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1、Western Blot 常見問題分析 8 t W5 _0 U6 |: U, ]$ b; d) O1. 在western實驗中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解釋一下二者在使用中的區(qū)別？ ; e2 Q8 R, H& o! @1 A4 u: @　　選擇合適的緩沖液對于維持一定PH值下蛋白質的穩(wěn)定及保證實驗的重復性是很重要的。PBS的緩沖能力強于TBS（因為混合緩沖液在一定的離子強度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過PBS易污染）。但我們常常要根據我們實驗目的選用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進行陰離子交換層析，陽離子緩沖液首選TBS；陽

2、離子交換層析時，陰離子緩沖液則首選PBS。: Y0 g" l9 S) O' p8 u western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據需要選擇合適的濃度。6 p) e4 c- U: n/ i/ E; | 2. 沒有注明可以用來做western blot的一抗，可以用來做western blot嗎？1 r' @. k n/ J 不一定,因為有的抗體是識別線性表位的,有的是識別構象型表位的，識別構象型表位的抗體不能用于western blotting，因為在western blotting中抗體識別的是完全變性的蛋白質抗原，而蛋白質抗原的構象型表位變性時被破壞。# Y8

3、y5 S% t, g4 d6 ^+ w 3. 做western每次只加一種一抗，可以同時加兩種或者多種一抗的嗎？ ; u5 D* p- |: O0 ?9 D　　最好還是不要同時加兩種一抗。因為如果結果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。 + B% W1 U3 c' C2 O; O4. western blot 使用的膜哪種最好啊，PVDF好還是NC膜，能介紹一下膜的選擇嗎？" m) ~/ c) t4 `! h4 ]* W5

4、H 　　PVDF膜價格較貴，可重復使用，特別適合蛋白印跡，結合能力較強，但價格比較昂貴。 NC膜價格比較便宜，應用較廣，結合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 都可以用麗春紅染色。具體使用還要參考相關文獻。* x# r7 U( T/ u1 {5 m8 Y* X+ i1 O( b 5. 為什么出現(xiàn)了多條帶,每個加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶，而且好象都很有規(guī)律,為什么?是封閉時間不夠嗎？做WESTERN必須要內參嗎？ 5 v I) i" _; H9 ~" r( C, l　　一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應，抗體的特異性不強，目的

5、蛋白經過處理后發(fā)生變化,而內參的條帶基本均勻一致.這樣才有說服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認為的造成目的條帶濃度的變化.所以嚴格意義上說,內參是必須做的。 9 z. z! g3 b, \0 \6. western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些？購買一抗時發(fā)現(xiàn)單抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？ 9 ^4 S8 Q8 k; D& g　　作為western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于western

6、的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于western的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構像特異性。所以一般根據抗體說明書來確定。 * C7 ^# A( A% }" T4 M　　做免疫印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶。 0 V( ]: F" S- l4 z- v& a: A7. 半干轉是否要求膜，濾紙，膠同樣大??？因為膠大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？% h3 @! S

7、* l9 L- J' _! ~ 　　可以相等，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。$ Z" ?8 [2 C* Y$ @) s 8. Western Blot哪種染色好？8 m4 ]$ |' Y+ \$ n7 ?4 v1 o6 M μg，考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去 ，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是

8、：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。 - `$ a4 ~7 J# G" r, v7 v3 \. }; J（2） 膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩(wěn)定。 1 b" n: o W X1 q/ ]& x$ [& J（3） 生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。2 n9 ~( P! f9 E* _' b2 M 9. 不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎么樣解決？/ N" M9 ]% l1 p5 P" T 　　可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉移緩沖液，可以參考《蛋白質技術手冊》)，因

9、為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優(yōu)質的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉移電壓／電流；增加轉移時間。 5 U* v' P: G$ Q# m0 P2 ]& x10. DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理是什么？0 _$ Z+ a$ f2 g4 T DAB顯色在辣根過氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產物，該產物難溶于醇和其他有機溶劑，DAB的

10、氧化還能引起聚合作用，導致與四氧化鋨反應而增加其染色強度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結合而產生有色的、不溶性偶氮染料。 0 r$ d( U0 U" p( e4 {11. 酶顯色與熒光顯色之間，各自的優(yōu)缺點是什么？ / E$ ^% k7 H# l, |# h- H( l　　免疫酶技術就是用酶(如辣根過氧化物酶)標記已知抗體(或抗原)，然后與組織標本在一定條件下反應，如果組織中含有相應抗原(或抗體)，抗原抗體相互結合形成的復合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產生顯色反應，這樣就可以識別出標本抗

