床體積的清水清洗，然后用2個(gè)床體積的20%的乙醇過柱。對(duì)于SP強(qiáng)酸性陽離子介質(zhì)，要用含有0.2mol/L乙酸鈉的20%乙醇溶液清洗，再用脫氣的乙醇-水溶液以較慢的流速清洗。經(jīng)過處理后，可在室溫下貯存，或在4~8℃下長(zhǎng)期存放。貯存過程中必須將層析柱全部封閉，以防止水分的揮發(fā)，造成干柱。暫時(shí)不用的介質(zhì)必須貯存在20%的乙醇溶液中。所有的離子交換分離介質(zhì)，都要在4℃~30℃的條件下貯存，并防止冷凍。 離子交換層析分離純化生物大分子的過程，主要是利用各種分子的可離解性、離子的凈電荷、表面電荷分布的電性差異而進(jìn)行選擇分離的?，F(xiàn)已成為分離純化生化制品、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)中使用最頻繁的純化技術(shù)之一。 1.離子交換劑的選擇 在進(jìn)行分離純化時(shí)，要求層析柱具有高負(fù)載量、易于操作及使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，其中分離介質(zhì)是最主要的影響因素，因此，分離介質(zhì)的選擇尤為重要。 1.1品種的選擇： 應(yīng)根據(jù)被分離純化目標(biāo)產(chǎn)物所帶電荷的種類、分子的大小、物理化學(xué)性質(zhì)及所處的微環(huán)境等因素，選擇適宜的離子交換層析介質(zhì)。對(duì)于無機(jī)小分子而言，分離介質(zhì)的選擇相對(duì)容易，但對(duì)于生物大分子就必須考慮更多的因素。 蛋白質(zhì)等生物大分子是由多種氨基酸所組成的，在不同的pH條件下顯示不同的電性，而生物大分子對(duì)最適宜的pH環(huán)境具有特定的要求，因此，必須首先了解目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)及適宜的微環(huán)境，根據(jù)這些條件選擇合適的離子交換劑種類。 是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑，主要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH 下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點(diǎn)為4，穩(wěn)定的pH 范圍為6~9，由于這時(shí)蛋白帶負(fù)電，故應(yīng)選擇陰離子交換劑進(jìn)行分離。 1.2骨架的選擇： 應(yīng)根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量、要求達(dá)到的純度及經(jīng)濟(jì)價(jià)值等因素，選擇合適骨架（基質(zhì)）的離子交換劑。 通用型的聚苯乙烯離子交換樹脂具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、全交換容量高等特點(diǎn)，適用于如抗生素、有機(jī)酸、動(dòng)物資源或植物資源的有效成分等一般生化制品的提取分離工藝。而對(duì)于要求分辨率高、制品純度高的一些高附加值的基因工程產(chǎn)品，仍需使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質(zhì)的生化分離專用介質(zhì)。 纖維素離子交換劑價(jià)格較低，但分辨率和穩(wěn)定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價(jià)格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強(qiáng)度和pH 變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機(jī)械穩(wěn)定性較好，分辨率也較高，但價(jià)格較貴。 理想的分離介質(zhì)應(yīng)該不但易于吸附，還要易于洗脫，如果目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)于離子強(qiáng)度和pH值的變化不敏感，可以考慮采用高電荷密度的強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的強(qiáng)型介質(zhì)。