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月季的花藥培養(yǎng),1,花中皇后月季又稱“月月紅”，自然花期5至11月，開花連續(xù)不斷 ，通常扦插就可以成活。,2,1964年，印度科學家在培養(yǎng)茂業(yè)曼陀羅的花藥時，首次獲得了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的單倍體植株。 說明生殖細胞和體細胞一樣，在離體條件下也具有發(fā)育成完整植株的潛能。,自20世紀60年代以來，世界上已有250多種高等植物的花藥培養(yǎng)獲得成功。,我國已經(jīng)培育成功近50種植物的花粉再生植株，如小麥、玉米、大豆、甘蔗、橡膠等。,3,知識回顧,單倍體育種的過程？,花藥離體培養(yǎng)（N）,,單倍體植株（N）,,秋水仙素處理，使染色體翻倍,,植株（2N）,特點：1 明顯縮短育種年限,2 后代植株都為純合子。,正常植株（2N）,,4,課題背景,5,,,花絲,花藥：囊狀結構，內有很多花粉,（一）被子植物的花粉發(fā)育,1 雄蕊,一、基礎知識,2 花粉的概念:由花粉母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成的單倍體的生殖細胞.,6,花粉發(fā)育過程,7,,,花粉母細胞 （小孢子母細胞）,,4個小孢子,減數(shù)分裂,,小孢子四分體,,1個小 孢子,,（單細胞花粉粒）,,,花粉粒 （雙核）,有絲分裂,單核,雙核,8,小孢子母細胞花粉母細胞,,小孢子,,減數(shù)分裂,有絲分裂,,花粉管細胞核,生殖細胞核,,有分絲裂,精子,,,營養(yǎng)細胞,生殖細胞,,,（小孢子四分體時期,單核居中期,單核靠邊期,,雙核期）,9,小孢子母細胞,小孢子,花粉囊,花藥,花粉粒（雙核期）,成熟花粉,,,10,活動1：閱讀“被子植物的花粉發(fā)育”，回答下列問題：,1．花粉是___倍體的_______細胞. 被子植物的花粉是在 中由 經(jīng)過 分裂形成的。 2．花粉的發(fā)育要經(jīng)歷不同的時期：,減數(shù),單 生殖,,（ ）分裂,（ ）分裂,,,,小孢子母細胞（2n）,（ ）時期（n）,單核（ ）期（n）,雙核期,（ ）細胞核（n）,（ ）細胞核（n）,（ ）細胞（n）,（ ）細胞（n）,（ ）個精子(n),單核（ ）期（n）,,,,,（ ）分裂,,減數(shù),小孢子四分體,靠邊,有絲,居中,生殖,營養(yǎng),花粉管,2,生殖,有絲,花藥 花粉母細胞,11,（二）產生花粉植株的兩種途徑,①,②,移栽,,原因：培養(yǎng)基中的激素種類及濃度配比,12,胚狀體,——在組織培養(yǎng)過程中，某些細胞在形態(tài)上轉變?yōu)榕c合子發(fā)育成的胚非常相似的結構，發(fā)育過程亦與合子胚類似；,神奇的人工種子,13,:通過胚狀體途徑形成小植株,煙草花藥培養(yǎng),胚狀體發(fā)育途徑,,,,14,15,愈傷組織轉接種到再生培養(yǎng)基,愈傷組織分化形成再生植株,水稻花藥培養(yǎng),愈傷組織發(fā)育途徑,部分花藥產生愈傷組織,接種在平板上的水稻花藥,,,,16,不同植物的誘導成功率很不相同，就同一種植物來說親本的生理狀況對誘導成功率也有直接影響。,②選擇合適的花粉發(fā)育時期是提高誘導成功率的重要因素。,因為并不是任何時期的花粉都可以經(jīng)過培養(yǎng)產生愈傷組織或胚狀體，花粉發(fā)育的過程中，只有某一個時期對離體刺激敏感。,①選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關鍵。,三、影響花藥培養(yǎng)的因素,1、材料的選擇：,17,一般來說，在單核期，細胞核由中央移向細胞一側的時期，花藥培養(yǎng)的成功率最高。即：最適合花藥培養(yǎng)的時期為單核靠邊期。,選擇單核期以前的花藥接種，質地幼嫩，極易破碎； 選擇單核期之后的花藥接種，花瓣已有些松動，又給材料的消毒帶來困難，且難以挑選到單核期的花藥。,③花藥培養(yǎng)時期的選擇,④其它時期選擇的缺點,18,為了挑選到單核期的花藥，通常選擇完全未開放的花蕾。盛開的或略微開放的花，都不宜選作實驗材料。,⑥選擇完全未開放花蕾的原因,完全未開放的花蕾，可挑選到單核期的花藥，菌少、易消毒,⑤挑選單核期花藥的方法,19,⑦花藥培養(yǎng)時間,一般月季的花藥培養(yǎng)時間選在5月初到5月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾營養(yǎng)狀態(tài)及生理狀態(tài)會比較好，可提高花粉的誘導成功率。,20,花藥培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基各成分中植物生長調節(jié)劑的水平和配比起決定作用。 ⑴誘導愈傷組織或胚狀體產生的培養(yǎng)基：廣泛使用 2，4-D、IAA； ⑵誘導分化的培養(yǎng)基常除去2，4-D而以IBA代之。 親本植株的生長條件、材料的低溫預處理、接種密度等對誘導成功率都有一定的影響。,2、培養(yǎng)基的組成：,3、其他因素：,21,為什么花瓣松動會給材料的消毒帶來困難？,答：花瓣松動后，微生物就可能侵入到花藥，給材料的消毒帶來困難。,為什么花瓣松動會給材料的消毒帶來困難？,討論：,22,（一）材料選取,2、通過鏡檢來確定是否處于適宜的發(fā)育期。 