11、原(抗體)分布的位置和性質，通過圖像分析并可達到定量的目的。 , Q8 c5 ~6 P" t$ E0 d6 V　　免疫熒光技術雖已廣泛應用于免疫學的研究與診斷，但是熒光抗體染色標本不能長期保存，對組織細胞的細微結構分辨不清，免疫酶技術則能克服上述不足，標記免疫酶技術的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法，對石蠟切片標本尤為適用，為免疫病理研究開辟了一條新途徑，酶顯色產物具有較高的電子密度，經過適當處理還可以進行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術分為酶標記法與非標記抗體技術，前者是將酶通過交聯(lián)劑結合在抗體分子上，形成酶標記抗體。后者是將酶作為抗原與相應的特異性抗體連接進行的免疫反應，稱為非標記抗體酶技術。

12、關于western blot原理和常見故障分析(我覺的比較全) 關于western blot 原理： 通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質進行檢測，蛋白質的Western印跡技術結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的選擇和制備 A：樣品的制備 1 組織： 組織的處理方法：組織洗滌后加入3倍體積預冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清

13、。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。 2 細胞： 細胞的處理方法： 離心收集細胞或者直接往細胞培養(yǎng)瓶內加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。 3 分泌蛋白的提?。ㄌ乩? 直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚藍制樣。 B：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因 1.雙縮脲法

14、： 雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法。在需要快速，但不很準確的測定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對蛋白質提純的早期階段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白質溶液測定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質緩沖液，如Tris、Good緩沖液等。可用沉淀法除去干擾物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質，然后棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質進行定量測定。 2.Lowry法： 此法是雙縮脲法的進一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應

15、，即Cu++與蛋白質在堿性溶液中形成絡合物，然后這個絡合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），結果得到深藍色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質溶液。其干擾物質與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質的存在會使結果嚴重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時要特別小心，試劑只在酸性pH環(huán)境中才穩(wěn)定，上述提到的還原反應只有在pH10時才發(fā)生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu2+-蛋白質溶液中時，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+-蛋白質絡合物所還原。 3.紫外吸收法： 大多數(shù)蛋白質在280nm波長處有特

16、征的最大吸收，這是由于蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，因此，利用這個特異性吸收，可以計算蛋白質的含量。如果沒有干擾物質的存在，在280nm處的吸收可用于測定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質溶液。部分純化的蛋白質常含有核酸，核酸在260nm波長處有最大吸收。 4. Bradford比色法： Bradford比色法比Lowry法測定蛋白濃度更簡單迅速。用脫氧膽酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污劑、2-巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、Tris和一些堿性緩沖系統(tǒng)的干擾。 分別在兩組微量離心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20μμl，同時以兩管100μl的0.1

17、5mmol/l NaCl作空白對照。每管各加入1ml考馬斯亮藍染料溶液，振蕩混勻，室溫放置2分鐘。用1cm光徑的微量比色杯測A595，取A595吸光值對標準蛋白濃度作圖，畫標準曲線，并測量待測樣品的A595。從BSA標準曲線中確定待測樣品的濃度。測定10-100μg的蛋白質，要在較大試管中將染料溶液體積增大5倍進行。樣品濃度過高，可稀釋后進行，或在10-100μg另作一標準曲線進行測定。 5．電泳估算法（我們選擇此法）： 樣品倍比稀釋，SDS-PAGE電泳，同時做定量marker對照，可以估算樣品大概濃度。 以提取癌組織總蛋白為例： ① 取等量胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織，用dH

18、2O漂洗5～10次，再用預冷的1×PBS洗滌3次，目的是去除樣本中的血液。 ② 每2克組織加入3ml 1×PBS勻漿，保持在4℃條件進行。 ③ 加入5×STOP Buffer緩沖液1ml，混勻，4℃下超聲碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚藍，煮沸10mins，至此，制樣過程完成； ④ SDS-PAGE電泳，以BAS作為對照估計樣品蛋白濃度。 二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE） A：實際操作 1. 做膠前的準備 1)檢查是否有足夠的、干凈的 spacer、comb 和架子。 2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。 3)按將要檢測的抗

19、體對應的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。 2. 制膠，電泳 1）裝好架子。 2)按照下面配方配制分離膠。(單位：ml，Total： 8ml) 7.5％ 10％ 15% 2×Sep. buffer 4 4 4 30％ Gel.sol 2.0 2.7 4 ddH2O 1.9 1.2 0 TEMED 8ul 8ul 8ul 10%APS 80ul 0ul 80ul 在膠上面加入一層蒸餾水，促進膠更好的凝集。 3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。(單位：ml，Tota