如果對(duì)這些因素比較敏感，則應(yīng)采用弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)。如果大分子物質(zhì)被吸附后，結(jié)合比較牢固，往往難以洗脫，采用苛刻的條件又容易引起大分子的變性，則應(yīng)選用功能基團(tuán)密度低的介質(zhì)。 強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的強(qiáng)型介質(zhì)，適用的pH 范圍廣，常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH 下的分離，但由于電性較強(qiáng)，有時(shí)易使一些敏感的生物分子變性或失活。弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)，其選擇性有較大的范圍，且不易使蛋白質(zhì)失活，故一般適用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，但其適用的pH范圍較窄。 1.3粒徑的選擇： 分離介質(zhì)粒徑的大小對(duì)離子交換層析柱的分辨率和流速有明顯的影響。一般來說分離介質(zhì)的粒徑小，分辨率高，但平衡離子的平衡時(shí)間長(zhǎng)，流速慢；粒徑大則柱的流速較快，壓降小，但分辨率低，負(fù)載量也較小。所以大顆粒的分離介質(zhì)適合于對(duì)分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離，而小顆粒的分離介質(zhì)適合于需要高分辨率的精細(xì)分離或產(chǎn)品的精制階段。 2.操作中注意事項(xiàng) 2.1預(yù)處理： 在離子交換劑的工業(yè)產(chǎn)品中，常含有少量的有機(jī)低聚物及一些無機(jī)雜質(zhì)，在使用初期會(huì)逐漸溶解釋放，影響目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，工業(yè)級(jí)離子交換劑在使用前必須進(jìn)行預(yù)處理。 通用型的離子交換樹脂通常使用酸、堿進(jìn)行處理，可采用1~2 mol/L的鹽酸及氫氧化鈉溶液，以4~6倍樹脂床體積交替進(jìn)行處理，在酸及堿處理之間須用去離子水洗至中性。對(duì)于大孔型的樹脂，還需要用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行處理，以除去生產(chǎn)過程中所用的有機(jī)物殘余物。對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，不但能提高其工作容量，更可提高被分離產(chǎn)品的純度。經(jīng)預(yù)處理后的樹脂，最后應(yīng)轉(zhuǎn)為分離過程中適用的離子型態(tài)。 對(duì)于生化專用的離子交換劑，以多糖類骨架為主的介質(zhì)，一般貯存在20%的乙醇中。為了分離介質(zhì)在分離過程中盡量減少pH值的變化，需要用大量的去離子水進(jìn)行清洗，然后用緩沖液進(jìn)行平衡。 分離介質(zhì)的預(yù)處理可以在柱內(nèi)進(jìn)行，也可以在燒杯等容器中進(jìn)行。在柱內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，或溶液體系改變及操作溫度變化時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)氣泡，尤其在使用內(nèi)徑較小的柱時(shí)。氣泡一經(jīng)出現(xiàn)，必須及時(shí)清除，否則對(duì)層析工藝有明顯的影響。 2.2緩沖液平衡介質(zhì)： pH值是離子交換層析的操作中的一個(gè)重要因素，而pH的穩(wěn)定及改變通常是用緩沖液來實(shí)現(xiàn)的，所以緩沖液的選擇是影響分離效果的重要因素。 在選擇緩沖液時(shí)，pH和離子強(qiáng)度是兩個(gè)關(guān)鍵性的因素，它不僅影響到分離介質(zhì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離效果，而且還影響到產(chǎn)品的收率。選用的pH值取決于目標(biāo)產(chǎn)物的等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和溶解度，不但要使被分離的物質(zhì)成為可以進(jìn)行交換的離子，還要維持其較高的活性。