方法：醋酸洋紅法(將染色體染成紅色) 焙花青-鉻礬法(花粉細胞核染成藍黑色)。,1、從花藥看：月季的初花期 從花粉看：單核期 從花蕾看：完全未開放的,花藥（載玻片上）→1%的醋酸洋紅1滴→用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片→鏡檢（花粉粒的細胞核被染成紅色）,花藥（在卡諾氏固定液中處理20min）→取出，置于載玻片上→焙花青－鉻礬溶液染色→蓋上蓋玻片→鏡檢（花粉粒的細胞核被染成藍黑色）,四、實驗操作,23,（二）材料的消毒,5、無菌水沖洗3～5次 花藥的外面有花萼、花瓣保護，通常處于無菌狀態(tài),1、花蕾用體積分數(shù)為70%的酒精浸泡30秒,2、無菌水清洗,3、無菌吸水紙吸干花蕾表面的水分,4、放入質量分數(shù)為0.1%的氯化汞溶液中2～4分鐘 （質量分數(shù)為1%的次氯酸鈣溶液或飽和漂白粉溶液）,,,,,24,在無菌條件下除去萼片和花瓣用鑷子取出花藥,②要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成。,立即將花藥接種于培養(yǎng)基上，通常每瓶接種花藥7-10個。,1、剝取花藥,①勿損傷花藥，否則接種后容易從受傷部位產生二倍體的愈傷組織。,2、接種,注意：,（三）接種和培養(yǎng),25,①培養(yǎng)條件：溫度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。,3、培養(yǎng),②培養(yǎng)：一般經(jīng)過20-30天培養(yǎng)后，會發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體。 長出愈傷組織則將愈傷組織及時轉移到分化培養(yǎng)基上，以便進一步分化出再生植株。,③注意：如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內就會產生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。,26,在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形成的花粉植株，常常會出現(xiàn)染色體倍性的變化（主要原因是營養(yǎng)細胞核和生殖細胞核融合造成的）。,4、鑒定和篩選,27,四、 結果分析與評價,1、選材是否恰當,選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關鍵。應學會通過顯微鏡觀察處于適宜發(fā)育期的花粉。,2、無菌技術是否過關,如果出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，說明某些操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾消毒或接種等有問題。,3、接種是否成功,如果接種的花藥長出愈傷組織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功了。要適時轉換培養(yǎng)基，以便愈傷組織或胚狀體進一步分化成再生植株。,28,基礎知識,,實驗操作,被子植物的花粉發(fā)育,花粉,,,其他因素,影響因素,花粉發(fā)育經(jīng)歷的時期,,,月季的花藥培養(yǎng),,材料與培養(yǎng)基,材料的選取,,產生途徑,結果分析與評價,消毒,接種和培養(yǎng),課堂小結,29,植物組織培養(yǎng)技術與花藥培養(yǎng)技術的比較,30,自主測評,7．基因型為AaBb的水稻（24條染色體）的花藥通過無菌操作，接入試管后，在一定條件下培養(yǎng)形成試管苗。 （1）愈傷組織是花粉細胞不斷分裂后形成的不規(guī)則的細胞團，愈傷組織形成中，必須從培養(yǎng)基中獲得 、 和小分子有機物等營養(yǎng)物質。 （2）要促進花粉細胞分裂生長，培養(yǎng)基中應有 和 兩種激素。 （3）愈傷組織分化是指愈傷組織形成芽和根，再由芽發(fā)育成葉和莖。這一過程必須給予光照，其原因是 ①_________________ ② 。 （4）試管苗的細胞核中含有 條脫氧核苷酸鏈。 （5）培育成的試管苗可能出現(xiàn)的基因型有 。,水 無機鹽,細胞分裂素,試管苗的生長發(fā)育所需營養(yǎng)來自葉綠體利用光能制造的有機物,24,AB、Ab、aB、ab,生長素,葉綠素的形成需要光,31,下圖是月季花藥離體培養(yǎng)產生花粉植株的兩 種途徑，請據(jù)圖回答有關問題：,課堂練習:,32,(1)選用的材料合適與否是成功誘導出花粉植株的重要因素，一般來說選用 期的花粉可提高成功率。選擇花粉時，一般要通過 來確定花粉是否處于合適的發(fā)育期，這時需要對花粉的細胞核進行染色，常用的染色劑是 。 (2)上圖中花藥經(jīng)脫分化產生胚狀體還是愈傷組織主要取決于培養(yǎng)基中 。 (3)胚狀體與愈傷組織在結構上的主要區(qū)別在于愈傷組織的細胞排列疏松無規(guī)則，是一種高度 的薄壁細胞，胚狀體與 發(fā)育形成的胚有類似的結構，即具有胚芽、胚軸和胚根。 (4)無菌技術也是成功誘導出花粉植株的重要因素，請說明下列各項需要消毒，還需要滅菌。①培養(yǎng)基，②培養(yǎng)皿，③接種環(huán)，④花蕾，⑤實驗操作者的雙手，⑥三角錐形瓶。 (填編號)需要滅菌， (填編號)需要消毒。,單核,鏡檢,醋酸洋紅,激素的種類及其濃度配比,液泡化,受精卵,①②③⑥,④⑤,33,