20、l： 3.5ml) 3％ TEMED 5ul 10%APS 50ul 倒好后插入預先準備好的梳子。 4)待膠凝集好后，上樣，電泳。 上層膠用60-80V電壓，當樣品至分離膠時，用100-120V電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。 B ：注意事項及常遇到的問題 1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。 2）上樣蛋白量不應超過30ug/mm2 (載荷面即：如果你的膠槽是5mm×1mm，則載荷面為：1mm×5mm=5mm2) 。 3）gel通常在0.5-1h內凝集最好，過快表示TEMED、APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠

21、。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實際不純或實效。 4）混合攪拌速度太快產生氣泡影響聚合，導致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。 5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象： ︶ 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。 ︵ 條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。 拖尾：樣品溶解不好。 紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。 條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。 條帶兩邊擴散：加樣量過多。 三、轉移 在電流的作用下，使蛋白質從膠轉移至固相載體（膜）上。 膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、

22、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。 A 半干法 即將凝膠夾層組合放在吸有轉印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導電流，起到轉移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉移條件比較嚴酷，但是其轉移時間短，效率高。 1 實驗條件的選擇 電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間，具體可以根據實際適當調整。 目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度 轉

23、移時間 25---80 2 實驗操作 （1）濾紙和膜的準備 (在電泳結束前20分鐘應開始準備工作)。 A. 檢查是否有足夠的transfer buffer，沒有立即配制。 B. 檢查是否有合適大小的濾紙和膜。 C. 將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉入transfer buffer中。 D. 將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。 PDVF膜在進轉移緩沖液時，要在甲醇里面泡多長時間? PVDF是疏水性的，在轉膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤。 PVDF的預處理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后轉入蒸餾水洗

24、兩次。用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合。 一般5-20分鐘都有人在用?？稍谌∧z的同時泡，估計前后5分鐘左右。效果還不錯。以前有站友發(fā)貼，說處理時間沒多大關系，關鍵看膜的質量．確實是這樣的。只要讓膜完全浸透應該就沒問題了。 Hybond的PVDF說明書這樣的寫的：“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是，至少10秒鐘，多泡下也沒關系的，事實上，泡10秒的做過，10分鐘的也做過，都沒有問題的。 （2）轉移 A. 在電轉移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。 B.

25、 將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤。 C. 將膠剝出，去掉stack gel，小心的移到膜上。 D. 剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標記出膠的位置。 E. 將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。 F. 裝好電轉移儀，根據需要選定所需的電流和時間。 G. 轉移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應及時調整。 3 注意事項及常遇到的問題 1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。 2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。 3）因為膜的疏水性，

26、膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外）。 4）濾紙可以重復利用，上層濾紙（靠膜）內吸附有很多轉移透過的蛋白質，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。 5）轉移時間一般為1.5 小時，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據分子量大小調整轉移時間和電流大小。 1)在疊膜、膠、紙三明治時候，操作于盛有轉膜Buffer的大平皿中進行，疊好后，再將三者平行轉移至轉膜裝置，切勿再移動，因為在buffer中操作，已經完全排除了氣泡存在的可能，無需再趕氣泡 2)關于轉膜時間：半干轉的話，20 V×30min即可

27、 B 濕法 我們基本上不用此方法，這里暫不做介紹。 C 轉移后效果的鑒定 1．染膠 用考馬斯亮蘭染色經destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉移的效果。 2．染膜 有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠衟onceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于進一步的分析。 四、封閉（block） 封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合。 常用的封閉液有bovine s

28、erum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我們一般用non-fat milk。 在轉移結束前配好5%的Milk(TBST溶解)。轉移結束后將膜放入milk中block(一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜)，并清洗整理好用過的濾紙，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小時。 封閉后可以不洗膜，讓膜的一角在吸水紙上接觸，把封閉液控一下即可 五、孵育一抗 A. 先將需要檢測的抗體準備好，并決定好它們的稀釋度。 B. 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀

29、釋， 最好采用梯度稀釋。 C. 將稀釋好的抗體和膜一起孵育。 一般采用RT 1小時，可根據抗體量和膜上 抗原量適當延長或縮短時間。 注意：為了便于后面分析結果，我們一般會選用已確定分子量大小而且純度高的抗體作為marker與一抗同時孵育。 六、洗滌 用 TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。然后5mins *5。 洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺。 七、孵育二抗 孵育 RT1 小時。 一般采用HRP標記的二抗，稀釋比例為1:5000。 二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導致非特異性的結合。 注意二抗的選擇有多種，

30、要根據一抗來選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根據后面的顯色條件來選擇HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶鏈的二抗或者標志其他探針（如核素等）的。 八、洗滌 用 TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。 然后5mins *5。 洗滌是為了洗去二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。 九、顯色（HRP酶） 1．增強化學發(fā)光法(ECL) Ecl 顯色原理：氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學發(fā)光劑。魯米諾（luminol，5＇-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結構及化學反應式如下： 　　