同時(shí)也應(yīng)該考慮到離子交換劑的pK值。 由于緩沖液本身帶電，所以也會(huì)與離子交換層析介質(zhì)結(jié)合。這種結(jié)合將帶來兩方面的干擾，一方面降低緩沖液的濃度，進(jìn)而降低了緩沖能力；另一方面是與分離介質(zhì)進(jìn)行交換，從而與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)介質(zhì)的交換容量。因此，在使用陰離子交換層析介質(zhì)時(shí)，要避免采用磷酸鹽之類的帶負(fù)電的緩沖液，在使用陽離子交換層析介質(zhì)時(shí)，則要避免采用Tris之類的帶正電的緩沖液。由于分離介質(zhì)的種類不同，起始過程也略有不同，在通常情況下，使用陰離子交換層析介質(zhì)時(shí)，起始緩沖液要高于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5 ~ 1 pH值；使用陽離子交換層析介質(zhì)時(shí)，則起始緩沖液要低于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5 ~ 1 pH值。 2.3層析柱的操作： 2.3.1操作方式： 由于生化分離的樣品、緩沖液和洗脫液都是流動(dòng)相，可在流經(jīng)柱時(shí)進(jìn)行分離，因此，離子交換可以采用柱式操作，以層析形式進(jìn)行分離。在分離過程中，未被吸附的物質(zhì)不斷流出反應(yīng)體系，使平衡不斷右移，是一種動(dòng)態(tài)平衡，所以也稱為動(dòng)態(tài)操作。動(dòng)態(tài)操作方式分離效果好，適用于各類樣品，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。在層析分離的操作中，層析柱的裝填情況對(duì)分離有一定的影響，介質(zhì)在柱內(nèi)要分布均勻，尤其不允許氣泡的存在，也應(yīng)防止介質(zhì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象。 對(duì)于一些粘度較大的樣品，進(jìn)行初步提取分離時(shí)，也可以采用“靜態(tài)”處理方法，經(jīng)離子交換劑與需處理的工作液在反應(yīng)容器中進(jìn)行攪拌，當(dāng)達(dá)到吸附平衡后，將介質(zhì)與殘液分離，裝入柱中進(jìn)行洗脫。這種靜態(tài)分批操作的方法，工藝設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，如肝素鈉等一些天然產(chǎn)物的初步分離，往往采用這種靜態(tài)分離方式。在靜態(tài)分離方式的操作中，應(yīng)適當(dāng)控制離子交換劑在工作液中的攪拌速度，若攪拌速度過快，剪切力過大，會(huì)造成離子交換顆粒的破碎，難以進(jìn)行過濾分離；但若攪拌速度過慢，則影響介質(zhì)與工作液的接觸，也影響交換速率。 2.3.2柱式操作的種類： 固定床分離：在柱式操作中，料液作為流動(dòng)相，在柱內(nèi)自上而下地流動(dòng)，在流動(dòng)的過程中進(jìn)行吸附。為了得到較好的分離效果，對(duì)分離柱有三點(diǎn)最基本的要求：分離柱底部要有孔徑分布均勻的篩板，以防止流動(dòng)相產(chǎn)生偏流；分離柱支持層下端的死角體積要盡量地小，以防止分離過程中色譜帶混合或擴(kuò)展；無論大小，分離柱都必須保持垂直。在固定床操作中，可以進(jìn)行正向洗脫，也可以進(jìn)行逆向洗脫，一般情況下，逆向洗脫或再生可獲得較好的效果，但對(duì)操作有較為嚴(yán)格的要求。 流態(tài)床：流動(dòng)的料液從柱的下端流入，從上端流出，分離介質(zhì)在柱內(nèi)呈流態(tài)狀。此種分離方法對(duì)操作有嚴(yán)格的要求，一般較少應(yīng)用，洗脫方式以采用正向洗脫為好。 2.3.3工作液對(duì)分離效果的影響： 為了使生化分離達(dá)到高分辨率及高負(fù)載量，工作液的制備及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影響離子交換劑的分離效果，還影響到分離介質(zhì)的使用壽命。