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熒光分光光度法測定藥液維生素B2的含量,實驗目的,,學習熒光分光光度法測定藥液中維生素B2的分析原理。 掌握熒光分光光度計的操作技術和測定藥液中維生素B2 的方法。,1,實驗原理,常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產生熒光。 在稀溶液中，熒光強度IF與物質的濃度c有以下的關系： 當實驗條件一定時，熒光強度與熒光物質的濃度成線性關系： 這是熒光光譜法定量分析的理論依據。,2,a. 與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。 b. 選擇性好。熒光法既能依據發(fā)射光譜，又能依據吸收光譜來鑒定物質。 c. 所需試樣量少、操作方法簡便。,3,激發(fā)光譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光強度與照射光波長的關系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大。 發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關系曲線。 固定發(fā)射光波長進行激發(fā)光波長掃描，找出最大激發(fā)光波長，然后固定激發(fā)光波長進行熒光發(fā)射波長掃描，找出最大熒光發(fā)射波長。激發(fā)光波長和發(fā)射熒光波長的選擇是本實驗的關鍵。,激發(fā)光譜,發(fā)射光譜,4,常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示記錄器五部分構成，如下圖所示： 熒光分析儀器與分光光度計比較主要差別有兩點： a.熒光分析儀器采用垂直測量方式，以消除透射光的影響； b.熒光分析儀器有兩個單色器，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其它雜散光干擾。,5,a.光源：在熒光計中常用鹵鎢燈作光源；熒光分度計常采用高壓汞燈或氙弧燈做光源。 b.單色器：熒光計的單色器是濾光片，只能用于定量分析；熒光分光光度計采用兩個光柵單色器，可獲得激發(fā)光譜和熒光光譜。 c.檢測器：熒光計采用光電管作檢測器；熒光分光光度計采用光電倍增管作檢測器。,儀器部件,6,維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結晶，其結構式為： 維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。,7,維生素B2溶液在430～440 nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光，其峰值波長為525 nm。VB2的熒光在pH=6～7時最強，在pH=11時消失。維生素B2在堿性溶液中經光線照射會發(fā)生分解而轉化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強的多，故測VB2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內，且在避光條件下進行。,光黃素,8,實驗預習,預習熒光分光光度法測定維生素B2的分析原理。 了解熒光光度計的操作步驟和測定維生素B2 的方法。,9,F96型熒光光度計（上海棱光分析儀器有限公司） 5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只 10.0μg·mL-1VB2標準溶液（置陰暗處保存），冰乙酸（AR）， 藥用VB2試樣,儀器與試劑,10,1. 打開氙燈，再打開主機，然后打開計算機啟動工作站并初始化儀器。 2. 儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項目，設置適當?shù)膬x器參數(shù)：激發(fā)波長= 440 nm（本儀器只有356 nm ），發(fā)射波長=540 nm。 3. 樣品測定。 4. 退出主程序，關閉計算機，先關主機，最后關氙燈。,基本操作,11,1. 標準系列溶液的配制及標準溶液熒光強度的測定： 在六個干凈的50 mL容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00 、2.50和3.00 mL VB2標準溶液，各加入2.00 mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。從稀到濃測量系列標準溶液的熒光強度。 2. 未知試樣的測定: 移取0.1 mL試樣,用少量水溶解后轉入50 mL容量瓶中，加2.00 mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標準系列時相同的條件，測量其熒光強度。,實驗步驟,12,1. 用標準系列溶液的熒光強度繪制標準工作曲線。 2. 根據待測液的熒光強度，從標準工作曲線上求得其濃度，計算出試樣中VB2含量。,數(shù)據處理,13,1. 解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因。 2. 維生素B2在pH＝6～7時熒光最強，本實驗為何在酸性溶液中測定？,注意事項和問題,14,