31、魯米諾在免疫測定中既可用作標記物，也可用作過氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來。 試驗步驟： 1）將兩種顯色底物1：1等體積混合（一般各1ml/membrane）。 2）將混合物覆蓋在膜表面，1-2分鐘，搖晃使均勻。 3）用保鮮膜把膜包起來，放入夾板中。 4）在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1min。 5）顯影、定影。 6）根據結果調整曝光時間和曝光區(qū)域，得到最佳結果。 注意：熒光在一段時間后會越來越弱。 DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）和HRP反應產生棕色的不溶終產物。這種棕色沉淀不溶于酒精和

32、其它有機溶劑，對于必需使用傳統(tǒng)復染和封固介質的免疫組化染色應用特別理想。 對于AP標記的二抗我們選用BCIP and NBT 顯色，它們在堿性磷酸酶（AP）作用下反應可生成一種不溶性黑紫色沉淀的強信號。 Western顯色 ECL靈敏度比DAB高不少 雜帶多的原因無非是幾點： 1、你的一抗如是多克隆抗體，可以試著降低一抗的濃度，如一抗是單抗，可適當降低二抗的濃度 2、還有最重要的是確保封閉的充分，封閉最好時間長點，至少2小時室溫封閉，時間允許可4度過夜封閉 3、就是洗膜一定要充分我們一般PBST 10分鐘三次，還有看你是DAB 顯色吧，背景過深，DAB顯色時間不要過長，一般2分鐘

33、足夠。 做一個好的陰性和陽性對照。這樣出來的帶該在哪個位置，不該在哪個位置一目了然 十、分析結果及其判斷 常見問題原因分析及處理方法： 見附錄一、二。 附錄一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48） 附錄二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394） 附錄三：試驗中所用到的試劑和緩沖溶液 1) 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7: Stock: to use: 20% Glycerol 100ml take

34、9.5ml stock 10% SDS 50g 250mM Tris bromphenol blue or total 475.00ml pyronine 4 to taste 2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix): 0.8 bis-acrylamide 29.2% acrylamide total 100ml 3) 2x Laemmli Separation Buffer: Tris-HCl 0.2% SDS 10ml 20% SDS total 1000ml 4) 2x Laemmli Stacking

35、 Buffer: Tris 0.2% SDS 1g total 500ml 5) 10x Laemmli Running Buffer: 250mM Tris Glycine 1% SDS 20g total 2 liters 6) Transfer Buffer: 48mM Tris base 39mM Glycine 0.037% SDS g 20% MeOH 200ml total 1000ml 7) TBST: 10mM Tris-HCl， 100mM NaCl 0.2% Tween-20 Total 1000ml

36、 8) Coomassie Stain : 40%MeOH 400ml 10%HAc 100ml 0.1%BBR 1g Brilliant Blue R total 1000ml 9) Destain: 30%MeOH 300ml 7.5%HAc 75ml total 1000ml 10) 10×麗春紅染液配方： 麗春紅 2g 磺基水楊酸 30g 三氯醋酸 30g total 100ml 11）DAB DAB 50mg 0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml 30%H2O2 30-40ul 先配成2-5倍的儲存液，過濾后分裝，-20℃避光

37、保存，H2O2在工作液中終濃度0.01％ 不顯影不一定是抗原性喪失，Western blot 環(huán)節(jié)多，一抗和二抗原因是wb中比較難掌握準的環(huán)節(jié)。 western blot的個人總結zz 1. WESTERN BLOT電轉膜時間與分子量大小有關，即大分子量的需要轉印時間長些，才能轉到NC膜上去。小分子量的需要轉印時間短些。 我們用BIO-RAD電轉膜儀，30-80KD蛋白需要恒電流350毫安，70分鐘。15-30KD蛋白需要恒電流200毫安60分鐘。大于80KD蛋白需要恒電流350毫安120分鐘。同時電泳緩沖液要經常更換。條件你要摸素，好運?。?！ 2. 每次做we

38、stern blot 都遇到這個現(xiàn)象 膠上的蛋白條帶 很好 但轉膜后總是出現(xiàn)這種情況，麗春紅染色后發(fā)現(xiàn)蛋白條帶總是出現(xiàn)流水樣飄走了.我用濕式轉移 bio-rad 冰水 100伏 100分鐘 nc 膜 應該不是氣泡,轉膜液沒問題 請高手分析 首先多謝各位高手相助，經過反復摸索，原來并不是轉膜時間和電壓的問題，也不是nc膜像各位說的那樣比較差。原因真的是非常簡單，只是因為我們的轉膜儀使用時間太長，兩塊板之間的海綿由于長期使用變得很薄。當按照陰極-海棉-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿依次放好后兩塊板不能壓緊，因而在膠和膜之間可能存在潛在的間隙，電轉移時蛋白從膠和膜之間的空隙中流走，形成如圖所示的