生化分離往往是一個(gè)比較復(fù)雜的體系，其中有多種雜質(zhì)存在，不但有簡(jiǎn)單的小分子，還有一些膠體物質(zhì)、脂類物質(zhì)等，尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆蓋了介質(zhì)的功能基團(tuán)，或堵塞了介質(zhì)的孔道，造成不可逆污染，縮短分離介質(zhì)的使用壽命。因此，在分離操作前，應(yīng)盡量將工作液進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以確保分離的效果。 在生化分離純化過程中，由于淋洗過程帶走了一些目標(biāo)產(chǎn)物，或因洗脫不完全而使目標(biāo)產(chǎn)物滯留在介質(zhì)上，造成產(chǎn)物的損失，是影響產(chǎn)品收率的重要因素，同時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化引起失活，也將影響活化收率。在離子交換過程中加入一些穩(wěn)定劑或保護(hù)劑，不但可以提高收率，還可提高分離介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性。 2.3.4流速對(duì)分離效果的影響： 離子交換層析分離中，流速是影響分離效果的一個(gè)重要因素。為了獲取優(yōu)良的分離效果，應(yīng)根據(jù)離子交換劑的種類、粒徑、工作液中有效成分的分子結(jié)構(gòu)等因素，進(jìn)行試驗(yàn)，以確立較佳的試驗(yàn)參數(shù)。若目標(biāo)產(chǎn)物的分子量相對(duì)比較小，且介質(zhì)的孔徑比較大時(shí)，因?yàn)橛欣趥髻|(zhì)作用，可采用較高的流速。而對(duì)于目標(biāo)產(chǎn)物為生物大分子，且介質(zhì)的孔徑相對(duì)于被分離物質(zhì)分子較小時(shí)，由于分子的擴(kuò)散速率較慢，則宜采用較慢的流速。在工作液的粘度較大時(shí)，因傳質(zhì)速率較低，也應(yīng)采用較低的流速。 流速不但影響交換吸附的效果，也影響洗脫的效果，通常情況下，洗脫時(shí)的流速要比交換吸附時(shí)慢些。 2.4介質(zhì)的洗脫、再生方式： 當(dāng)離子交換劑失效后，應(yīng)進(jìn)行洗脫，其基本原理是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子或基團(tuán)，把交換吸附到介質(zhì)顆粒外表面和內(nèi)部的目標(biāo)產(chǎn)物解吸下來。吸著物不同，其活潑性不同，因此，應(yīng)選擇合適的洗脫劑，將蛋白質(zhì)從介質(zhì)上洗脫下來，收集分離純化的產(chǎn)物。 離子交換層析大致有三種洗脫方式： 一種為同步洗脫。洗脫劑是同一種物質(zhì)，可采用稀的酸、堿或鹽類溶液，也可選用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑，其中以鹽溶液為主，依據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)及最終得到產(chǎn)物的劑型進(jìn)行選擇。由于被吸著的物質(zhì)往往不是單一的品種，各種物質(zhì)所帶的電荷電量不同，與介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度不同，即使使用同一種洗脫劑，容易被替換的物質(zhì)先脫離介質(zhì)流出，結(jié)合力較強(qiáng)的物質(zhì)后流出，只要通過分級(jí)收集，就可以把各種物質(zhì)分離，得到較純凈的產(chǎn)物。這種方法多用于對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的性能了解很清楚時(shí)的分離，或用于分析類的分離。 第二種為分步洗脫，即分別用不同濃度的鹽溶液進(jìn)行洗脫。分離介質(zhì)在交換吸附過程中，會(huì)有多種蛋白質(zhì)被吸附，如果采用一個(gè)恒定的洗脫條件，有時(shí)不能將所有的組分適當(dāng)?shù)胤珠_，需要改變洗脫條件?？梢允请A段式的改變，即選用不同的洗脫劑或不同pH值的洗脫劑分階段進(jìn)行洗脫，可以根據(jù)洗脫液不同的濃度、不同的酸度得到不同的洗脫峰。即一種鹽濃度可以得到一種目標(biāo)蛋白，不同的鹽濃度可以得到不同的目標(biāo)蛋白。這種分步洗脫的方式，適用于已知性質(zhì)蛋白的分離，尤其適用于規(guī)模生產(chǎn)中，操作方便，易于控制。 