39、形狀。我僅使用十幾張普通的草紙墊在兩塊海棉之間，條帶就變得非常的漂亮。這也是在大家的幫助下共同發(fā)現(xiàn)的。想到我求助時各位熱心的幫助，因此在原文下加上了本人最終解決問題的方法，這是對大家的感激，也希望更多實驗中遇到困惑的同事們能從中得到啟迪。一個小小的失誤的確是很讓人頭疼得哦，讓我們都變得細心起來。而且便宜的東西不一定不好，nc雖比不上pvdf轉染效率高，用的好一樣能達到試驗目的。這對像我一樣的窮學生，比較有鼓勵性吧，呵呵。再次感謝各位 3. 看樣子是濕轉，注意幾點：1.換為PVDF膜 2.記住, 電轉液必須有甲醇.3. 用PVDF電轉前要在甲醇中泡3-5分鐘.NC膜則不能在純甲醇中泡

40、,否則會溶解.4.4度冷卻很重要.5 轉膜后一般膠上都會有剩,關鍵是膜上的蛋白是否理想,對初學者一定要用麗春紅染色,如不理想就不用往下做了.5. 注意濾紙一定要剪的和膠一樣大小,兩快濾紙不能接觸,否則會短路.6. 建議貴實驗室用Biorad 的半干轉移系統(tǒng),都什么年代了,還用...呵呵 4. 一抗的稀釋比例是都不相同的，一般根據說明書的推薦來做，有條件的可以做梯度稀釋，摸索出自己的條件來。 一般稀釋范圍在1:100-1:5000, WB. 我做過的極限是1：500000 wb 就我的經驗看，就整個Western Blot來說， 我覺得最關鍵的步驟在前面，1.制樣 2.電泳 3

41、.轉移 4. Block，其中1和3更為重要， 后面的步驟按照標準來就行了， 最多有一些小調整。 你們在實際應用中有問題可問， 越具體越好。我盡量解答 請教一下，半干轉是否要求膜，3m濾紙，膠同樣大??？ 因為膠大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？ 什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？謝謝指點 答: 一般參照 膜>= 濾紙> 膠, 就行, 你轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路. 想請教Western的結果如何分析，一定要有內參照嗎？ 答: 不一定,但是最好

42、能有Marker,我做的Western 都用了Marker 如果你做定量或辦定量，至少要用到一個光密度掃描分析軟件， 如果不是，直接分析就可以了 我的Western轉膜已經成功了，但是Marker泳道未見蛋白條帶（正常應該有6條） ，其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經考馬斯亮藍染膠，結果相同。經5％的脫脂牛奶封閉1小時45分鐘后，進行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過夜，二抗孵育5個半小時（1：2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出現(xiàn)非特異性條帶。請ptglab幫忙分析一下： 1、Marker是否有問題？是MBI公司的，可分離14-11

43、6KD的蛋白，買了大概有一年的時間啦。 2、一抗（為多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時間是否合適？ 3、封閉的時間是否太短？ 答: 恭喜呀！ 1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它標稱的上樣量太少， 不夠， 我做過一個標稱每次5ul可我上了20ul才行的。 2.建議，一抗4度過夜也很好， 建議1:100,室溫2hrs就夠了， 3. 2抗室溫1小時，1:2000, 我喜歡4度封閉過夜（室溫2hr就夠了），1抗室溫1hr，2抗室溫1hr， 最好是一抗4度過夜（或室溫2小時）1:200，2抗室溫1小時1:2000， 換Ecl法. tracyzang wrote:

44、 如果不是顯色的問題，那我如何分析呢？ 國外做的蛋白條帶很強。我買的是Santa Cruz的抗體，也實驗過一抗和二抗肯定能結合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是不知道與Marker對應的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時轉膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉過去的較少。 難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克?。ǖ诙妫┥系募訕觔uffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。 我真的不知道是哪里出了

45、問題，幫幫忙吧！ 答: 我的建議： 1、首先確定您提的蛋白質量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測蛋白的濃度，一般來講，其濃度應該在幾-20微克/微升。 2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時左右。跑過積層膠與分離膠的線時，換用100V，3-4小時。 3、轉膜，建議恒壓，15V，不用轉2小時，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉過去的，并不是真正的少，而是因為在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾經也轉過2小時，但和45分鐘的區(qū)別并不大。 4、根據MARKER的條帶（我

46、的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。 5、延長1抗、2抗孵育時間（我曾室溫1小時，4度過夜），適當加大1抗?jié)舛取? 6、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質量還可以，我想您應該先找其他方面的原因。 pVDF膜和NC膜都可以，一般質量都行 6*8的膜我一般用到了2.5ml，膜可以用封口膜塑料袋封起來，這樣比較節(jié)約抗體，如果抗體非常珍貴，可以使用后回收（－70保存)， 如果你一張膜只加一種抗體，可以

47、在轉膜后用麗春紅染一下，根據mark的位置對應找到需要的蛋白所在的位置，這樣在以后的轉膜中可以將膠剪小，這樣比較省膜。 在電泳時，緩沖液最好和玻璃板上緣平齊，這樣條帶壓得要好一些的 to tracyzang： 1.電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。 電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時溴酚藍和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時間。建議你用恒壓80－100伏。 2.轉膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題

48、應該出在抗原和一抗上，不知對不對。一抗我買的是單抗，推薦的稀釋度是1：100——1：1000。我用的是1：100。難道非要用多抗嗎？按道理單抗也應該出條帶呀！ 做wb時理論上單抗也應該有帶，但由于單抗識別抗原結構的單一性，有時候對于抗原的某些結構不識別，因而wb的結果有時候不好。 3.細胞用三去污劑裂解的，沒有做定量，加巰基乙醇變性后，每孔上樣20微升。提出的蛋白我保存在4度了，這樣行嗎？ 這個制樣步驟沒什么問題。 請教1：是否WB實驗半定量一定要加ACTIN內參； 對于發(fā)表文章的實驗最好加內參，實驗嚴謹。 2：發(fā)中華級文章要求結果用膠片還是膜照相相片，用掃描儀掃描

49、膜后沖印相片行不？； 國內的文章要求不是很高，最好用的照片。當然了這取決于你的照片的結果。 3：用BANDSCAN分析結果行嗎？ 分析一般的結果沒問題。 4:蛋白定量后加多少ug總蛋白（全細胞總蛋白）合適？ 總蛋白量有個上限的， （具體的我忘了， ）但是最好不要超過150ug/well 我回公司后給你個具體的答復。 轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。 tris－h(huán)cl就是tris鹽用hcl調ph值，配置而成。 to:iamsunkai 對于第一個問題：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素： 1. 電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充

50、分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。 2. 膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。 第二，可以用， 2.0-3.0mA/cm2, 2hrs 第三，小分子的蛋白在轉移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。 對于第四個問題，我想你是不是要問：“我要檢測的抗原（蛋白）是160kd的，但是結果只有50kd的那條帶，同時，背景又相對來說比較干凈，條帶比較清楚，想請你給我提點建議”，是嗎？ 首先分析你的

51、整個實驗步驟。我發(fā)現(xiàn)了兩個比較大的毛?。? 1. 一抗用TBST稀釋。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脫脂牛奶稀釋，和你的封閉液相一致，這樣可以降低背景。你大概也意識到了，？ 2. “biorad半干轉PDVF膜,15v轉30分鐘”，你是這么做的嗎？因為我大部分時間是做的恒流轉移，用的是0.1mA/膜，100kd--200kd轉2小時。到最后電壓會升到20v左右。你用恒壓法，我不是很肯定你轉30分鐘能將大分子（160kd）的抗原轉上去。我建議你最好能將時間延長，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒壓，可摸索一下，適當延長時間。有時候你的marker也有可能欺騙你，因為marker的量比較

52、大，是很容易轉上去的，實際上目標蛋白的量遠遠少于marker量。 我對你的結果分析如下： 1. 你的結果很好，估計離目標不遠了，很快就可以成功。 2. 沒有160kd的帶是因為你的轉移時間過短，適當延長轉移時間（我懷疑這是主要的問題）。 3. 你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000， 背景會低一點。 shybird6011 wrote: ptglab:您好！ 最近我在做Western，但結果一直不理想，出來的只是淺淺的帶，甚至現(xiàn)在什么條帶也沒有了！我每次轉膜后都用了立春紅染色，出現(xiàn)的蛋白條帶還是很清晰，唯一的一點是在我需要的分子量附近并沒有很清晰的條帶出現(xiàn)，只是很

53、模糊的多條帶，是不是從這里就可以推斷出我的結果就會不理想！郁悶中，請您指教?。。。?！謝謝您 答: 不是的，因該沒有問題，要知道大部分目的蛋白含量少因該是看不到的，只要你目的蛋白前后的蛋白轉移地都很好就可以了。 緊急求助！?。∥易罱隽艘淮蜽B，結果很奇怪，背景是中棕色的，而轉上的蛋白帶是白色的，與正常顯色恰恰相反，我簡直是哭笑不得。我買的一抗是單抗，ELISA要求1：4000-1：10000，我用的是1：4000，二抗ELISA要求1：4000-1：8000，我用的1：4000。第一次做時有目的帶，但是由于有雜帶，懷疑抗體加多了就將了一下濃度，結果出現(xiàn)了這么怪的問題。請pt