第三種為連續(xù)的梯度洗脫，即按一定的線性變化改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH值（一般只在特殊情況下使用改變pH值的洗脫方式），在洗脫劑漸變的過程中，將不同的蛋白質(zhì)逐一置換，可得到各種不同的蛋白組分，同時(shí)，蛋白質(zhì)一般不拖尾。梯度洗脫是離子交換層析中最常用的洗脫方式，也是洗脫能力相對(duì)最強(qiáng)的洗脫方式，適合于對(duì)電荷性質(zhì)相近組分的洗脫。 在洗脫過程中，順流洗脫或逆流洗脫均可采用，順流洗脫也稱為正向洗脫，即洗脫液的流動(dòng)方向與工作液的流動(dòng)方向相同，逆流洗脫也稱為反向洗脫，即洗脫液的流動(dòng)方向與工作液的流動(dòng)方向相反。若料液是自上而下正向通過交換柱進(jìn)行交換吸附的，則交換柱上層吸附物的濃度要比下層高，洗脫液自下而上反向解吸可以更高效地達(dá)到洗脫的目的。但由于逆向洗脫的操作要比正向洗脫復(fù)雜得多，故目前多以正向洗脫為主。 洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離的效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說，慢速洗脫的分辨率要比快速洗脫好，但洗脫速度過慢，會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)，樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中于某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率。如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則應(yīng)適當(dāng)提高洗脫速度。 2.5介質(zhì)的消毒： 在某些純度要求較高的生化產(chǎn)品制備過程中，往往要求對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行消毒處理，以防止微生物等雜質(zhì)混入目標(biāo)產(chǎn)品中。 采用高溫消毒是最常用的方法，目前大多數(shù)離子交換劑具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性能，均可進(jìn)行高溫消毒處理。但在使用多糖類介質(zhì)時(shí)，必須注意，介質(zhì)一定要處于鹽型，而且要在中性條件下才能進(jìn)行高溫消毒處理，否則將會(huì)導(dǎo)致多糖大分子骨架的降解，嚴(yán)重影響介質(zhì)的使用壽命。 NaOH也是一種很好的消毒劑，但要根據(jù)介質(zhì)的耐堿程度和微生物污染的種類、污染程度選用合適濃度的NaOH。這種消毒方法也可以采用柱內(nèi)浸泡法，即將一定濃度的NaOH通入柱中，關(guān)閉出液閥，浸泡幾個(gè)小時(shí)后，可達(dá)到消毒的目的。NaOH如果與乙醇合用，可以得到更佳的效果。用NaOH消毒還可將消毒和在位清洗合并處理。 2.6介質(zhì)的“復(fù)蘇”： 在生化分離過程中，由于分離體系較為復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)，因此在使用過程中常出現(xiàn)樹脂的“中毒”現(xiàn)象。中毒原因可能是由于大分子的多點(diǎn)帶電，與介質(zhì)進(jìn)行多點(diǎn)結(jié)合，致使難以洗脫，使介質(zhì)的有效功能基團(tuán)減少。也可能是一些較大的分子被“卡牢”在孔道內(nèi)，難以擴(kuò)散出來，堵塞了孔道，在以后的交換過程中影響到顆粒內(nèi)功能基團(tuán)的有效工作。除生物大分子外，色素及腐殖酸等都可使介質(zhì)中毒。有時(shí)工作液中的膠狀物質(zhì)被粘附于介質(zhì)顆粒的內(nèi)外表面，覆蓋了功能基團(tuán)，這也是影響介質(zhì)工作容量的重要因素。 由于上述原因，離子交換層析介質(zhì)在使用一段時(shí)間后，可能出現(xiàn)顏色變深、床體收縮、分辨率下降、蛋白質(zhì)收率降低、反壓升高等現(xiàn)象。此時(shí)，需要對(duì)介質(zhì)進(jìn)行凈化處理。對(duì)于介質(zhì)用量比較大，自動(dòng)化程度比較高的規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)采用在原交換柱內(nèi)進(jìn)行，即“在位清洗”。先從交換柱的下面通過適量的清水，目的是去除交換柱中的懸浮物，并將床體疏松，還可以將結(jié)塊的介質(zhì)分散，有利于以后介質(zhì)與清洗液的接觸。對(duì)于一般的污染，采用逆流清洗，可減少污染物對(duì)下層介質(zhì)的污染。應(yīng)根據(jù)介質(zhì)種類及污染程度的不同，分別選用不同種類的清洗劑及不同的清洗步驟。一般的介質(zhì)是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分階段清洗或浸泡，各試劑交替之間須用去離子水洗至中性。若經(jīng)過上述處理后仍無明顯改善，尤其是流速無明顯提高，則要檢查交換柱布水器的紗網(wǎng)是否出現(xiàn)堵塞。 上述過程即為通常所說的“復(fù)蘇”過程。不同的介質(zhì)應(yīng)選用不同的復(fù)蘇方法，主要取決于介質(zhì)的物理化學(xué)性能及污染物質(zhì)的性質(zhì)。對(duì)于多糖類的離子交換劑，每當(dāng)使用一段時(shí)間后，可采用離子濃度較大的緩沖液通過交換柱或浸泡介質(zhì)，因?yàn)榫彌_液的離子強(qiáng)度較大時(shí)，有利于蛋白質(zhì)大分子脫離介質(zhì)，達(dá)到復(fù)蘇的效果。對(duì)于物化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的介質(zhì)，也可使用NaCl溶液通過交換柱或浸泡介質(zhì)。對(duì)于物化結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的介質(zhì)，可用30℃~40℃的乙醇或丙酮進(jìn)行洗脫或浸泡，在高溫下可使吸附在介質(zhì)上的蛋白變性或加快擴(kuò)散速度，也有利于膠體物質(zhì)的破壞，從而使污染物脫離介質(zhì)。還可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl，更有利于介質(zhì)的復(fù)蘇。 清除沉淀蛋白、脂類、疏水性的蛋白及脂蛋白，處理步驟更為復(fù)雜?？刹捎?00%的異丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的鹽酸胍、陽離子或非離子洗滌劑等作為處理液。在用過這些清洗劑后，都要用至少2倍體積的蒸餾水進(jìn)行清洗。使用有機(jī)溶劑后，交換柱要采用鋸齒形的梯度洗滌進(jìn)行清洗，即可以在5倍床體積內(nèi)，使溶劑的含量從0增至100%，然后在下一個(gè)5倍床體積中，使溶劑的含量從100%降到0。 如果經(jīng)過上述處理，交換柱的工作情況仍沒有恢復(fù)，可以使用蛋白水解酶，將仍滯留在介質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，使其脫離介質(zhì)?？梢圆捎煤?mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交換柱中，在室溫下浸泡過夜，或在37℃下浸泡一小時(shí)。根據(jù)污染物的情況，也可以采用DNA酶等其它的酶類。無論使用哪一種酶處理后，都要重復(fù)上述清除污染物的清洗步驟，把酶清洗干凈。 脂蛋白對(duì)分離介質(zhì)的污染比較嚴(yán)重，因?yàn)橹鞍准捌渌愇镔|(zhì)，很容易粘附在層析柱內(nèi)，最好在進(jìn)行分離工藝前先將其去除。推薦使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀劑，可去除高含量的脂蛋白。 2.6介質(zhì)的貯存： 各種分離介質(zhì)在使用后都要進(jìn)行清洗后再貯存，這對(duì)于多糖類分離介質(zhì)尤為重要。分離介質(zhì)在使用后，先用2個(gè)床體積的清水清洗，然后用2個(gè)床體積的20%的乙醇過柱。對(duì)于SP強(qiáng)酸性陽離子介質(zhì)，要用含有0.2mol/L乙酸鈉的20%乙醇溶液清洗，再用脫氣的乙醇-水溶液以較慢的流速清洗。經(jīng)過處理后，可在室溫下貯存，或在4~8℃下長(zhǎng)期存放。貯存過程中必須將層析柱全部封閉，以防止水分的揮發(fā)，造成干柱。暫時(shí)不用的介質(zhì)必須貯存在20%的乙醇溶液中。所有的離子交換分離介質(zhì)，都要在4℃~30℃的條件下貯存，并防止冷凍。 .