54、glab 高手及其他同志幫幫在下。 答: WB所需抗體濃度應按說明書，一般為1：1000左右，有些適于做ELISA的抗體不一定適于做WB，一抗與二抗需配套使用，背景高可能是封閉不夠。 rainycloud wrote: 我目前研三在讀，但課題才剛剛完成模型和整體實驗部分，接下來老板又要求采用Western－blot的方法對我所檢測的蛋白進行半定量，真是一頭霧水,還請前輩千萬多幫幫我，本人將不勝感激！ 1.我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？ 2.但我還是照著做了，結果是有的，但非常

55、不穩(wěn)定。有時條帶清晰，有時很散,不知為何？ 3.我原先采用的顯色方法是Ecl，但洗出來的片子有時很清晰，有時又非常糊，或者亂七八糟，不知這和轉膜時濾紙的厚度是否有關，或者是因為我的濾紙反復使用，影響了轉膜效果？至于洗膜我是非常注意的，一般采用10分鐘一次，洗三次，TBS。 4.接下來我準備采用DAB顯色技術，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，不能再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？不知前輩是否有比較成熟的方案以供參考？ 答: １，上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因為１０５ＫＤ的蛋白在上述兩種

56、膠的線性分辨范圍內，但需注意條帶位置． ２，可能:原因：樣品可能存在降解；轉膜不及時造成擴散；轉移緩沖液甲醇濃度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％） ３，您指的模糊是說背景高還是條帶模糊？ ４，不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點． ptglab真不錯，又有事求你老人家了。最近又試了兩次WESTERN ，結果在轉膜這步就卡住了。 我們用的濕式電轉移，一次是50V、12小時（轉移緩沖液中無甲醇）；麗春紅染色無 另一次120V、2小時（加了甲醇）。麗春紅染色MARKER有一條帶 兩次麗春紅染色幾乎沒有蛋白條帶（蛋白質上樣應沒問題，膠用卡馬斯亮

57、藍染色有），轉移后的凝膠用卡馬斯亮藍染色也無條帶。蛋白質跑哪里去了？ 難道轉過頭了嗎？ 我曾經用第一種條件轉出來過，難道緩沖液有問題？ 我的問題是：1，是否必須有麗春紅染出較為明顯條帶才能進行下一步？ 2，我的分子量是30KD，用濕式電轉移槽（北京六一）轉移條件以那種方式最好？ 先謝謝各位的帖子，摸索條件太費勁，如能借各位經驗少走彎路就好了。 答: to caimingc， 你可以用在第一種緩沖液里加20％甲醇，然后36V 5-15hrs。30KD就可以上去了。 另外，你用的PVDF膜用甲醇活化的吧？你的電極方向沒有反吧 western blot的個人總結zz 1.

58、 WESTERN BLOT電轉膜時間與分子量大小有關，即大分子量的需要轉印時間長些，才能轉到NC膜上去。小分子量的需要轉印時間短些。 我們用BIO-RAD電轉膜儀，30-80KD蛋白需要恒電流350毫安，70分鐘。15-30KD蛋白需要恒電流200毫安60分鐘。大于80KD蛋白需要恒電流350毫安120分鐘。同時電泳緩沖液要經常更換。條件你要摸素，好運?。?！ 2. 每次做western blot 都遇到這個現(xiàn)象 膠上的蛋白條帶 很好 但轉膜后總是出現(xiàn)這種情況，麗春紅染色后發(fā)現(xiàn)蛋白條帶總是出現(xiàn)流水樣飄走了.我用濕式轉移 bio-rad 冰水 100伏 100分鐘 nc 膜 應該不是

59、氣泡,轉膜液沒問題 請高手分析 首先多謝各位高手相助，經過反復摸索，原來并不是轉膜時間和電壓的問題，也不是nc膜像各位說的那樣比較差。原因真的是非常簡單，只是因為我們的轉膜儀使用時間太長，兩塊板之間的海綿由于長期使用變得很薄。當按照陰極-海棉-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿依次放好后兩塊板不能壓緊，因而在膠和膜之間可能存在潛在的間隙，電轉移時蛋白從膠和膜之間的空隙中流走，形成如圖所示的形狀。我僅使用十幾張普通的草紙墊在兩塊海棉之間，條帶就變得非常的漂亮。這也是在大家的幫助下共同發(fā)現(xiàn)的。想到我求助時各位熱心的幫助，因此在原文下加上了本人最終解決問題的方法，這是對大家的感激，也希望更多實驗中遇

60、到困惑的同事們能從中得到啟迪。一個小小的失誤的確是很讓人頭疼得哦，讓我們都變得細心起來。而且便宜的東西不一定不好，nc雖比不上pvdf轉染效率高，用的好一樣能達到試驗目的。這對像我一樣的窮學生，比較有鼓勵性吧，呵呵。再次感謝各位 3. 看樣子是濕轉，注意幾點：1.換為PVDF膜 2.記住, 電轉液必須有甲醇.3. 用PVDF電轉前要在甲醇中泡3-5分鐘.NC膜則不能在純甲醇中泡,否則會溶解.4.4度冷卻很重要.5 轉膜后一般膠上都會有剩,關鍵是膜上的蛋白是否理想,對初學者一定要用麗春紅染色,如不理想就不用往下做了.5. 注意濾紙一定要剪的和膠一樣大小,兩快濾紙不能接觸,否則會短路.

61、6. 建議貴實驗室用Biorad 的半干轉移系統(tǒng),都什么年代了,還用...呵呵 4. 一抗的稀釋比例是都不相同的，一般根據說明書的推薦來做，有條件的可以做梯度稀釋，摸索出自己的條件來。 一般稀釋范圍在1:100-1:5000, WB. 我做過的極限是1：500000 wb 就我的經驗看，就整個Western Blot來說， 我覺得最關鍵的步驟在前面，1.制樣 2.電泳 3.轉移 4. Block，其中1和3更為重要， 后面的步驟按照標準來就行了， 最多有一些小調整。 你們在實際應用中有問題可問， 越具體越好。我盡量解答 請教一下，半干轉是否要求膜，3m濾紙，膠同樣大??？

62、 因為膠大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？ 什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？謝謝指點 答: 一般參照 膜>= 濾紙> 膠, 就行, 你轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路. 想請教Western的結果如何分析，一定要有內參照嗎？ 答: 不一定,但是最好能有Marker,我做的Western 都用了Marker 如果你做定量或辦定量，至少要用到一個光密度掃描分析軟件， 如果不是，直接分析就可以了 我的Western轉膜已經成功了，但

63、是Marker泳道未見蛋白條帶（正常應該有6條） ，其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經考馬斯亮藍染膠，結果相同。經5％的脫脂牛奶封閉1小時45分鐘后，進行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過夜，二抗孵育5個半小時（1：2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出現(xiàn)非特異性條帶。請ptglab幫忙分析一下： 1、Marker是否有問題？是MBI公司的，可分離14-116KD的蛋白，買了大概有一年的時間啦。 2、一抗（為多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時間是否合適？ 3、封閉的時間是否太短？ 答: 恭喜呀！ 1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它標稱的上

64、樣量太少， 不夠， 我做過一個標稱每次5ul可我上了20ul才行的。 2.建議，一抗4度過夜也很好， 建議1:100,室溫2hrs就夠了， 3. 2抗室溫1小時，1:2000, 我喜歡4度封閉過夜（室溫2hr就夠了），1抗室溫1hr，2抗室溫1hr， 最好是一抗4度過夜（或室溫2小時）1:200，2抗室溫1小時1:2000， 換Ecl法. tracyzang wrote: 如果不是顯色的問題，那我如何分析呢？ 國外做的蛋白條帶很強。我買的是Santa Cruz的抗體，也實驗過一抗和二抗肯定能結合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是不知道與Mark

65、er對應的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時轉膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉過去的較少。 難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克隆（第二版）上的加樣buffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。 我真的不知道是哪里出了問題，幫幫忙吧！ 答: 我的建議： 1、首先確定您提的蛋白質量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測蛋白的濃度，一般來講，其濃度應該在幾-20微克/微升。 2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問

66、題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時左右。跑過積層膠與分離膠的線時，換用100V，3-4小時。 3、轉膜，建議恒壓，15V，不用轉2小時，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉過去的，并不是真正的少，而是因為在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾經也轉過2小時，但和45分鐘的區(qū)別并不大。 4、根據MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。 5、延長1抗、2抗孵育時間（我曾室溫1小時，4度過夜），適當加大1抗?jié)舛取? 6、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質量還可以，我想您應該先找其他方面的原因。 pVDF膜和NC膜都可以，一般質量都行 6*8的膜我一般用到了2.5ml，膜可以用封口膜塑料袋封起來，這樣比較節(jié)約抗體，如果抗體非常珍貴，可以使用后回收（－70保存)， 如果你一張膜只加一種抗體，可以在轉膜后